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Environment

의 분리를위한 최적화 된 농축 기법 doi: 10.3791/52781 Published: April 9, 2015

Introduction

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토양 환경에서 박터 종의 편재는 호스트 박테리아의이 종으로부터 격리 될 수있는 파지의 광대 한 수와 다양성을 제공합니다. Acintobacteriaceae 가족의 세균 회원 아트라진 및 기타 다양한 살충제와 제초제 1,2,3 등의 난 분해성 화합물을 분해 자신의 이화 작용 경로에 가장 주목할 만하다. 대부분의 연구가 박터의 환경 균주를 사용하여 수행 하였지만,이 속에의 임상 분리는 혈액, 소변, 눈, 모든 계통 발생 학적 이질성 (4)를 표시하는 많은 다른 사람의 소스에서 발견된다.

박터 세균에 대한 연구의 다소 광범위한 몸이 있지만, 단지 소수의 연구는 이러한 다양한 속의 구성원을 감염시킬 파아지에보고한다. 흥미롭게도하지만, 박터에 이전 할 작품은 <토양의 입력으로 몇 가지 주요 별개의 주제에 대한 접촉을 파지EM> 박터 종 활성 오니 처리 설비 (6)에 해로운 거품 감소 및 작업 부위 특이 적 재조합 인테그라 7 유전자를 강조 할 목적으로 5 공업용.

다양한 농축 기술 프로토콜 순수한 파지 박터 종에서 분리 생성하는데 이용되어왔다. 초기 절차는 감염 A. 할 수있는 파지 8 일년 이상주는 상승의 기간 동안 니코틴 염과 같은 추가 독성 제와 토양의 배양을 포함 globiformis. 불안정한 유기물 플라크 분석 기술을 통해 검출 된 파지를 생산하기 위해 등장과 함께 흙을 사용하여 수행 할 연구는 긴 잠복기 (8)을 생략하고, 여과 된. 흥미롭게도하지만, 직접 도금을 닮은 기술은 낮은 성공률과 과거의 연구를 인용, 여전히 연구자 (5)에 의해 현저하게 낮은 성공률을하면서 여러 파지에 이르게 된 과거에 사용되었다

전반적으로, 과거에 사용 된 분리 기술은 가장 일반적인 호기성 토양을 나타내는 박터 속에도 불구하고 실제로는 약간의 효과를 갖는 떠들썩했었다 자연 4,9에서 분리, 물과 토양에서 파지를 분리하는 반 Twest 및 Kropinski 10 현재 농축 방법 환경 박테리아 균주 만이 우라늄 농축 기술을 풍부하게하는 데 사용 이전 기술에서 적응은 박터 파지를 분리 비효율적 증명했다. 여기에 설명 된 방법의 목적은 이른 농축 방법은 일관되고 효과적으로 박테리아 속에서 파지를 단리와 연관된 이전의 기술적 과제를 극복 박터 파아지를 분리하도록 채택 될 수 있음 "개념 증명"보여주기위한 것이다.

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Protocol

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파지 격리를위한 Arthobacter 세포의 1. 준비

  • 문화 박터 특검팀. KY3901 식민지 2 ~ 3 일 동안 30 ° C에서 배양 루리아 Bertaini (LB) 한천 플레이트 상에 스트리킹. 식민지를 선택하고 30 ° C에서 225 rpm으로 진탕 배양기에서 당황 문화 플라스크에 LB 배지 250 ml의에 추가하고 부화 멸균 루프를 사용합니다.
  • 성장의 약 24 시간이 파지 감염 실험 후반 초반 / 지수 정지상 세포를 얻을 수 있습니다. 늦은 성장 정지 상태로 들어가는 중간 세포 않도록 밀접 세균 성장​​의 상태를 모니터한다.
    주 : 세포 생장 후술 파지 분리 및 정제 절차 / 단계 0.5 .0.7 사이 광학 밀도 OD (600)로 구성한다.

토양 샘플에서 파지 2. 컬렉션

  1. 원하는 위치에서 토양의 200~400g를 수집합니다. 참고 : Arthroba 세균 이후CTER의 속을 감염 파지가에있는 토양의 대부분의 유형에 만연 될 수있다 그들과 일반적인 토양 박테리아에게 있습니다.
  2. PB가의 있도록 최소 200 ml의 토양에 파지 버퍼 (PB) (68)의 NaCl, 10mM 황산, 10 mM 트리스 - CL (PH 7.5)] 적어도 400 ML을 추가하고 충분히 큰 플라스크에 혼합 상층 액과 추출 할 수있다.
  3. 토양이 일시 중단 될 때까지 부드럽게 교반 또는 소용돌이에 의해 혼합 및 토양 침전물, 일반적으로 30 분을 해결 할 수 있습니다.
  4. 토양 침전물 파편을 제거하기 위해 중력 여과 필터 종이를 통해 "토양 추출물"을 전달합니다.
  5. LB 분말을 추가하고 2 % 용액 (200 ml의 토양 추출물 4g LB 분말)을 만들기 위해 혼합.
  6. 멸균 여과 액을 얻기 위해 진공 여과에 의해 0.22 ㎛의 필터를 통해 용액을 통과. 가능하면, 즉시 2.7 단계로 진행합니다. 가능한 파지 입자의 저장 진행하기 전에 주까지 4 ° C에서 샘플을 필터링 할 필요가있는 경우, 그러나, 수감소 될 것이다.
  7. 나누어지는 다수의 기법을 이용하여 무균 배플 배양 플라스크를 흔들면서 멸균 개별 250 ㎖ 중에 필터 멸균 LB / 토양 추출물 혼합물을 50 ml의 부분. 다른 박터 파지 다른 CaCl2를 조건 하에서 최적의 성장 때문에 원하는 최종 농도 (0-50 mM)을 멸균 2.0 M CaCl2를 솔루션을 추가합니다.
    참고 : 우리는 우리가 확인 된 박터 파지의 대부분이 1 MM-2.5 mM의 염화칼슘 2의 범위 내에있는 것을 찾을 수 있습니다. 그러나, 고립 된 파지 중 일부는 매우 높은 염화칼슘이 농도에서 0 mM의 CaCl2를 불러야에서 독점적으로 우리가 성장했다. 3.1 단계로 바로 진행합니다.

3. 파지 격리

  1. 플라스크에 각각 후반 초반 / 지수 정지상 박테리아 문화의 1-2.5 ML을 추가합니다. 0.5-0.7 OD (600)의 경우, 세포를 1 ㎖를 사용합니다. 0.7의 OD보다 높은 OD (600)의 2.5 mL의 사용세포.
    참고 : 지수 상 성장 세포는 일반적으로 더 파지과 정지상 성장 세포보다 더 높은 역가를 얻을 수 있습니다.
  2. 진탕 배양기에서 약 24 시간 동안 30 ° C에서 250 rpm에서 플라스크를 흔들어.
  3. 24 시간의 잠복기 후 흔들림이 인큐베이터에서 농축 플라스크를 제거하고 농축 샘플을 파지 버퍼에 10 배 희석.
  4. 후반 초반 / 지수 정지상 박테리아 문화의 0.5 ml의 문화 튜브를 설정하고 다양한 농축 문화의 양 문화 튜브에 (PB의 10 -1 희석 500 μL 5 μL)를 추가합니다.
    주 : 각 토양 시료를 농축 한 후에 다른 파지 역가를 생성 이후 농도의 넓은 범위를 테스트하는 것이 바람직하다.
  5. 원래 농축 플라스크의 농도 현재까지 최종 농도가 동일하게 문화 튜브에 염화칼슘 (2)를 추가합니다. w 많은 파지를 위해 선택하는 다른 염화칼슘 2 농도의 범위를 사용하여i 번째 염화칼슘 2 종속성을 변화.
    주 : 대부분의 파지는 1-2.5 mm의 염화칼슘이 범위 내에서 고립되지만 0-50 mM의 염화칼슘이 농도 어디서나 가장 최적의 고립 파지가 있습니다. 이로 인해 그것의 독특한 절연 박터 파지의 수를 최대화하기 위해 CaCl2를 농도의 범위를 확인하는 것이 최상이다.
  6. 문화 튜브에 LB 위로 한천의 4.5 ml의 혼합 및 LB 한천 접시에 부어 준다. 균일하게 접시에 걸쳐 배포하고 약 15 분 동안 응고 최고 한천 수 있도록 부드럽게 소용돌이.
    주 : 한천 큰 일괄 (250 mL) 및 추가 상부 한천 제조 할 수 인기 RT에 저장된 적어도 2 주 동안 후속 실험을 위해 재사용 될 수있다. 상단 한천을 만드는 데 사용 다른 공식이 있지만, 우리는 (LB)와 혼합 한천 7g / L을 사용하여 한천 상단을 60 ° C의 물 중탕에 넣어 상부 한천 실험 과정에서 액체 상태를 유지한다.
  7. 반전 t그는 판과 원하는 온도 48 시간에 (온도 30 ° C) O / N 품어. 현재 파지를 최적화하려면 다음 조건이 다릅니다. 가장 고립 된 파지는 24 시간의 잠복기 후 1-2.5 mM의 염화칼슘이 농도에서 30 ° C에서 배양 접시에서 왔습니다.

4. 살균 정화

  1. 접시에 플라크 형성을위한 24 시간 배양 검사 후. 더 플라크가 분명하지 않는 경우 최대 72 시간 동안 배양을 계속하거나 추가 플라크가 나타납니다 있는지 확인합니다. 일주일에 최대 4 ° C에서 계속 진행하기 전에에 대한 추정 플라크와 저장 판을 필요로합니다.
    참고 : 한 접시에 다른 플라크 형태학의 다양한를 찾는 것은 어려운 일이 아니다. 배양 3 일 후 플라크를 찾는 것은 가능하지만 드문 경우입니다.
  2. 줄무늬 플라크 방법을 사용하여 명확하게 고립 된 플라크에서 원하는 파지를 정화. 멸균 나무 막대기로 감사패를 터치합니다. 행진, 불꽃을 통해 나무 막대기를 실행 allowin에 의한 플라크g 스틱 간략하게 냉각하고, 그림 1과 같이 다음 부드러운 모션 한천 접시에 스틱을 바르고. 각 패스에 대한 깨끗한 스틱을 사용하여이 작업을 반복합니다.
  3. 또한, 개별 파지 플라크를 분리하기 위해 기존의 플라크 역가 분석을 사용합니다. 플라크 역가 분석은 파지 플라크 격리를위한 페트리 접시 등의 LB 한천과 LB 위로 한천 및 재료 등 이상의 시약의 사용을 필요로한다. 우리는 행진 플라크 방법을 사용하여 매우 성공적이었다하지만 플라크 역가 분석을 사용하여 개별 플라크를 분리하는 것이 기술적으로 쉽다.
  4. LB 한천 플레이트를 3 회 이상 스트리킹되면, 추정 된 파지 입자의 낮은 농도를 갖는 영역을 표시하고 부드럽게 상위 판으로서 염화 칼슘의 동일한 농도를 함유하는 (박터 0.5ml의 용융 LB 탑 아가의 4.5 ml의 적용 )과는 접시에 걸쳐 균등하게 할 수 있습니다.
  5. 반전 및 / N을 판 O를 품어. 줄무늬 플라크를 반복순수한 파지 종을 보장하기 위해 적어도 세 번 반복에 대한 기술은 격리됩니다. 파지 생존 능력의 상당한 손실없이 줄무늬 사이에 필요한 주까지로 4 ° C에서 보관 판.
  6. 일단 원하는 플라크가 최종 줄무늬 접시에 성장 고립 된, 마이크로 피펫 팁 하나 잘 격리 된 플라크를 터치하고 100 μL의 PB에 다시 일시 중지합니다. 직렬 신선한 PB 180 μL로 샘플의 20 μl를 전달하여 10-8 희석이 10 0 솔루션을 희석.
  7. 파지를 분리하는데 사용 염화칼슘 (2)의 동일한 농도를 함유 용융 LB 상부 한천 4.5 ml로 감염된 세균을 혼합하여 실온에서 10 분 플레이트 5 배양 관에서 성장 박터 0.5ml를 각 희석액 10 μl를 추가 원래의 토양 샘플에서. 다음 날까지 4 ° C에서 만든 모든 희석을 저장합니다.
  8. 전통적인 플라크 역가 등을 사용하여 웹 패턴을 확인하는 데 필요한 시리얼 희석 된 파지를 결정말한다. 플라크 역가 분석의 목적은 웹 형판을 얻기 위해 필요한 파지 역가를 결정하는 것이다. 등 대부분의 세균없는 아직 파지에 의해 용해되지 않은 세균의 잔해를 포함하는 웹 패턴 플레이트를 확인합니다. 멸균 50 ㎖ 문화 플라스크에 후반 초반 / 지수 고정 박터 문화의 5 ML을 추가합니다.
    1. 문화 플라스크에 희석 (즉 박터 문화에 웹 패턴을 준)의 100 μl를 추가하고 파지는 실온에서 5 ~ 10 분 동안 박테리아 세포를 감염 할 수 있습니다. 처음 파지를 식별하고 10 신선한 LB 플레이트 상에 그 혼합물을 5 mL를 플레이트에 사용 된 염화칼슘 (2)의 동일한 농도를 함유 용융 LB 한천 위쪽으로 섞는다. 응고 및 30 ° C에서 거꾸로 판을 배양 할 수 있습니다.
  9. 다음 날, 4 ° C에서 PB 및 저장 O / N 5 ㎖ 또는 실온에서 4 시간으로 웹 패턴 판을 홍수.
  10. 0.22 μm의 주사기 필터로 파지 해물 필터4 ℃에서 저장한다. 이러한 파아지 입자의 전자 현미경 화상, 표준 절차를 이용하여 DNA를 제한 효소 분석 및 게놈 시퀀싱 파지 게놈 DNA 분리와 같은 추가적인 실험의 마지막 파지 스톡을 사용. 파지 주식의 장기 저장을 위해, -80 ° C에서 재고 보관을위한 작은 튜브에 멸균 글리세롤로 파지 해물의 동일한 금액을 추가합니다.
    참고 :이 파지 기술과 경험하지 않은 사람들을 위해, 훌륭한 자원은 온라인으로 액세스 할 수 www.phagesdb.org 웹 사이트입니다.

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Representative Results

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박터 파지에 대한 개선 농축 기술의 재현성을 입증하기 위해, 30 개 토양 샘플은 고유 박터 파지이 우라늄 농축을 사용하여 수집 한 토양 샘플의 22에서 얻었다이 30 토양 샘플의 2014 년 봄과 여름 동안 서로 다른 시간과 장소에서 사용되었다 절차. 표준 농축 과정은 동일한 토양 시료로부터 3 고유 파지를 수득 하였다. 농축 샘플 플라크 또는 플라크의 성공적인 검출 용 풍부 박터의 더 많은 양을 필요로하는 비교적 낮은 파지 역가를 분리 초기 희석이 필요한 매우 높은 파지 역가를 가질 수있다. 우리는 초기 농축 및 LB 한천에 도금 (그림 2) 후 순수한 파지 인구를 분리하는 플라크 행진 방법을 사용합니다. 대안 적으로, 기존의 표준 플라크 역가 분석은이 방법은 더 많은 시간, 시약 및 물질을 취하더라도 순수 분리 된 파지를 분리하는데 사용될 수있다의. 앞서 언급 한 바와 같이, 우리. 경험적 접시 웨빙 패턴을 형성 파지 역가 번호 및 플라크 형성 단위 (PFUs)의 수를 결정하는 플라크 역가 분석을 사용하여 수행 할도 3을 파지 바나나 용 희석액의 세트를 도시하고 대해 보여 좋은 웹 패턴이 어떻게 보일지를 판 중 하나. 농축 기술을 이용하여 분리 (4) 20 박터 파지의 전자 마이크로 그래픽 이미지를 보여줍니다. 현재 고립 된 25 파지, 그 중 23 다소 긴 꼬리와 siphoviruses입니다. 두 절연 파지 길이 꼬리 마찬가지 헤드 직경 함유 myoviruses이다.

그림 1
개별 파지 플라크의 분리에 사용되는 그림 1. 킬 판 기술 설계도. 노란색 별은 접시에 영역을 나타내는 LB파아지 플라크 스트리킹이 끝나도 가기 한천 플러스 박테리아 용액을 조심스럽게 접시에 붓고한다.

그림 2
그림 세 가지 다른 온도에서 하나의 파지 (딜런)에 대한 플라크의 분리에 사용되는 줄무늬 판 기술 2. 예. 그 딜런 실온에서 유사한 플라크를 생성 파지, 30 ° C, 37 ° C가 있습니다. 판의 두 가지에 빨간 동그라미가 명확하게 고립 된 플라크를 둘러싸고 있습니다.

그림 3
그림 3. 플라크 역가 분석. 박터 파지 바나나 섹션 4.6 프로토콜 텍스트 4.7. 표시됨에 설명 된대로 PB에 희석 한천 플레이트에 도금 시리얼 있었다 (위로부터) T-4 T-8로 순차적으로 희석에게 있습니다. 그 일을 참고전자 T-5 희석 (맨 아래에서) 여전히 남아있는 세균 잔디의 단지 작은 양의 웹 패턴을했다. (T-1 T-3) 낮은 희석액은 세균 성장​​의 결여에 의해 증명 된 파지 입자에 의해 용해 세균 모두 맑은 플레이트를 만들었다.

그림 4
그림 20 박터 파지 4. 전자 마이크로 그래픽 이미지가 농축 기술을 사용하여입니다. 이미지는 FEI 양상의 선상 음영 TEM을 사용하여 촬영 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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많은 이전의 시도는 호스트 박터 감염시킬 파아지를 분리에도 불구하고, 우리는 표준 농축 과정을 사용하여 약간의 성공을 거두었 다. 개발 환경 시료로부터 파지를 풍부하게하고 반 Twest Kropinski (10)에 의해 구성된 박테리아의 농축 방법은 일반화 농축 과정의 대부분 기초 남아있다. 이전의 연구에서 증거가 직접 도금의 방법은 분리 (5)의 매우 낮은 성공률에도 불구하고 박터 균주에 검출 플라크를 생산하는 것이 좋습니다. 직접 도금법으로 파지 파지 버퍼에 토양 시료로부터 추출 및 박테리아 오염을 제거하기 위해 여과된다. 파지 입자를 함유하는 여과 추출물은 숙주 세포의 감염을 허용하도록 원하는 박테리아 숙주에 첨가하고, 박테리아 성장 및 파지 증폭 부가 발사없이 도금된다.

우리의 농축 기술은 강력하고 영업 이익이다박터 특검팀. KY3901에서 박터 파지의 상대적으로 쉽게 격리 timized. 토양 시료에 존재하는 박테리아의 많은 다른 유형과 함께 농축 전통적인 절차, 파지​​, 함께 파지 버퍼 토양으로부터 추출되고 파지 감염에 대한 숙주로서 사용 소망 균체 신선한 성장 배지에 첨가 하였다. 토양이 0.22 μm의 필터를 통해 여과에 의해 파지 샘플을 추출에서 농축 방법으로, 모든 토양 세균이 제거됩니다. 멸균 여과 분해물 함유 파지 입자 아니라 토양 박테리아, 파지 전파 호스트로 사용하여 원하는 박테리아 배 LB 액체 배지에 희석된다. 우리 농축 절차 및 다른 주요 차이점은 농축 배양 기간 동안 숙주 박테리아 성장에 대해 경쟁 NO 오염 토양 박테리아가 없다는 것이다. 유일한 호스트는 토양 감염시킬 수 있습니다 파지 원하는 호스트 박테리아 따라서의를입니다 추출 maximi원하는 호스트 별 파지 숙주 박테리아 및 증폭의 성장성 ZES.

여기에 기재된 절차의 개발에서는 CaCl2를 (11)의 농도 범위를 테스트함으로써 모든 농축 과정에 내재 선택적 바이어스 차지하려고. 어떤 것은 명백 해졌다 일부 파지 균주가 칼슘 이온 농도 및 온도와 같은 파라미터에 의존 생리적 차이를 보여준다는 것이다. 미래 박터 파지 아이솔레이션을 위해 우리는 산도, 온도, 염분, 영양, 최적으로 다양한 환경 조건에서 호스트에서 재생할 수있는 파지를 분리하는 2가 금속 이온 등의 주요 요소를 테스트 할 계획.

우리는 갓이 실험에서 세포 박터 성장 사용합니다. 우리는 우리가 어려운 일에 알려진 파지와 양질의 역가를 파지를 분리 또는 가지고 있었다 때문에 성장의 늦은 고정상에 중간에 도달 세포를 사용하지 않는성장 기간입니다. 기타 성장의 후기 정지상에 미들 균체를 사용하여 파지를 단리 성공의 부족을 설명 할 수있다 정지상 아크 로모 박터 셀 (12)에 파지 감염의 억제를 보여 주었다. 우리 0.9 0.5 00 OD6 어디서나 셀 밀도와 이러한 실험에 성공하여 배양 있었다. 성장한 배양 물을 4 ° C에서 저장하고 최대 7 일 파지 분리를 위해 사용될 수있다. 그러나, 이상 세포로 박터 4 ° C보다 낮은 역가에서 저장 및 감염성 파지 입자의 크기를 파열된다. 유사한 결과가 phageT4 (13)의 감염 대장균을 이용하여 발견되었다. 그들이 원하는 성장 토양 시료로부터 신규 파지를 얻는 기회를 극대화 도달 후 따라서 조속히 균체를 사용.

대체로, LB 미디어와이 농축 기술의 사용을 말하는 것은 거의 없을 것을 증명한다박터 파지의 단리 배타적. LB는 E. 배양을위한 업계 표준이되어 왔지만 콜라이 균주장내 세균의 다른 구성원, 그것은 14 호기 조건에서 다양한 박테리아의 성장을 지원한다. LB 미디어의 영양이 풍부한 성분은 가능성이 파지 발견을 방해에서 기술적 인 문제를 방지하는 호기성 박테리아의 믿을 수 없을만큼 다양한 그룹에서 파지를 전파하기 위해이 방법을 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 프로토콜의 개발을위한 자금 조달은 고등 교육의 남동부 펜실베니아 컨소시엄 Cabrini 대학 과학 학부에 의해 제공되었다. 추가 자금 지원은 아카디아 대학과 Immaculata 대학에서왔다. 우리는 특히 친절하게 우리의 고립 된 파지의 전자 현미경 이미지 촬영을 위해 세인트 조셉 대학에서 박사 카렌 Snetselaar 감사합니다. 추가 지원은 유전체학과 진화 과학 (SEA-파지) 프로그램을 진행하는 하워드 휴즈 의학 연구소 과학 교육 얼라이언스 파지 사냥꾼에 의해 제공되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth powder Fisher BP9722-2 It's best to order these in bulk.
Granulated Agar Fisher BP1423-2 It's best to order these in bulk.
0.22 um syringe filters Fisher 09-719A
0.22 um buchner filters Fisher 430320 More than 50 ml of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.
Eppendorf Tubes Fisher 05-408-129
5 ml pipets individual Fisher 13-678-11D
50 ml conical tubes Fisher 76002844
15 ml conical tubes Fisher 76002845
10 ml pipets individual Fisher 13-676-10J
25 ml pipets individual Fisher 13-676-10K
Whatman qualitative filter paper Fisher 1001-824

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References

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의 분리를위한 최적화 된 농축 기법<em&gt; 박터</em&gt; 박테리오파지 생물 종 토양 샘플에서 격리 된 것
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Cite this Article

Cross, T., Schoff, C., Chudoff, D., Graves, L., Broomell, H., Terry, K., Farina, J., Correa, A., Shade, D., Dunbar, D. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (98), e52781, doi:10.3791/52781 (2015).More

Cross, T., Schoff, C., Chudoff, D., Graves, L., Broomell, H., Terry, K., Farina, J., Correa, A., Shade, D., Dunbar, D. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (98), e52781, doi:10.3791/52781 (2015).

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