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Uma técnica de enriquecimento Aperfeiçoado para o isolamento de doi: 10.3791/52781 Published: April 9, 2015

Introduction

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A onipresença de espécies Arthrobacter em ambientes de solo oferece um vasto número e diversidade de fagos capazes de serem isolados nessa espécie de bactérias hospedeiras. Bacterianas membros da família Acintobacteriaceae são o mais notável para suas vias catabólicas de degradar compostos recalcitrantes como atrazina e vários outros pesticidas e herbicidas 1,2,3. Embora a maioria das pesquisas tem sido feito utilizando estirpes ambientais de Arthrobacter, isolados clínicos deste gênero é encontrado no sangue, urina, olhos, e muitas outras fontes humanas todos exibindo heterogeneidade filogenética 4.

Enquanto não há um corpo bastante extensa pesquisa sobre bactérias Arthrobacter, apenas alguns estudos relatam sobre os fagos capazes de infectar membros deste gênero diverso. Curiosamente, porém, o trabalho feito anteriormente em Arthrobacter fagos toques sobre diversos temas distintos-chave, tais como a digitação de solo <em> espécies Arthrobacter 5, usos industriais, com o objetivo de reduzir espuma deletéria em estações de tratamento de lamas activadas 6, e destacando o trabalho de recombinação sítio específico e genes integrase 7.

Vários protocolos técnica de enriquecimento têm sido empregadas para gerar pura fago isolados em espécies Arthrobacter. Procedimentos iniciais incluem incubações de solo com agentes tóxicos adicionais como sais de nicotina por períodos de mais de um ano 8 dando origem a fagos capazes de infectar apenas A. globiformis. Estudos feitos usando solo percolados com orgânicos instáveis ​​apareceu para produzir fagos detectáveis ​​através de técnicas de ensaio de placa, omitindo períodos de incubação longos 8. Curiosamente, porém, uma técnica parecida com semeadura direta foi utilizado no passado dando origem a vários fagos enquanto continua a ter uma baixa taxa de sucesso nomeadamente pelos investigadores 5, citando estudos anteriores com baixas taxas de sucesso

No geral, as técnicas de isolamento usados ​​no passado eram notável por ter pouca eficácia na prática, apesar das género Arthrobacter representativas do solo aeróbico mais comum isolar na natureza 4,9,, Van Twest e Kropinski 10 atuais métodos de enriquecimento para isolamento de fagos a partir da água e do solo adaptado a partir de técnicas anteriores utilizadas para enriquecer isolados bacterianos ambientais, mas estas técnicas de enriquecimento se mostrou ineficiente para isolar fagos Arthrobacter. O objectivo do método descrito aqui é mostrar "prova de conceito" que os métodos de enriquecimento precoces podem ser adaptados de forma consistente e eficaz isolar fagos Arthrobacter, ultrapassar os desafios técnicos anteriores, associados com o isolamento de fagos a partir deste género bacteriano.

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Protocol

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1. Preparação de células Arthobacter para Fago Isolation

  • Cultura de Arthrobacter sp. KY3901 colónias riscadas em um Bertaini Luria (LB) agar placa incubada a 30 ° C durante 2-3 dias. Escolha uma colónia e usar uma ansa estéril para adicioná-lo a 250 ml de caldo LB num frasco de cultura com chicanas e incubar numa incubadora com agitação a 225 rpm a 30 ° C.
  • Reserve em torno de 24 horas de crescimento para obter células estacionárias exponenciais / início de final de fase para experimentos de infecção fago. Monitorar o estado de crescimento bacteriano de perto para evitar que as células de entrar no meio para o final estado estacionário de crescimento.
    NOTA: O crescimento celular deve consistir de uma densidade óptica OD 600 entre 0,5-.0.7 para os procedimentos de isolamento e purificação de fago / passos descritos abaixo.

2. Recolha de Fago de amostras de solo

  1. Reúna 200-400 g de solo do local desejado. Nota: Uma vez que as bactérias no ArthrobaCTER género são bactérias comuns do solo e que os fagos que eles infectam pode ser encontrado em e são difundidas na maior parte dos tipos de solo.
  2. Adicionar, pelo menos, 400 ml de tampão de fagos (PB) [NaCl 68 mM, 10 mM de MgSO 4, 10 mM de Tris-Cl (pH 7,5)] para o solo e misturar num frasco grande o suficiente para que, pelo menos, 200 ml de PB é no sobrenadante e é capaz de ser extraído.
  3. Misture por agitação ou rodando suavemente até que o solo está suspenso e permitir que os sedimentos do solo para resolver, tipicamente 30 min.
  4. Passe o "extrato de solo" por papel de filtro por filtração por gravidade para remover os restos de sedimentos do solo.
  5. Adicionar LB pó e misturar para fazer uma solução a 2% (4 g LB pó em 200 ml de extracto de solo).
  6. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 um por filtração em vácuo para se obter um filtrado estéril. Se possível, continue no passo 2.7 imediatamente. Caso seja necessário, armazenar as amostras filtradas a 4 ° C durante até uma semana antes de continuar, no entanto, o número de partículas fágicas viáveisserá reduzido.
  7. Múltipla alíquota de 50 ml da mistura de extrato de LB / solo esterilizado por filtração em individuais de 250 ml esterilizadas tremendo frascos de cultura perplexos usando técnicas assépticas. Adicionar estéril M de CaCl2 solução 2,0 para as concentrações finais pretendidas (0-50 mM) uma vez que diferentes fagos de Arthrobacter crescem optimamente sob diferentes condições de CaCl 2.
    NOTA: Descobrimos que a maioria dos fagos Arthrobacter identificados por nós estão dentro da gama de 1 mM-2,5 mM de CaCl2. No entanto, vários dos fagos isolados cresceram nos exclusivamente a 0 mM CaCl2 .ou a concentrações muito elevadas de CaCl 2. Prossiga imediatamente para a etapa 3.1.

3. Fago Isolation

  1. Adicionar 1 a 2,5 ml de exponencial tardia / estacionária antecipada bactérias em fase de cultura para cada um dos frascos. Para uma DO600 0,5-0,7, utilizar 1 ml de células. Para uma DO600 superior a uma DO de 0,7 2,5 ml de usarcélulas.
    NOTA: As células em fase de crescimento exponencial normalmente produzem mais fagos e títulos mais elevados do que as células em crescimento fase estacionária.
  2. Frascos de agitação a 250 rpm a 30 ° C durante aproximadamente 24 horas numa incubadora com agitação.
  3. Após um período de incubação de 24 h remover frascos de enriquecimento da incubadora com agitação e diluir as amostras de enriquecimento de dez vezes em tampão de fago.
  4. Configure tubos de cultura com 0,5 ml de tarde exponencial / início de bactérias em fase estacionária cultura e adicionar várias quantidades de a cultura de enriquecimento (5 mL a 500 mL de uma diluição 10 -1 em PB) para os tubos de cultura.
    NOTA: É aconselhável testar uma ampla gama de concentrações uma vez que cada amostra de solo gera diferentes títulos de fagos após enriquecimento.
  5. Adicionar CaCl2 para tubos de cultura para obter uma concentração final igual à concentração presente no frasco de enriquecimento inicial. Use uma variedade de diferentes concentrações de CaCl 2 para selecionar para muitos fagos wom variando CaCl 2 dependências.
    NOTA: A maioria dos fagos será isolado dentro do CaCl2 gama de 1-2,5 mM mas há fagos isolados mais de forma ideal em qualquer lugar 0-50 mM de CaCl2 concentrações. Por isso, o melhor é verificar uma série de CaCl 2 concentrações de maximizar o número de Arthrobacter fagos únicas isoladas.
  6. Misturar 4,5 ml de LB agar superior no tubo de cultura e despeje a mistura em uma placa de ágar LB. Agitar suavemente o frasco para distribuir uniformemente ao longo da placa e para permitir agar de topo solidificar durante aproximadamente 15 minutos.
    NOTA: Topo de agar podem ser preparadas em lotes maiores (250 ml) e agar de topo extra pode ser armazenado à temperatura ambiente e reutilizado para as experiências subsequentes, durante pelo menos duas semanas. Embora existam diferentes fórmulas utilizadas para fazer agar top, fazemos top agar usando 7g / L de agar misturado com LB. Ponto de agar de topo num banho de água a 60 ° C para manter o estado líquido durante o decurso de uma experiência.
  7. Inverter tele placa e incubar a temperatura desejada (temperatura de 30 ° C) O / N a 48 h. Alterar estas condições para otimizar os fagos presentes. Mais fagos isolados provenientes de placas incubadas a 30 ° C a 1-2,5 mM de CaCl 2 a concentração após um período de incubação de 24 horas.

4. Fago Purificação

  1. Após uma incubação de 24 horas de verificação para a formação de placas em placas. Continue incubação por até 72 horas, se não há placas são evidentes ou para determinar se as placas adicionais aparecerão. Se necessário, as placas de loja com placas putativas de até uma semana a 4 ° C antes de prosseguir.
    NOTA: Não é raro encontrar uma variedade de diferentes morfologias de placa em um prato. Encontrar placas após 3 dias de incubação, é possível, mas raro.
  2. Purificar fagos desejados de placas claramente isolado utilizando o método raia placa. Toque em uma placa com uma vara de madeira estéril. Streak a placa executando uma vara de madeira através de uma chama, allowing o pau para esfriar brevemente, e, em seguida, esfregando o pau na placa de agar no movimento suave, como mostrado na Figura 1. Repita esta usando uma vara limpa para cada passagem.
  3. Em alternativa, usar o ensaio de título de placa tradicional para isolar placas de fagos individuais. O ensaio de titulação da placa requer a utilização de mais reagentes, tais como agar LB e agar de topo LB e materiais, tais como placas de petri para o isolamento do fago de placa. Temos sido muito bem sucedida usando o método raia placa, mas é tecnicamente mais fácil isolar placas individuais utilizando o ensaio título placa.
  4. Uma vez que a placa de agar LB é riscada pelo menos três vezes, marcar a área com a menor concentração de partículas fágicas putativas e suavemente aplicar 0,5 ml de Arthrobacter e 4,5 ml de agar de topo LB fundida (contendo a mesma concentração de cloreto de cálcio, tal como a placa-mãe ) e deixe-a espalhar uniformemente ao longo da placa.
  5. Inverter e incubar placa O / N. Repita a placa raiatécnica para, pelo menos, três iterações para garantir uma espécie de fagos puros é isolado. Armazenar as placas a 4 ° C durante até uma semana, conforme necessário entre estrias, sem perda significativa da viabilidade do fago.
  6. Uma vez que as placas desejadas tenham sido cultivadas e isolado na placa raia final, toque em uma placa bem isolado com uma ponta de micropipeta e suspender novamente em 100 PB ul. Serialmente dilua esta solução a 10 0 para a diluição de 10 -8, passando 20 ul da amostra em 180 ul de PB fresco.
  7. Adicionam-se 10 ul de cada diluição de 0,5 ml de Arthrobacter crescido num tubo de cultura para 5 a 10 minutos à temperatura ambiente e placa misturando as bactérias infectadas com 4,5 ml de agar de topo LB fundida contendo a mesma concentração de CaCl2 utilizada para isolar o fago a partir da amostra original do solo. Salve todas as diluições feitas a 4 ° C até o dia seguinte.
  8. Determinar a diluição em série fago necessária para fazer um teste padrão da web usando o título de placa tradicional comodizer. O objectivo do ensaio de titulação de placa é determinar o título de fago necessária para obter uma placa padrão de teia. Identificar uma placa padrão de teia como na maior parte isenta de bactérias, mas que contém vestígios de bactérias que ainda não tenham sido submetidas a lise por fagos. Adicionar 5 ml de tarde exponencial / início de cultura Arthrobacter estacionário a um frasco estéril cultura de 50 ml.
    1. Adicionar 100 ul da diluição (que deu um padrão de teia para a cultura de Arthrobacter) no frasco de cultura e permitir que os fagos para infectar as células de bactérias por 5 a 10 min a RT. Misturar com fundido de topo LB agar contendo a mesma concentração de CaCl 2 como inicialmente utilizados para identificar o fago e placa 5 ml desta mistura sobre 10 placas de LB fresco. Deixa-se solidificar e incubar as placas invertidas a 30 ° C.
  9. No dia seguinte, inundar as placas em forma de rede com 5 ml de PB e armazenamento de O / N a 4 ° C ou 4 horas à temperatura ambiente.
  10. Filtra-se o lisado de fago através de um filtro de seringa de 0,22? Me armazenar a 4 ° C. Use este inventário final fago para experiências adicionais, tais como imagens de microscopia electrónica de partículas de fago, o fago de isolamento de ADN genómico para análise de enzimas de restrição e sequenciação de DNA genómico usando procedimentos padrão. Para armazenamento a longo prazo do stock de fagos, adicionar uma quantidade igual de lisato de fago de glicerol estéril em frascos pequenos para arquivamento estoque a -80 ° C.
    NOTA: Para aqueles que não experimentaram com estas técnicas de fagos, um grande recurso é o site www.phagesdb.org acessível online.

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Representative Results

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Para demonstrar reprodutibilidade da melhoria técnica de enriquecimento de fagos Arthrobacter, 30 amostras de solo diferentes foram usados ​​em diferentes momentos e locais durante a primavera eo verão de 2014. Destes 30 amostras de solo fagos Arthrobacter originais foram obtidos a partir de 22 de amostras de solo coletadas usando este enriquecimento procedimento. O processo de enriquecimento de fagos padrão originou únicas de 3 das mesmas amostras de solo. As amostras de enriquecimento podem ter um título muito elevado de fagos que necessitam de diluição inicial para isolar placas ou um título relativamente baixo do fago requerendo um maior volume de Arthrobacter enriquecido para detecção com sucesso de placas. Usamos o método raia placa para isolar populações de fagos puros após enriquecimento e plaqueamento inicial em placas de agar LB (Figura 2). Alternativamente, um ensaio de titulação padrão tradicional de placas pode ser usado para isolar um isolado de fago puro embora este método leva mais tempo, reagentes e materiaiss. Como mencionado anteriormente, nós usamos o ensaio título de placa para determinar empiricamente números de título de fagos e o número de unidades formadoras de placas (PFUs) para formar um padrão de correias em um prato. A Figura 3 mostra um conjunto de diluições em série para fago Banana e demonstra para uma das placas que um bom padrão de web deve ser parecida. A Figura 4 mostra imagens microscópicas de elétrons de 20 fagos Arthrobacter isoladas usando a técnica de enriquecimento. Dos 25 fagos atualmente isoladas, 23 deles são siphoviruses com caudas bastante longos. Dois dos fagos isolados são myoviruses contendo diâmetros de cabeça semelhantes em comprimento para que as suas caudas.

Figura 1
Figura 1. Streak técnica de placa esquemático utilizado para o isolamento de placas de fagos individuais. A estrela amarela representa a área em que a placa da LBagar de topo e solução bactérias devem ser cuidadosamente vertida para a placa após a formação de estrias de fago de placa tenha sido concluída.

Figura 2
Figura 2. Exemplos da técnica de placa raia utilizado para o isolamento de placas para um fago (Dylan) a três temperaturas diferentes. Note-se que o fago Dylan produz placas semelhantes à temperatura ambiente, 30 ° C e 37 ° C. Os círculos vermelhos em duas das placas de cercar placas claramente isolados.

Figura 3
Figura 3. ensaio título Plaque. Arthrobacter fago Banana era de série diluída em PB e semeadas em placas de ágar conforme descrito nas seções 4.6 e 4.7 do Protocolo de texto. Mostrado são diluições em série T-4 e T-8 (a partir do topo). Note-se que the T-5 de diluição (de baixo para cima) deu um padrão web com apenas uma pequena quantidade do gramado bacteriana ainda restante. Diluições em série inferiores (t-t-1 a 3) criado placas claras com todas as bactérias lisadas por partículas fágicas demonstrado pela ausência de qualquer crescimento bacteriano.

Figura 4
Figura 4. Electron imagens microscópicas de 20 fagos Arthrobacter isolado utilizando a técnica de enriquecimento. As imagens foram feitas usando uma FEI Morgagni TEM. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Apesar de muitas tentativas anteriores para isolar fagos capazes de infectar hospedeiros Arthrobacter, tivemos pouco sucesso utilizando procedimentos de enriquecimento padrão. O método de enriquecimento bacteriana generalizada desenvolvido e adaptado por van Twest e Kropinski 10 para enriquecer os fagos a partir de amostras ambientais continuam a base para a maioria dos procedimentos de enriquecimento. Evidências de estudos anteriores sugerem que métodos de plaqueamento direto produziram placas detectáveis ​​sobre cepas de Arthrobacter embora com taxas muito baixas de sucesso de isolamento 5. Com o método de plaqueamento directo, os fagos são extraídos a partir de amostras de solo em um tampão de fago e filtrou-se para remover as bactérias contaminantes. O extracto filtrado contendo partículas de fago são adicionados ao hospedeiro bactérias desejado para permitir a infecção das células hospedeiras e plaqueadas sem ciclos adicionais de crescimento de bactérias e a amplificação de fagos.

Nossa técnica de enriquecimento é robusto e optimized para o isolamento relativamente fácil de fagos de Arthrobacter de Arthrobacter sp. KY3901. Com procedimentos de enriquecimento tradicionais, fagos, juntamente com muitos tipos diferentes de bactérias presentes nas amostras de solo, são extraídos a partir do solo em tampão de fago e adicionado ao meio de crescimento fresco com células bacterianas desejadas utilizadas como hospedeiro para a infecção por fagos. Com o método de enriquecimento, todas as bactérias do solo são removidas do solo extraída amostras de fagos por filtração através de um filtro de 0,22 uM. Os estéreis ligado contendo partículas de fago filtradas, mas não as bactérias do solo, são diluídos em caldo LB 2x com que as bactérias desejáveis ​​utilizados como o anfitrião propagação fago. A principal diferença entre o nosso processo de enriquecimento e os outros é que não há contaminantes bactérias do solo concorrentes para o crescimento com a bactéria hospedeira durante o período de tempo de enriquecimento de incubação. O único hospedeiro do solo extraída em fagos pode infectar é o das bactérias hospedeiras desejadas e, portanto, MaximiZES o potencial de crescimento das bactérias hospedeiras e amplificação dos fagos específicos do hospedeiro desejados.

No desenvolvimento do processo descrito aqui que tentaram representam polarização selectiva inerente a qualquer processo de enriquecimento, testando uma gama de concentrações de CaCl 2 11. O que ficou evidente é que alguns isolados de fagos mostrar diferenças fisiológicas dependentes de parâmetros como a concentração de íons de cálcio e temperatura. Para futuras isolamentos Arthrobacter fagos planejamos testar fatores-chave, tais como como pH, temperatura, salinidade, nutrientes, íons metálicos bivalentes para isolar fagos capazes de reproduzir em seus hospedeiros de forma otimizada sob várias condições ambientais.

Nós usamos recentemente crescido Arthrobacter células nesta experiência. Nós não usamos células que atingem meio a fase estacionária tardia de crescimento, uma vez que têm tido dificuldade em isolar fago ou ter títulos decentes com fagos conhecidas no thé o período de crescimento. Outros estudos mostram uma inibição da infecção pelo fago na fase estacionária de células Achromobacter 12 o que pode explicar a falta de sucesso de isolamento de fagos utilizando as células bacterianas em meio até à fase estacionária tardia do crescimento. Temos tido sucesso usando culturas para estes experimentos com uma densidade celular em qualquer lugar de uma OD6 00 de 0,5 a 0.9. Culturas cultivadas são armazenadas a 4 ° C e pode ser utilizado para o isolamento de fagos até sete dias. No entanto, quanto mais tempo as células Arthrobacter são armazenadas a 4 ° C, o mais baixo o título e rebentar o tamanho de partículas fágicas infecciosas. Resultados semelhantes foram encontrados com o uso de Escherichia coli para a contaminação de phageT4 13. Portanto, utilizando células bacterianas, logo que possível depois de atingirem o desejado crescimento maximiza a probabilidade de obtenção de um novo fagos a partir de uma amostra de solo.

Em termos gerais, a utilização desta técnica de enriquecimento com meio LB deve provar ser dificilmenteexclusivo para o isolamento de fagos de Arthrobacter. Enquanto LB tem sido o padrão da indústria para a cultura de E. estirpes de E. coli e de outros membros da família Enterobacteriaceae, que suporta o crescimento de uma ampla variedade de bactérias, em condições aeróbicas 14. A composição rica em nutrientes do meio LB pode provavelmente ser utilizada neste método de propagar fagos em um grupo extremamente diversificado de bactérias aeróbias que impedem desafios técnicos de impedir a descoberta de fago.

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Disclosures

Os autores declaram não há interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

O financiamento para o desenvolvimento deste protocolo foi fornecido pela Pennsylvania Consortium Sudeste do Ensino Superior e do Departamento de Ciência Cabrini College. Financiamento e apoio adicional veio da Universidade de Arcadia e Universidade Imaculada. Agradecemos especialmente ao Dr. Karen Snetselaar em St. Joseph Universidade para gentilmente tomando as imagens microscópicas de elétrons dos nossos fagos isoladas. Apoio adicional foi fornecido pelos Hunters Instituto Médico Howard Hughes Educação Ciência Alliance fagos Avançando Genomics e Evolutiva Ciência programa (SEA-fagos).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth powder Fisher BP9722-2 It's best to order these in bulk.
Granulated Agar Fisher BP1423-2 It's best to order these in bulk.
0.22 um syringe filters Fisher 09-719A
0.22 um buchner filters Fisher 430320 More than 50 ml of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.
Eppendorf Tubes Fisher 05-408-129
5 ml pipets individual Fisher 13-678-11D
50 ml conical tubes Fisher 76002844
15 ml conical tubes Fisher 76002845
10 ml pipets individual Fisher 13-676-10J
25 ml pipets individual Fisher 13-676-10K
Whatman qualitative filter paper Fisher 1001-824

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References

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Uma técnica de enriquecimento Aperfeiçoado para o isolamento de<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Bacteriophage Espécie de amostra de solo Isolados
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Cite this Article

Cross, T., Schoff, C., Chudoff, D., Graves, L., Broomell, H., Terry, K., Farina, J., Correa, A., Shade, D., Dunbar, D. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (98), e52781, doi:10.3791/52781 (2015).More

Cross, T., Schoff, C., Chudoff, D., Graves, L., Broomell, H., Terry, K., Farina, J., Correa, A., Shade, D., Dunbar, D. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (98), e52781, doi:10.3791/52781 (2015).

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