Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Yalıtım için bir optimize Zenginleştirme Tekniği doi: 10.3791/52781 Published: April 9, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Toprak ortamlarında Arthrobacter türlerinin yaygınlığı konak bakteri bu türün izole edilebilen fajların geniş bir dizi ve çeşitlilik sunuyor. Acintobacteriaceae ailesinin Bakteriyel üyeleri atrazin ve diğer çeşitli pestisitler ve herbisitler 1,2,3 gibi inatçı bileşiklerin aşağılayıcı onların katabolik yollar için en önemli olan. Çoğu araştırma Arthrobacter çevresel suşları kullanılarak yapılmıştır olsa, bu cinsin klinik izolatları kan, idrar, göz, ve tüm filogenetik heterojeniteye 4 görüntülendiği diğer birçok insan kaynaklar bulunur.

Arthrobacter bakteriler üzerine bir araştırma oldukça geniş gövde varken, sadece bir kaç çalışmalar bu farklı cinsin üyelerine enfekte edebilen fajlarla rapor. İlginçtir ama, Arthrobacter daha önce yapılan çalışmalar <tür toprak yazarak gibi çeşitli anahtar farklı konularda dokunur Enterobacteria fajıem> Arthrobacter türleri aktif çamur arıtma tesislerinde 6 zararlı köpük azaltılması, ve şantiye özgü rekombinasyon ve integraz genleri 7 vurgulayarak amacıyla 5, endüstriyel kullanımlar.

Çeşitli zenginleştirme tekniği protokolleri saf faj Arthrobacter türlerinde izolatlarının oluşturmak için istihdam edilmiştir. Erken prosedürler sadece enfekte A. yeteneğine fajlarla 8 yıl bir aşkın veren yükseliş dönemleri için nikotin tuzları gibi ilave toksik ajanlar ile toprak inkubasyon dahil globiformis. Kararsız organik plak tahlil teknikleri ile tespit fajları üretmek için ortaya ile toprak kullanılarak yapılan çalışmalar uzun kuluçka dönemleri 8 atlayarak, percolated. İlginçtir ama, direkt kaplama benzeyen bir teknik düşük başarı oranları ile geçmiş çalışmaları gerekçe, hala araştırmacılar 5 tarafından özellikle düşük başarı oranına sahip olurken birkaç fajlarla sebebiyet veren geçmişte kullanılan

Genel olarak, geçmişte kullanılan izolasyon teknikleri, en sık aerobik toprak temsil Arthrobacter cins rağmen pratikte çok az etkinlik olması için önemli olan doğada 4,9 yılında izole, su ve topraktan fajları izole Van Twest ve Kropinski 10 mevcut zenginleştirme yöntemleri Çevre bakteriyel izolatları ancak bu zenginleştirme teknikleri zenginleştirmek için kullanılan teknikler daha önceki adapte Arthrobacter fajları izole verimsiz kanıtladı. Burada anlatılan yöntemin amacı, erken zenginleştirme yöntemleri tutarlı ve etkin bir şekilde bu bakteriyel cinsten fajları izole ilişkili önceki teknik zorlukların üstesinden, Arthrobacter fajları izole adapte edilebilir "kavramının kanıtı" göstermektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Faj İzolasyon için Arthobacter Hücreler 1. Hazırlık

  • Kültür Arthrobacter sp. KY3901 koloni 2-3 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edilen Luria Bertaini (LB) agar plaka üzerinde çizgi şeklinde. Bir koloni seçin ve 30 ° C'de 225 rpm'de bir çalkalama inkübatöründe saptırma plakalı bir kültür şişesi içinde LB suyu 250 ml eklemek ve inkübe etmek için steril bir döngü kullanılır.
  • Büyüme yaklaşık 24 saat faj enfeksiyonu deneyler için geç / erken üstel sabit faz hücreleri elde etmek izin verin. Geç sabit büyüme durumuna orta girmesini engellemek hücreleri yakından bakteriyel büyüme durumunu izleyin.
    Not: Hücre büyümesi, aşağıda tarif edilen faj izolasyon ve saflaştırma prosedürleri / aşamada 0.5-.0.7 arasında bir optik yoğunluk OD 600 arasında olmalıdır.

Toprak Örneklerinden Faj 2. Koleksiyonu

  1. İstediğiniz yerden toprak 200-400 gr toplayın. Not: Arthroba bakteri yanacter cins onları enfekte fajlar bulunan ve toprak birçoğuna yaygın olan olabilir bunlar ve ortak toprak bakterilere vardır.
  2. PB değildir, böylece, en azından 200 ml toprağa faj Tamponu (PB): [68 mM NaCI, 10 mM MgSO 4 ile, 10 mM Tris-CI (pH 7.5)], en az 400 ml ilave edilir ve yeterince büyük bir şişe içinde karıştırın Üstte kalan sıvı kısımdaki ve ekstre edilmesi mümkündür.
  3. Toprak askıya kadar yavaşça karıştırarak veya dönen karıştırın ve toprak sediment, tipik olarak 30 dakika yerleşmek için izin verir.
  4. Toprak sediment enkaz kaldırmak için yerçekimi filtrasyon ile filtre kağıdı ile "toprak özü" geçirin.
  5. LB tozu eklenir ve bir% 2 solüsyon (200 mi toprak özü 4 gr LB toz) yapmak için karıştırın.
  6. Steril bir süzüntü elde etmek için vakum filtrasyonu ile 0.22 um filtre içinden solüsyonu geçirir. Mümkünse, hemen 2.7 adıma devam. Uygun bir faj partiküllerinin, mağaza devam etmeden önce bir hafta kadar 4 ° C 'de numuneler, süzüldü olması gereken, ancak, sayıazalacaktır.
  7. Kısım birden fazla aseptik teknikler kullanılarak bölmeli kültür şişeleri çalkalama sterilize ayrı 250 ml'lik filtre ile sterilize edilmiş LB / kir özü karışımı, 50 ml bölümleri. Farklı Arthrobacter fajlar farklı CaCl2 koşullar altında en iyi şekilde büyür beri istenen nihai konsantrasyonlarda (0-50 mM), steril 2.0 M CaCl2 çözeltisi ekleyin.
    NOT: Biz, bize tarafından tanımlanan Arthrobacter fajların çoğunluğu 1 mM-2.5 mM CaCl2 aralığında olduğunu bulmak. Ancak, izole fajların birkaç çok yüksek CaCl2 konsantrasyonlarda 0 mM CaCl2 .ya münhasıran bizim büyüdü. 3.1 adıma hemen geçin.

3. Faj İzolasyonu

  1. Şişesinden her geç / erken üslü durağan faz bakteri kültürü 1-2,5 ml ilave edilir. 0,5-0,7 bir OD 600 için, hücreler 1 ml kullanılır. 0.7 OD 'den daha yüksek bir OD 600 için 2.5 ml kullanmakHücreler.
    Not: üslü büyüme fazında hücreler, tipik olarak daha fazla bağlanma fajlarından durağan fazı büyümesinde hücrelerden daha yüksek titrelerini üretmek.
  2. Bir çalkalama inkübatör içinde yaklaşık 24 saat süreyle 30 ° C'de 250 rpm'de çalkalama.
  3. 24 saatlik bir kuluçka süresinden sonra çalkalama inkübatör zenginleştirme şişeler çıkarın ve zenginleştirme numuneleri faj tamponu içinde on kat seyreltilir.
  4. Geç / erken üslü durağan faz bakteri kültürü 0.5 ml kültür tüpleri kurmak ve çeşitli zenginleştirme kültür miktarda kültür tüplerine (PB 10 -1 konsantrasyondan 500 ul 5 ul) ilave edin.
    NOT: Her toprak örneği zenginleştirme sonra farklı faj titreleri üretir beri konsantrasyonlarının geniş bir yelpazede test etmek önerilir.
  5. Orijinal zenginleştirme şişede konsantrasyonu mevcut bir nihai konsantrasyon eşit hale getirmek için, kültür tüplerine CaCl2 ekleyin. W çok faj seçmek için farklı CaCl2 bir konsantrasyonu kullanaraki CaCl2 bağımlılıkları değişen.
    NOT: Çoğu fajlar 1-2.5 mM CaCl2 aralığında izole edilecektir, ancak 0-50 mM CaCl2 konsantrasyonları her yerde en iyi şekilde izole fajlar vardır. Bu nedenle bu eşsiz izole Arthrobacter fajların sayısını arttırmak için CaCl2 konsantrasyonlarının bir dizi kontrol etmek en iyisidir.
  6. Kültür tüpü içinde LB üst agar 4,5 ml karıştırın ve LB agar plakası üzerine dökün. Eşit plaka üzerinde dağıtılması ve yaklaşık 15 dakika boyunca katılaşması üst agar sağlamak için hafifçe karıştırılır.
    Not: Agar büyük gruplar (250 mi) ve ilave üst agar hazırlanabilir en oda sıcaklığında depolanır ve en az iki hafta, daha sonraki deneyler için yeniden kullanılabilir. Üst ağarı yapmak için kullanılan çeşitli formüller vardır, ancak biz LB ile karıştırılır agar 7 gr / L kullanılan agar üst yapmak Bir 60 ° C su banyosu içinde yer üst agar bir deney sırasında, sıvı durumunu korumak için.
  7. Haricindekileri to plaka ve istenilen sıcaklıkta 48 saat için (sıcaklık 30 ° C) göre O / N inkübe edin. Mevcut fajlarla için optimize etmek bu koşullar Vary. En çok izole fajlar 24 saatlik bir kuluçka döneminden sonra 1-2.5 mM CaCl2 konsantrasyonunda 30 ° C 'de kuluçkaya yatırılmıştır gelir.

4. Faj Arıtma

  1. Plakalar üzerinde plak oluşumu için 24 saat inkübasyon kontrolünden sonra. Hiçbir plaklar belirgin eğer kadar 72 saat inkübasyon devam veya ek plaklar görünüp görünmeyeceğini belirlemek için. Bir haftaya kadar 4 ° C'de önce usul için varsayılan plaklarla, mağaza plakaları Gerekirse.
    NOT: Bu bir plaka üzerinde farklı plak morfolojileri çeşitli bulmak için nadir değildir. 3 gün inkübasyondan sonra, plaklar bulmak mümkündür, ancak çok nadirdir.
  2. Çizgi plak yöntemi kullanılarak açık bir şekilde izole plaklardan istenen fajları arındırın. Steril tahta sopa ile bir plaket dokunun. Streak, bir alev ile bir tahta sopa çalışan allowin tarafından plakg sopa kısaca serin ve Şekil 1'de gösterildiği gibi daha sonra yumuşak hareket agar plaka üzerinde sopa ovuşturarak. Her geçişte için temiz bir sopa kullanarak bu işlemi tekrarlayın için.
  3. Seçenek olarak ise, tek tek faj plakları izole edilmesi için geleneksel bir plak titre deneyi kullanmaktadır. Plak titre deneyi, faj plak izolasyonu için Petri plakaları gibi LB agar ve LB üst agar ve malzeme daha fazla reaktifler kullanılmasını gerektirir. Biz çizgi plak yöntemi kullanılarak son derece başarılı olmuştur ama o plak titre testi kullanılarak bireysel plaklar izole etmek teknik olarak daha kolaydır.
  4. LB agar plakası üzerine en az üç kez çizgili sonra, farazi faj partiküllerinin en düşük konsantrasyon alanı işareti ve yavaşça üst levha, kalsiyum klorür, aynı konsantrasyonunu içeren (Arthrobacter, 0.5 ml erimiş LB üst agar 4,5 ml uygulamak ) ve plaka boyunca eşit yaymak için izin verir.
  5. Ters çevirin ve / N plaka O kuluçkaya yatmaktadır. Çizgi plak tekrarlayınsaf faj türü sağlamak üzere en az üç tekrarı için teknik izole edilir. Faj canlılığı kaybı olmadan çizgiler arasında gerekli bir haftaya kadar olduğu gibi 4 ° C'de muhafaza plakalar.
  6. İstenilen plaklar son çizgi plaka üzerinde yetiştirilen ve izole edilmiş, bir mikropipet ucu ile bir iyi izole plak dokunun ve 100 ul PB yeniden askıya. Seri taze PB 180 ul içine numune 20 ul geçerek 10 -8 seyreltme bu 10 0 çözüm sulandırmak.
  7. Faj izole etmek için kullanılan CaCI2 aynı konsantrasyonunu içeren erimiş LB üst agar 4.5 ml ile enfekte bakteri karıştırarak 10 dakika oda sıcaklığında ve plaka 5 için, bir kültür tübü içinde yetiştirilen Arthrobacter 0.5 ml için seyreltilerin her birine, 10 ul ekle Orijinal toprak örneğinden. Ertesi güne kadar 4 ° C 'de yapılan tüm seyreltiler kaydedin.
  8. Geleneksel plak titresi olarak kullanarak bir web desen yapmak için gerekli faj seri seyreltme belirleyinsöylüyorlar. Plak titre Bu analizin amacı bir web model plakası elde etmek üzere gerekli olan, faj titresi belirlemektir. Çoğunlukla bakteri yoksun ancak henüz fajlarla tarafından parçalanır henüz bakteri kalıntıları içeren bir web desen plaka tanımlama. Steril bir 50 ml kültür şişesine geç / erken üslü sabit Arthrobacter kültürünün 5 ml ilave edilir.
    1. Kültür şişesi içinde seyreltilmesi (yani Arthrobacter kültürü için bir web deseni veren) 100 ul ilave edin ve faj, oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca bakteri hücreleri enfekte etmek için izin verir. Başlangıçta faj belirlemek ve 10 taze LB plakaları üzerine Bu karışımın 5 ml levha için kullanılan CaCI2 aynı konsantrasyonunu içeren erimiş LB üst agar ile karıştırılır. Katılaşmaya ve 30 ° C'de ters plakaları inkübe izin verin.
  9. Bir sonraki gün, 4 ° C'de PB ve mağaza O / N, 5 ml ya da oda sıcaklığında 4 saat web model plakalarını sel.
  10. 0.22 um'lik bir şırınga filtreden geçirilmiştir faj lizatı Filtreve 4 ° C'de depolayın. Bu faj partiküllerinin elektron mikroskobu görüntüler, standart prosedürler kullanılarak, DNA kısıtlama enzimi analizi ve genomik dizileme için faj genomik DNA izolasyonu gibi ek deneyler için bu son faj stoku kullanın. Faj stokunun uzun süreli depolama için -80 ° C 'de hazır arşivleme için küçük şişelerde steril gliserol faj lizatının eşit miktarını ekleyin.
    NOT: Bu faj teknikleri ile deneyimli olanlar için büyük bir kaynak çevrimiçi erişilebilir www.phagesdb.org sitesidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Arthrobacter fajlar için geliştirilmiş zenginleştirme tekniği tekrarlanabilirlik göstermek için, 30 farklı toprak örnekleri eşsiz Arthrobacter fajlar, bu zenginleştirme kullanılarak toplanan toprak örneklerinin 22 elde edilen bu 30 toprak örneklerinin Of 2014 yılı ilkbahar ve yaz aylarında farklı zamanlarda ve yerlerde kullanılan prosedür. Standart zenginleştirme işlemi aynı toprak örneklerinin 3 benzersiz fajları vermiştir. Zenginleştirme örnekleri plaklar veya plaklar başarılı bir şekilde saptanması için zenginleştirilmiş Arthrobacter daha büyük bir hacmi gerektiren görece düşük bir faj titresi izole etmek için ilk seyreltme gerek çok yüksek bir faj titresi olabilir. Biz ilk zenginleştirme ve LB agar kaplama (Şekil 2) sonra saf faj popülasyonları izole etmek için plak çizgi yöntemini kullanın. Seçenek olarak ise, geleneksel standart plak titre deneyi, bu yöntem daha fazla zaman, tepkin maddeleri ve bu malzeme alsa da saf faj izolatı izole etmek için kullanılabilirs. Daha önce de belirtildiği gibi,. Ampirik bir plaka üzerinde bir dokuma modeli oluşturmak üzere faj titresi numaraları ve plak oluşturucu birim (pfus) sayısını belirlemek için plak titre analizi kullanımı mutlaka Şekil 3 faj muz için seri seyreltiler, bir dizi gösterilmektedir ve ortaya koyuyor İyi bir web desen gibi görünmelidir ne plakaları biri. zenginleştirme tekniği kullanılarak izole 4 20 Arthrobacter fajlann elektron mikrografik görüntüleri tasvir Şekil. Şu anda izole 25 faj, bunlardan 23 oldukça uzun kuyrukları ile siphoviruses vardır. Izole edilmiş bir faj iki uzunluğu kuyrukları benzer merkez çapı içeren myoviruses bulunmaktadır.

Şekil 1,
Bireysel faj plakları izolasyonu için kullanılan Şekil 1. Streak plakası tekniği şematik. Sarı yıldız plaka üzerinde bölgeyi temsil eden LBfaj plak çizilme tamamlandıktan sonra üst agar artı bakteri çözeltisi dikkatli bir şekilde plaka üzerine döküldü edilmelidir.

Şekil 2,
Şekil üç farklı sıcaklıkta bir faj (Dylan) için plakların izolasyonu için kullanılan çizgi levha tekniğinin 2. örnekler. Bu Dylan oda sıcaklığında içindeki plaklar üreten faj, 30 ° C ve 37 ° C dikkat edin. Plakaların iki kırmızı daireler açıkça izole plaklar çevreliyor.

Şekil 3,
Şekil 3. Plak titre deneyi. Arthrobacter faj Muz bölümler 4.6 ve Protokol metin 4.7. Gösterilen tarif edildiği gibi, PB içerisinde seyreltilmiş ve agar plakaları üzerine kaplanmıştır seri olarak (üst), T-4, T-8 seri seyreltme bulunmaktadır. Bu th Note T-5 seyreltme (alttan üste) hala kalan bakteriyel çim sadece küçük bir miktar ile bir web deseni verdi. (T-1, T-3) Alt seri seyreltme herhangi bir bakteriyel büyüme eksikliği ile gösterilir faj partikülleri ile liz bakteriler ile tüm net plakaları oluşturdu.

Şekil 4,
Şekil 20 Arthrobacter fajlann 4. Elektron mikrografik görüntüleri zenginleştirme tekniği kullanılarak izole. Görüntüleri FEI Morgagni TEM kullanılarak alındı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Birçok önceki girişimleri Arthrobacter ana enfekte edebilen fajları izole etmek rağmen, biz standart zenginleştirme prosedürleri kullanarak küçük bir başarı vardı. geliştirilmiş ve çevresel örneklerden fajları zenginleştirmek için van Twest ve Kropinski 10 tarafından uyarlanan bakteriyel zenginleşme genelleştirilmiş yöntem zenginleştirme prosedürleri çoğunluğu için temel kalır. Önceki çalışmalarda elde edilen kanıtlar doğrudan kaplama yöntemleri izolasyonu 5 çok düşük başarı oranları ile olsa Arthrobacter suşları üzerinde saptanabilir plaklar üretilen olduğunu göstermektedir. Doğrudan kaplama yöntemiyle, fajlar, bir faj tamponu topraktan çıkarılan ve kirletici bakterilerin ayırmak üzere filtreden geçirilir. Faj partikülleri içeren, süzüldü ekstre konakçı hücre enfeksiyonu için istenen Bakteriler konukçu ilave edildi ve bakteri büyümesi ve faj amplifikasyonu ilave mermi olmadan yerleştirilir.

Bizim zenginleştirme tekniği sağlam ve opArthrobacter sp. KY3901 gelen Arthrobacter faj nispeten kolay izole edilmesini timized. Toprak numunelerinde mevcut olan bakterilerin çok farklı tipleri ile birlikte geleneksel zenginleştirme prosedürleri, fajlar ile, faj tamponu topraktan çıkarılır ve faj enfeksiyonu için konak olarak kullanılmış olan istenilen bakteri hücreleri taze büyüme ortamı ilave edildi. Toprak 0.22 uM filtre içinden süzme ile faj örnekleri ekstre gelen zenginleştirme yöntemi, tüm toprak bakterileri kaldırılır. Filtre edilmiş steril lizat içeren faj partikülleri, ama toprak bakterileri faj yayılma bir konak olarak kullanılabilen, istenen bakteriler ile 2x LB suyu içinde seyreltilir. Bizim zenginleştirme işlemi ve diğerleri arasındaki temel fark, zenginleştirme inkübasyon süre boyunca ana bakteri büyümesi için rekabet hiçbir kirletici toprak bakterileri olmasıdır. Sadece ana makine toprak bulaşabilir faj istenen konak bakteri ve dolayısıyla bu ayıklanmış Maximiİstenilen konak-spesifik fajların konak bakteri ve büyütme büyüme potansiyelini Zes.

Burada anlatılan prosedüre gelişiminde biz CaCl2 konsantrasyonları 11 bir dizi test herhangi bir zenginleştirme prosedürü doğasında seçici önyargı hesaba çalıştı. Ne belli oldu bazı faj izolatı kalsiyum iyonu konsantrasyonu ve sıcaklık gibi parametrelere bağlı fizyolojik farklılıklar göstermesidir. Gelecekteki Arthrobacter faj izolasyonların için biz böyle pH, sıcaklık, tuzluluk, besin, optimum çeşitli çevre koşullarında kendi hosts üretebilen fajları izole etmek iki değerlikli metal iyonları gibi önemli faktörler test planlıyoruz.

Biz taze Bu deneyde hücrelerin Arthrobacter yetiştirilen kullanın. Biz zorluk th bilinen fajlarla iyi titreleri faj izole veya sahip oldu çünkü büyüme geç durağan faza orta ulaşmak hücreleri kullanmayınbüyüme dönemidir. Diğer büyüme geç durağan faz için orta bakteriyel hücreler kullanılarak fajları izole edilmesi başarılı olmaması anlamına gelebilir durağan faz Achromobacter hücreleri 12 faj enfeksiyonun bir inhibisyon göstermiştir. Bu 0,5-0,9 bir OD6 00 herhangi bir yerinde bir hücre yoğunluğu ile bu deneyler için başarı ile kültür olmuştur. Yetiştirilen kültürler, 4 ° C'de saklanır ve yedi gün faj izolasyonu için de kullanılabilir. Ancak, daha uzun Arthrobacter hücreler, 4 ° C daha düşük titre C'de saklandı ve bulaşıcı faj partiküllerinin boyutunu kayma vardır. Benzer sonuçlar phageT4 13 bulaşmasına Escherichia coli kullanılarak bulunmuştur. Istenilen bir büyüme olan bir toprak örneğinden yeni bir faj elde şansını en üst düzeye ulaşmak sonra bu nedenle mümkün olan en kısa gibi bakteri hücreleri kullanılmıştır.

Genel olarak, LB medya ile bu zenginleştirme tekniği kullanımını konuşan pek olmayı ispatlamak zorundadırArthrobacter fajların izolasyonu özel. LB E. kültürü için endüstri standardı olmuştur iken E. coli suşu ve Enterobacteriaceae diğer üyeleri, bu aerobik şartlar 14 bakterilerin çeşitli gelişimini destekler. LB ortamı besin yönünden zengin bir bileşim muhtemelen faj keşif engelleyen teknik zorlukları önlenmesi aerobik bakteri inanılmaz farklı grupta fagların ilerletilmesi için, bu yöntemde kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını beyan ederim.

Acknowledgments

Bu protokolün geliştirilmesi için Fon Yükseköğretim için Güneydoğu Pennsylvania Konsorsiyumu ve Cabrini Koleji Fen Bölümü tarafından sağlanmıştır. Ek finansman ve destek Arcadia Üniversitesi ve Immaculata Üniversitesi'nden geldi. Biz özellikle nazik bizim izole fajların elektron mikroskobik görüntüleri almak için Joseph Üniversitesi'nden Dr. Karen Snetselaar teşekkür ederim. Ek destek Genomik ve Evrimsel Bilimi (SEA-fajlar) programı ilerleyen Howard Hughes Tıp Enstitüsü Fen Bilgisi Öğretmenliği İttifak Phage Hunters tarafından sağlandı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth powder Fisher BP9722-2 It's best to order these in bulk.
Granulated Agar Fisher BP1423-2 It's best to order these in bulk.
0.22 um syringe filters Fisher 09-719A
0.22 um buchner filters Fisher 430320 More than 50 ml of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.
Eppendorf Tubes Fisher 05-408-129
5 ml pipets individual Fisher 13-678-11D
50 ml conical tubes Fisher 76002844
15 ml conical tubes Fisher 76002845
10 ml pipets individual Fisher 13-676-10J
25 ml pipets individual Fisher 13-676-10K
Whatman qualitative filter paper Fisher 1001-824

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism. J Bacteriol. 189, (3), 674-682 (2007).
  2. Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C. Isolation and Characterization of Atrazine Degrading Arthrobacter sp. AD26 and Use of this Strain in Bioremediation of Contaminated Soil. J Environ Sci. 20, 1226-1230 (2008).
  3. Wang, J., Zhu, L., Liu, A., Ma, T., Wang, Q., Xie, H., Wang, J., Jiang, T., Zhao, T. Isolation and characterization of an Arthrobacter sp. Strain HB-5 that Transforms Atrazine. Environ Geochem Hlth. 33, 259-266 (2011).
  4. Mages, I. S., Frodl, R., Bernard, K. A., Funke, G. Identities of Arthrobacter spp. And Arthrobacter-Like Bacteria Encountered in Human Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 46, (9), 2980-2986 (2008).
  5. Brown, D. R., Holt, J. G., Pattee, P. A. Isolation and Characterization of Arthrobacter Bacteriophages and Their Application to Phage Typing of Soil Arthrobacters. Appl Environ Microbiol. 35, (1), 185-191 (1978).
  6. Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. Prevention of Gordonia and Nocardia Stabilized Foam Formation by Using Bacteriophage GTE7. Appl Environ Microbiol. 77, (21), 7864-7867 (2011).
  7. Le Marrec, C., Moreau, S., Loury, S., Blanco, C., Trautwetter, a Genetic Characterization of Site-specific Integration Functions of phi AAU2 infecting “Arthrobacter aureus” C70. J Bacteriology. 178, (7), 1996-2004 (1996).
  8. Casida, L. E., Liu, K. C. Arthrobacter globiformis and Its Bacteriophage in Soil. J Appl Microbiol. 28, (6), 951-959 (1974).
  9. Einck, K. H., Pattee, P. A., Holt, J. G., Hagedorn, C., Miller, J. A., Berryhill, D. L. Isolation and Characterization of a Bacteriophage of Arthrobacter globiformis. J Virol. 12, (5), 1031-1033 (1973).
  10. Twest, R., Kropinski, A. M. Bacteriophage Enrichment from Soil and Water. Methods Mol Bio. 501, 15-21 (2009).
  11. Fullner, K. J., Hatfull, G. F. Mycobacteriophage L5 Infection of Mycobacterium bovis BCG: Implications for Phage Genetics in the Slow-growing Mycobacteria. Mol Microbiol. 26, (4), 755-766 (1997).
  12. Robb, S. M., Woods, D. R., Robb, F. T. Phage Growth Characteristics on Stationary Phase Achromobacter cells. J Gen Virol. 41, (2), 265-272 (1978).
  13. Bolger-Munro, M., Cheung, K., Fang, A., Wang, L. T4 Bacteriophage Average Burst Size Varies with Escherichia coli B23 Cell Culture Age. Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 17, 115-119 (2013).
  14. MacWilliams, M. P., Liao, M. K. Luria Broth (LB) and Luria Agar, Media and Their Uses Protocol. ASM MicrobeLibrary. Available from: http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3020-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-escherichia-coli (2013).
Yalıtım için bir optimize Zenginleştirme Tekniği<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Bakteriyofaj Türlerinin Toprak Numune İzolatlarının gelen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cross, T., Schoff, C., Chudoff, D., Graves, L., Broomell, H., Terry, K., Farina, J., Correa, A., Shade, D., Dunbar, D. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (98), e52781, doi:10.3791/52781 (2015).More

Cross, T., Schoff, C., Chudoff, D., Graves, L., Broomell, H., Terry, K., Farina, J., Correa, A., Shade, D., Dunbar, D. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (98), e52781, doi:10.3791/52781 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter