Abstract
Celler fra dyr, planter og enkelte celler er omgivet af en barriere kaldet cellemembranen, der adskiller cytoplasmaet udefra. Cellelag såsom epitel også danner en barriere, der adskiller indersiden fra ydersiden eller forskellige rum af flercellede organismer. Et centralt element i disse barrierer er forskellen fordeling af ioner på tværs af cellemembraner eller cellelag. To egenskaber tillader denne fordeling: 1) membraner og epiteler vise selektiv permeabilitet til bestemte ioner; 2) ioner transporteres gennem pumper over cellemembraner og cellelag. Disse egenskaber spiller afgørende roller i at opretholde væv fysiologi og fungere som signalering tidskoder efter skade, under reparation, eller under patologisk tilstand. Den ionselektive selvrefererende mikroelektrode tillader målinger af specifikke fluxe af ioner, såsom calcium, kalium eller natrium ved enkeltcelle-og vævsniveauer. Mikroelektrode indeholder en ionophor cocktail, som erselektivt permeabel for en bestemt ion. Den interne påfyldning opløsning indeholder et sæt koncentration af ionen af interesse. Det elektriske potentiale af mikroelektrode bestemmes af den udvendige koncentration af ionen. Som ionkoncentrationen varierer potentiale mikroelektrode ændrer sig som funktion af log af ionen aktivitet. Når bevæges frem og tilbage i nærheden af en kilde eller vask af ionen (dvs. i en koncentrationsgradient grundet ionflux) mikroelektrode potentiale svinger med en amplitude proportional med ionstrøm / gradient. Forstærkeren forstærker mikroelektrode signal og produktionen registreres på computer. Ion flux kan så beregnes ved Ficks lov om diffusion ved hjælp elektrodepotentialet udsving, udflugten af mikroelektrode, og andre parametre, såsom den specifikke ion mobilitet. I dette papir, vi beskriver i detaljer den metode til måling af ekstracellulære ion strømme ved hjælp af ion-selektive selvrefererende mikroelektrode end præsentere nogle repræsentative resultater.
Introduction
Alle animalske celler er omgivet af en dobbeltlaget lipidmembran, som adskiller cytoplasmaet fra det ydre miljø. Cellen opretholder et elektrisk membranpotentiale, negativ indvendigt af aktiv transport af ioner 1. Membranpotentialet er en lagret energikilde, som cellen kan bruge til at betjene forskellige molekylære enheder i membranen 2. Neuroner og andre exciterbare celler har store membranpotentialer. Hurtig åbning af natriumkanaler kollapser membranpotentialet (depolarisering) og producerer aktionspotentialet, der transporteres langs længden af neuron 2. Bortset fra disse hurtige elektriske forandringer, mange væv og organer generere og opretholde betydelige langsigtede elektriske potentialer. For eksempel, hud og hornhindens epitel generere og vedligeholde trans-epiteliale potentialer og ekstracellulære elektriske strømme ved retningsbestemt pumpning af ioner (hovedsagelig natrium og chlorid) 3.
telt "> Mens målinger af endogen ekstracellulære elektrisk strøm ved hjælp af vibrerende sonde 4-6 og målinger af membran- eller trans-epitel potentialer ved hjælp af mikroelektrode-systemet 7-10 tillade måling af de elektriske parametre for cellemembraner og epiteliale cellelag, giver de ikke angivelse af de ion involverede arter.Mikroelektroder med selektiv ionophor kan måle specifikke ion-koncentration i opløsning. Ion gradienter eller flux kunne måles med to eller flere elektroder på forskellige positioner. Den iboende spænding Forskydningen af hver probe, ville imidlertid være forskellige, hvilket forårsager unøjagtige målinger eller endda påvisning af en gradient, der ikke var til stede. En enkelt elektrode, der anvendes i "self-referering" -tilstand, hvorved den bevæger sig ved lav frekvens mellem to punkter løser dette problem. Nu ion flux kan ses på baggrund af en forholdsvis langsom og stabilt signal drift (se figur 3B). Den ion-følsomme måle system bruger ionselektive selvrefererende mikroelektroder at detektere små ekstracellulære fluxe af ioner tæt på væv eller enkeltceller. Systemet består af en forstærker, som behandler signalet fra mikroelektroden og en mikro stepmotor og driver til at styre bevægelsen af mikroelektrode. Den ionselektive mikroelektrode og referenceelektroden, der lukker kredsløbet er forbundet til forstærkeren via en hovedtrin forforstærker (figur 1A). Computersoftware bestemmer parametrene for mikroelektrode bevægelse (frekvens, afstand) og også registrerer udgangen af forstærkeren. Stepmotor styrer mikroelektrode bevægelse via en tredimensional micropositioner. En lav frekvens vibrerende ionselektiv mikroelektrode blev først udviklet i 1990 for at måle specifik calciumflux 11. Samt calcium, kommercielt tilgængelige ionofore cocktails er nu tilgængelige at gøre microelectrodes følsom over for natrium, chlorid, kalium, hydrogen, magnesium, nitrat, ammonium, fluorid, lithium eller kviksølv.
Grundlæggende selvrefererende ionselektiv mikroelektrode teknik omdanner aktiviteten af en specifik ion opløst i en opløsning til et elektrisk potentiale, som kan måles ved et voltmeter. Ionoforen cocktail er en ikke-blandbar væske (organisk, lipofil) fase med ionbyttende egenskaber. Ionoforen selektivt komplekser (bindingssted) specifikke ioner reversibelt og overfører dem mellem den vandige opløsning indeholdt i mikroelektrode (elektrolyt), og den vandige opløsning, hvori mikroelektrode er nedsænket (figur 1D). Denne ionoverførsel fører til en elektrokemisk ligevægt og en variation af den elektriske spænding mellem mikroelektroden og referenceelektroden måles af voltmeter. Spændingen er proportional med logaritmen til den specifikke ion aktivitet ifølge Nernst equation tillader beregning af ionkoncentrationen (figur 2A og B).
På nuværende tidspunkt tillader flere systemer måling af ion flux ved anvendelse af en lignende koncept eller princip. For eksempel Scanning Ion-selektive elektroder Technique (Siet) 12,13 eller mikroelektroden Ion Flux Estimation (MIFE) udviklet af Newman og Shabala 14-16 er kommercielt tilgængelige og almindeligt anvendt af forskningsmiljøet for at bestemme specifik ion flusmidler forekommer på cellemembranen og væv på tværs af en bred vifte af dyr, planter og enkelt levende celle modeller. Ion-selektive mikroelektroder er blevet anvendt til at måle hydrogen, kalium og calcium flux hen planterødder 17, chlorid flux i rotte cerebrale arterier 18 og i pollen rør 19, brint flux i skate retinale celler 20, calcium flux i museknoglemarvs 21 forskellige ion flusmidler i svampehyfer 22 og i rved hornhinden 23, og endelig calciumflux under enkelt celle sårheling 12,24. Se også følgende anmeldelse af detaljerede oplysninger om ionselektive selvstændige henvisninger mikroelektroder 25.
Følgende artikel beskriver i detaljer, hvordan man forbereder og udfører måling af endogene ekstracellulære ionstrømme hjælp af ion-selektive selvrefererende mikroelektrode teknik på enkelt celle niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ion-selektive Self-henvisninger mikroelektrode Forberedelse
- Fremstilling af ionselektiv mikroelektrode
- Varme trække tyndvæggede borsilicat kapillærer uden glødetråd (1,5 mm ydre diameter, 1,12 mm indvendig diameter) under anvendelse af en mikroelektrode aftrækker.
Bemærk: Dette giver tips 3-4 um i diameter. Mindre tip har højere modstand, som gør mikroelektroder mere modtagelige for elektronisk støj og er også forbundet med en langsommere reaktion på en ændring i ion-koncentration. Nyttige oplysninger kan findes i papiret publiceret af Smith et al. 26. - Silanize elektroderne for at gøre den indre overflade hydrofob at hjælpe tilbageholdelse af den lipofile ionophor cocktail. Placer mikroelektroder i en metal rack og varme O / N i en ovn ved> 100 ° C for at tørre dem. Tandstangen er en metalplade med huller med en diameter på 2 mm boret en del af vejen igennem. Placere elektroderne i hullerne tip opad med en 250 ml glass bæger over dem.
- I morgen, slukke ovnen og mens iført isolerede handsker, forsigtigt fjerne metal rack med elektroderne og bæger på plads. Luk ovnlågen til at bevare varmen.
- Bær latex eller nitril handsker, kittel og beskyttelsesbriller. Med en plastik Pasteur pipette, placere en dråbe af silanisering løsning jeg i bunden af hver elektrode (holde bægeret på plads; bruge hælde læbe til pipette adgang). Den silanisering opløsning fordampes af den varme plade og silanizes indersiden af elektroderne. Brug en kemisk emhætte stinkskab for denne fase. Placer rack / bæger / elektroder tilbage i den varme ovn i et par timer for at tillade eventuel resterende silanisering løsning til at fordampe.
Bemærk: Af sikkerhedsmæssige årsager, skal du ikke tænde for ovnen igen. Placer en mærkat på ovnen angiver det må ikke være tændt, da det kan indeholde skadelige og brandfarlige dampe. - Efter afkøling, gemme mikroelektroder i en mikroelektrode opbevaring jar insiDe et glas ekssikkator med 400 g tørremiddel. Mikroelektroder kan lagres således i mange uger.
Bemærk: En alternativ silanisering metode er beskrevet i Smith et al 26. - Back-fill mikroelektroden med 50 til 100 pi (en længde på ca. 1 cm) af en opløsning indeholdende 100 mM af ionen, der skal måles (se tabel 1 og figur 1 B). Brug en engangs plastik Pasteur pipette varme trukket i en bunsenbrænder til en fin glødetråd. Skyl pipetten i dH2O bagefter for at forhindre blokering.
Bemærkning: Alternativt justeres ionkoncentrationen af opfyldning løsning, der svarer til koncentrationen af ion i den eksterne opløsning 27. - Observere mikroelektrode under et dissektionsmikroskop for at sikre fravær af luftbobler.
- Hvis der er luftbobler tap mikroelektroden let med en finger søm, mens du holder elektroden lodret (tip ned) og / eller skubbe boblens ud spidsen ved at anvende modtryk under anvendelse af en sprøjte modificeret med en silikoneslange udskiftning af nålen.
- Tip-fylde mikroelektrode med 15 til 20 nl (en længde på 30-50 um) af ion-specifik ionophor cocktail (se tabel 1). Placer en lille dråbe af ionophor cocktail på den korte kant på et objektglas. Overhold mikroelektroden spidsen under et dissektionsmikroskop og flytte det mod mikroskopobjektglasset indtil mikroelektroden spids rører ionophoren cocktail for kun omkring en halv sek. Trække ionophoren cocktail ind i mikroelektrode ved kapillær tryk.
Bemærk: Undgå at en lang søjle af ionofor cocktail, da dette øger sondens elektriske modstand som kan gøre det modtageligt for elektronisk interferens (støj) og også sænker svartiden. - Monter mikroelektrode i en lige mikroelektrode holder med en guld 1 mm hanstik og AgCl (Ag +) ledning (figur 1B). </ Li>
- Fastgør mikroelektroden indehaveren til hovedet scenen monteret på en tre-dimensionel computer-kontrollerede elektroniske micropositioner (figur 1A).
- Anbring mikroelektrode spidsen i måling opløsning egnet til at måle prøven (fysiologisk saltvand, dyrkningsmedium, osv) for at tillade mikroelektrode stabiliseres i en time eller to, eller endda natten over.
- Varme trække tyndvæggede borsilicat kapillærer uden glødetråd (1,5 mm ydre diameter, 1,12 mm indvendig diameter) under anvendelse af en mikroelektrode aftrækker.
- Udarbejdelse af referenceelektroden
- Referenceelektroder (Figur 1C) er de samme kapillærer som ovenfor. Skær kapillarrøret med en diamant blyant i 5 cm længder og brand-poleret ved hver ende i 1-2 sekunder i en Bunsen flamme.
- Udfylde disse elektroder med ~ 200 pi af en 3 M opløsning af NaCl, CH3 CO 2 K (kaliumacetat) eller KCI med 2% agarose. Vælge den løsning, afhængigt af ion, der skal måles (referenceelektroden bør ikke indeholde ionen, der måles, se tabel 1). Blandagarosen og opløsningen og opvarm til næsten kogning i en mikrobølgeovn. Omrør for at opløse agarosen (opløsningen går klart).
- Fastgør referenceelektroden til en plastik Pasteur pipette og trække den varme opløsning i kapillarrøret.
- Drop elektroden i koldt 3 M NaCl, CH3 CO 2 K eller KCl-opløsning og opbevares i denne 3 M opløsning i forseglede rør før anvendelse. Kassér eventuelle referenceelektroder med luftbobler.
- Monter referenceelektrode i en lige mikroelektrode holder (fyldt med 3 M opløsning) med en AgCl (Ag +) pellet inde og en guld 2 mm hanstik (figur 1C), og fastgør elektrode og holder på en manuel mikro-positioner monteret på en magnetisk stativ.
2. Ion-selektive Self-henvisninger mikroelektrode kalibrering
- Forberedelse kalibrering opløsninger indeholdende ion af interesse som i referenceopløsningen; se tabel 1 (f.eks dyrkningsmedier, fysiologisk saltvand). Det er, må man kalibreringsopløsning indeholder en lavere koncentration af ion end i måle- opløsning og en højere.
- For eksempel bruger saltvand, der indeholder 1 mM K +. At beslaget denne koncentration, opløses KCI pulver i deioniseret vand til en koncentration på 10, 1 og 0,1 mM i seriefortyndinger. Brug disse standardopløsninger. Alternativt kan du bruge mindst to af disse løsninger.
- Nedsænkes ion-selektive mikroelektrode og referenceelektrode i hver standardopløsning og lad spændingen værdien stabiliseres for 1 til 3 min før optagelse af den tilsvarende spænding ved hjælp af den dedikerede software (se tabel 1).
- Da softwaren gemmer data (forstærker output) som en txt-fil, kopiere data i et regneark fil. Plotte mikroelektrode output (mV) mod logaritmenden molære ionkoncentration (figur 2A).
- Påfør en lineær regression og beregne Nernst hældningen, skæringspunktet og R2 værdi. Accepter mikroelektroden hvis Nernst hældningen er 58 ± 11 mV / årti for monovalente ioner og 29 ± 11 mV / årti for divalente ioner (for kationer, Nernst hældningen er positiv, for anioner den er negativ). Desuden bør gode mikroelektroder har en stærk lineær korrelation (R2> 0,9; figur 2B).
Bemærk: mV outputtet af forstærkeren anvendes her giver mV læsning med en tidobbelt gevinst. Værdier skal divideres med en faktor ti. - Bruge lineær regression formel til at konvertere den rå mV output af mikroelektrode til egentlig ionkoncentration (figur 2B).
3. Validering af Ion-selektive mikroelektrode Teknik
- Forberedelse en kunstig kilde
- Kunstige source kapillærer er de samme kapillærer somovenfor. Varme trække kapillarrøret ved anvendelse af en mikroelektrode aftrækker som i trin 1.1.1.
- Opfyldning disse kapillærer med 200 pi af en 1 M opløsning af NaCl, KCl, CaCl2 2 H 2 O eller pH 4 buffer. Vælg den kunstige kilde opløsning afhængigt af den ion, der skal måles (se tabel 1).
Bemærk: Du kan også trække elektroder med større tip diameter (~ 20 pm) og tip-fyld med de samme løsninger, men som indeholder 0,5-1% agarose (agarose vil forhindre enhver bulk-strøm af opløsning). - Montere den kunstige kilde kapillær på en mikromanipulator og nedsænke det i opløsningen anvendes til at måle fluxen af ionen i prøverne. Efterlad den kunstige kilde i opløsningen i 30 minutter til 1 time for at tillade stabilisering af gradienten.
- Validering af ion-selektive mikroelektrode
- Nedsænkes ion-selektive mikroelektrode omkring en centimeter væk fra den kunstige kilde kapillar i opløsning, der anvendes til at measure strømmen af ion på prøverne og lukke kredsløb med referenceelektroden som før. Lad spændingsværdien stabiliseres i 1 til 3 min før optagelse af den tilsvarende spænding ved hjælp af dedikeret software til 1 til 2 min. Denne værdi svarer til bufferen værdi (i litteraturen også betegnet som reference, baggrund eller blindværdi).
- Flyt ion-selektive mikroelektrode til ca. 5 um fra den kunstige kilde og lad spændingen værdien stabiliseres for 1 til 3 min før optagelse af den tilsvarende spænding ved hjælp af softwaren i 1 til 2 min.
- Gentag ovenstående procedure ved at anbringe det ionselektive mikroelektrode ved 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 og 1280 um væk fra den kunstige kilde kapillar.
- Udtrække data som en txt-fil og kopiere værdierne i et regneark fil.
- Beregn ionkoncentrationen svarende til de mV værdier på samme måde som for kalibreringsværdierne. Plot værdi.
Ingente: Hvis en ionstrøm er til stede, mikroelektrode detekterer en forskel i ionkoncentration mellem de to positioner (figur 3B). Hvis den kunstige kilde indeholder flere ioner af arten målte end opløsningen bør koncentrationen være højere tæt på kilden end langt væk, validering evne ionselektive mikroelektrode til korrekt at detektere retningen af en ion flux (i dette tilfælde efflux, for en kunstig vask, med lavere specifik ionkoncentration end målemediet, bør det være tilstrømning).- Beregn ionstrøm hjælp Ficks lov om diffusion: J = c μ (dc / dx) hvor c er ionkoncentrationen i opløsningen (mol cm -3), μ er den ion mobilitet (mol cm N -1 sek-1) og dc er koncentrationsforskellen over afstand dx (cm) (figur 2C). Ion flux data præsenteres sædvanligvis i pmol cm-2 s-1 Eller nmol cm-2 sek-1.
Note:.. En alternativ metode til ionflux beregning beskrevet af Smith et al 26 kan anvendes. Væsentligste forskelle omfatter anvendelse af diffusionskoefficienten i stedet for ion mobilitet og subtraktion af baggrunden ionstrøm (også spænding drive eller korrektionsfaktor) beregnes ud fra måling af ion flux i saltvandsopløsning uden prøve. - Plotte middelværdien af ionstrømme af hvert trin mod afstanden fra kilden (figur 2D). Bevæger sig væk fra kilden, observere en eksponentiel formindskelse af flux værdi validering evne ionselektive mikroelektrode at fornemme anden størrelsesorden af ionstrømme.
- Gør den kunstige validering kilde én gang for hver specifik ion beregnet til at blive optaget for at validere sine korrekte retning og størrelse målinger med en stor signal-noise ratio.
Bemærk: Ion flux måling af bufferen uden prøver viser baggrundsniveauet eller støj. Typisk puffer måling viser ingen klar udsving i ionkoncentrationen fører til meget små flux, der viser varierende retninger.
- Beregn ionstrøm hjælp Ficks lov om diffusion: J = c μ (dc / dx) hvor c er ionkoncentrationen i opløsningen (mol cm -3), μ er den ion mobilitet (mol cm N -1 sek-1) og dc er koncentrationsforskellen over afstand dx (cm) (figur 2C). Ion flux data præsenteres sædvanligvis i pmol cm-2 s-1 Eller nmol cm-2 sek-1.
4. Fremstilling af målekammeret
Bemærk: Før eksperimenter, overveje prøve, der skal måles, og hvordan prøven skal monteres, og immobiliseres for mikroelektrode målinger.
- For Xenopus laevis oocyt målinger skære en 1 cm kvadrat af en 800 um nylon mesh (Nitex mesh) og lim den ind i en plast Petri-skål (figur 1E).
5. Ion Flux Måling
- Måle ionkoncentrationen stede i pufferen anvendt til at udføre målingerne på prøven på samme måde som ved kalibrering opløsning. X. laevis oocytter kræver Marks Modified Ringer (MMR). Dissolve NaCl, KCl, CaCl, MgCl og HEPES i deioniseret vand for at nå en endelig koncentration på (mM): 100 NaCl, 2 KCI, 2 CaCl, 1 MgCI og 5 HEPES. Justere pH af pufferen til 7,5 under anvendelse af NaOH.
- Anbring prøven ind i målekammeret og bringe ionselektive mikroelektrode tæt på prøven (ca. 10 um væk) under anvendelse af micropositioner at definere den tætte position af mikroelektrode (figur 3A).
- Start lav frekvens (0,3 Hz) udflugt (100 um) af mikroelektrode mellem den tætte position og en position væk fra prøven (fjern) ved hjælp af dedikeret software. Sikre, at bevægelsen af mikroelektrode er vinkelret på overfladen af prøven.
Bemærk: Udflugten af mikroelektrode kan indstilles på softwaren. Stor udflugt øger gradient læst tillader en lettere påvisning af små strømme under målingen, mens forlænger prøveudtagning interval og nedsætter den tidsmæssige opløsning. Se- Start optagelsen ved hjælp af softwaren. Mikroelektrode standser ved hver position og det elektriske potentiale i mV registreres på computeren. Opnå målinger i mindst 2 minutter, så signal stabilisering. For korte time-lapse eksperimenter, optage potentielle variationer i positionen af interesse for hele tiden kurset.
- Udtrække data som en txt-fil og kopiere værdierne i et regneark fil.
- Beregn ionkoncentrationen svarende til de mV værdier på samme måde som for kalibreringsværdierne. Plot værdi.
Bemærk: Hvis en ionstrøm er til stede, mikroelektrode detekterer en forskel i ionkoncentration mellem de to positioner (figur 3B).- Beregn ion flux hjælp Ficks lov diffusion som før (trin 3.3.1).
- Gentag målingen bufferen før måling en ny prøve og gentag proceduren af flux måling og beregning for hver nyprøve.
6. Statistisk analyse og datapræsentation
- Test de uafhængige virkninger af positionen og / eller af tiden på ionstrømme under kontrol tilstand under anvendelse af en ANCOVA model med blandede effekter 28.
Bemærk: Analyse af kovarians (ANCOVA) er en generel lineær model der blander regelmæssig ANOVA og regression ved at tillade både kategoriske og kontinuerlige foranstaltninger, der skal anvendes som uafhængige variable. Hertil kommer, i overværelse af korrelerede fejl fremkaldt af gentagne målinger pr individuelle og eventuelle indlejrede effekter, der blandede effekter modeller bruges til at modellere nøjagtige estimater af både faste og tilfældige effekter. - Beregn parvise sammenligninger ved hjælp af Student t-test mellem gruppens niveauer med Bonferroni korrektion for multiple test 28.
- Generer boxplots at opsummere ion flux målinger i henhold til position og tid. Omfatter p-værdier fra den parvise Student t beskrevetovenfor (figur 3D) og angiver signifikansniveauer af p-værdier på følgende måde: *: p <0,05; **: P <0,01; ***: P <0,001 29
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidligere vist, at calcium tilstrømning vises efter enkelt celle sårede 24. Vi spurgte derfor, om andre ionstrømme forekomme ved enkelt celle sårdannelse. Vi brugte X. laevis oocyt, en veletableret model for enkelt celle sårheling 30-34 og elektrofysiologiske optagelse 24,35-39. Interessant, kaliumioner er mere koncentrerede inde X. laevis-oocytter (ca. 110 mM) 40 end i den ekstracellulære opløsning, der anvendes (i MMR 1x: 1 mM), hvilket antyder en udstrømning af kalium ved sårdannelse. For at bekræfte denne hypotese, målte vi kalium flux i løbet af X. laevis oocyt cellemembran healing ved hjælp af ion-selektive selvrefererende mikroelektrode.
At sår oocytten, først trække en kapillær elektrode med en stor spids størrelse (~ 50 um). Fastgør elektroden til en lige elektrodeholder og montere på en manuel mikro-positioner. Wound den oocyte ved at berøre membranen med elektroden spids 24. Snart efter såring vi opdaget en stor udstrømning af kalium (op til 250 nmol cm-2 sek-1; Figur 3B - D). Som membran såret helet, denne flux formindskes, vender tilbage til læderet strømningsværdier set i intakt membran (~ 5 nmol cm-2 sek-1), når såret helet (op til 16 minutter efter sårdannelse; Figur 3B - D). ANCOVA afslørede en signifikant virkning af tid efter sårdannelse på kalium flux målinger (p <0,001). En post-hoc analyser afslørede signifikant forøget kaliumudstrømning på 1-2 min (p <0,001) og ved 5-6 min (p <0,05), men ikke ved 15-16 min efter sårdannelse sammenlignet med intakt cellemembran tilstand (figur 3D). Vi konkluderede, at ved enkelt celle sårdannelse, vises der en udstrømning af kalium på niveauet af såret at falde DUring i løbet af healing.
| Ion | Ionophor cocktail | Elektrolyt-opløsning (100 mM) | Referenceopløsning (3 M) | Kunstig kilde opløsning (1 M) |
| Ca2 + | Calciumionophor I Cocktail A (cat # 21.048) | CaCl2 2H 2 O | KCI | CaCl2 2H 2 O |
| Na + | Natrium-ionophor II Cocktail A (cat # 71.178) | NaCl | KCI | NaCl |
| Cl - | Chloride ionofor I Cocktail A (cat # 24902) | NaCl | CH 2 CO 2 K (kaliumacetat) | NaCl |
| K + | Kalium ionofor I Cocktail A (cat # 60031) KCI | NaCl | KCI | |
| H + | Hydrogen ionofor I Cocktail A (cat # 95.291) | pH 7,0 | KCI | pH 4,0 |
Tabel 1:. Eksempler på almindeligt anvendte ionofore cocktails også vist passende løsninger til at placere i mikroelektroderne, for den kunstige kilde og til at udføre kalibrering. Katalognumre er fra Sigma-Aldrich.
Figur 1:. Ion-selektive mikroelektroder (A) Skematisk repræsentation af ion-selektive selvrefererende mikroelektrode system. (B) Ion-selektive mikroelektrode. (C) Reference elektrode. (D) Ionbytning mellem den eksterne opløsning, og microelectrode via ionoforen. (E) Ordning af målekammeret bruges til X. laevis oocyt.
Figur 2: Ion-selektive mikroelektroder kalibrering, kunstig kilde og flux beregningsmetoder (A) Kalibreringskurve.. (B) Ligning af kalibreringskurven og beregning af ion koncentrationen. (C) Beregning af ionstrøm. (D) Ion flux målt ved specifikke afstande fra den kunstige kilde (1 M KCI).
Figur 3: Udviklingen i kalium flux på X. laevis oocyt sår under heling. (A) Foto og illustration af udflugtenaf ionselektive mikroelektrode måling ionkoncentration på X. laevis oocyt sår; den stiplede linie mellem '' en '' og '' v '' repræsenterer dyret-vegetabilsk akse. (B) Illustration af variationen af kaliumionkoncentration på X. laevis oocyt sår under heling. (C) Scatter (xy) plot, der viser middelværdien og standardfejlen af kalium flux måling på niveauet af såret på forskellige tidspunkter i løbet af X. laevis oocyt sårheling. (D) Boxplot viser kalium flux måling på det niveau af såret på forskellige tidspunkter i løbet af X. laevis oocyt sårheling (n = 16; p-værdier er angivet som følger: *: p <0,05; ***: p <0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiske trin for en vellykket måling af ekstracellulære ionstrømme in vivo er: reduktion af støjen, den korrekte fremstilling af ionselektive mikroelektroder og referenceelektrode, og placeringen af prøven og begge elektroder.
For at minimere støj, bør registreringssystemet være i en jordet (jordforbundet) Faradays bur fortrinsvis med en metal-topped (vibrationsisolering) tabel, som også er jordforbundet. Desuden bør mikroskopet chassis også jordforbindes. Kilder til elektrisk støj omfatter lyskilden. En fiberoptisk "fan-mindre" lyskilde forårsager minimal elektrisk støj. Endelig holder sølvtråd og pellet i mikroelektrode holdere chlorided også minimerer støj (dyk i natriumhypochlorit blegemiddel og skyl i dH2O) .Den tilstedeværelsen af luftbobler i ionselektive mikroelektrode eller i referenceelektroden vil resultere i måling fiasko som denledningsevne af mikroelektrode vil være nul eller kompromitteret. Således er det afgørende at kontrollere elektroderne under mikroskop inden montering dem på holderne. Se protokollen for nærmere procedure for at fjerne luftbobler. Den korrekte placering af både prøven og mikroelektroderne er nødvendige for at sikre pålidelige og reproducerbare resultater. Målingen af ionstrøm er afhængig af udflugt af mikroelektrode og dens position i forhold til prøven. Det er vigtigt at identificere netop det område af interesse, der vil blive målt på prøven og placer mikroelektrode at have en vinkelret bevægelse fra prøven. Enhver udflugt af mikroelektroder på en måde, der ikke er vinkelret på prøven vil resultere i ændret ionstrømme målinger og øget variabilitet blandt prøver.
Ionofor-cocktails dedikeret til at måle specifikke ioner, for eksempel kalium, kan også føle tilstedeværelsen af andre ioner, såsom natrium.I det tilfælde, måleopløsningen indeholder en høj mængde af en konkurrerende ion for ionophoren cocktail, er det vigtigt at bestemme selektiviteten af ionophor cocktail ved hjælp af kunstig kilde eksperiment. Her, opløsningen anvendes til dyrkning X. laevis oocytter (MMR) indeholder en høj koncentration af natrium. Det er således vigtigt at vurdere, om kalium ionophor cocktail anvendes også registrerer natrium. Ved anvendelse af kalium-ionophor cocktail fyldt mikroelektrode, kan vi prøve at måle en natrium flux ved anvendelse af en kunstig kilde, der indeholder høj koncentration af natrium (1 M NaCl; se tabel 1) at holde den samme måle- opløsning. Den kemiske gradient favoriserer udstrømningen af natrium, men ideelt ingen natrium flux bør detekteres af kalium-specifikke ionophor cocktail. Hvis en betydelig flux måles, bør den eksperimentelle betingelse optimeres. For eksempel kunne koncentrationen af konkurrerende ion sænkes ned til det punkt microelectrode ikke fornemmer det længere, mens dette kan påvirke natrium flux over plasmamembranen, der fører til potentielle forstyrrelser under kalium flux målinger. Ideelt set kan en justeringsfaktor beregnet ud fra den kunstige kilde eksperiment anvendes på dataene, eller en anden ionophor cocktail kan testes. Ion flux målinger under anvendelse af ionselektive selvrefererende mikroelektrode tillader måling af ionstrømme forekommer på celler og væv i vandig opløsning. Målinger af ionstrømme i celler eller væv, der normalt er i kontakt med en luft miljø kræver tilstedeværelsen af en opløsning, der ikke er naturligt til stede i deres miljø, og som kan ændre ionstrøm og udveksling, der forekommer under normale forhold. Særlig opmærksomhed skal gøres for at definere indholdet af en sådan løsning og minimere afvigelsen fra den oprindelige, fysiologiske miljø. Spektret af ioner, der kan måles med de ionselektive selvrefererende microelectrode teknik afhænger af tilgængeligheden og der findes særlige ionofore cocktails selektive til ion af interesse.
Ion flux målinger udført med ion-selektive selvrefererende mikroelektrode er udført i opløsning, sædvanligvis nær overfladen af celler eller væv, hvilket tillader ikke-invasiv måling af ekstracellulære ionstrømme. Denne metode tillader ikke målingen af ionstrømme inde væv, mellem celle og intercellulære rum. Den ionselektive selvrefererende mikroelektrode er ikke den eneste metode, der tillader måling af ionstrømme in vivo. En alternativ ny fremgangsmåde anvender fluorescerende bioelektricitet reportere 41, som muliggør måling af ionstrømme, der ikke er mulig ved anvendelse mikroelektroder. Disse farvestoffer tillader målinger af ioner flusmidler inde væv og celler og kan opnå subcellulære lokalisering. Denne teknik kan erhverve geografisk information af ionstrøm inde væv og celler, men ikke ion exskifte mellem vævet og det ekstracellulære rum. Desuden de fluorescerende bioelektricitet reportere normalt generere semi-kvantitative data. Anvendelsen af mikroelektrode-baseret teknologi til at måle ionstrømme stadig er gyldig og nødvendig og bringer yderligere oplysninger til brugen af fluorescerende bioelektricitet reportere, hvilket gør dem komplementære og ikke konkurrerende teknikker. Desuden interessante seneste udvikling omfatter amperometriske selvstændige henvisninger detektorer af ilt, nitrogenoxid og neurotransmitterne dopamin og glutamat 42,43. Amperometriske sensing er baseret på en kemisk reaktion ved føleren spids. Nye fiberoptiske mikroelektroder ("optrodes") er blevet udviklet til at måle ikke-invasivt metabolisk ilt flux 34,35 og pH 44 med høj selektivitet og følsomhed 45,46. Der er nu også en enzym-baseret nanopartikel-coatede probe følsom over for glucose 47.
Vi har set, at the ionselektiv selvrefererende mikroelektrode muliggør målinger af ekstracellulære ionstrømme in vivo. Ioner ikke kun udveksles mellem celler / væv og ekstracellulære rum, men også mellem celler og væv i levende organismer. Det er vigtigt at kombinere denne teknik med andre såsom fluorescerende bioelektricitet reportere for at værdsætte den rumlige opløsning af ionstrømme inde væv ud over de faktiske målinger af ionstrømme nær dens overflade. Desuden udgør ionstrømme en vigtig del af den bioelektriske tilstand, som definerer celler og væv sammen med cellemembranen potentiale, trans-epitel potentielle eller ekstracellulære elektriske strømme. Det er vigtigt, ud over måling af ionstrømme, at måle, i kombination, cellemembran og trans-epitel potentiale såvel som ekstracellulære elektriske strømme 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IonAmp | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Headstage pre-amplifier | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| MicroStep Driver | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Manual micropositioner | World Precision Instruments | Model KITE-R | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | Model M10 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Vibration isolation table | Newport Inc. | Model VW-3036-OPT-023040 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces | Newport Inc. | Model 360-90 | Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table |
| Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | none |
| Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | none |
| Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament | World Precision Instruments | TW150-4 | none |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | none |
| Metal rack | Made in-house | none | Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel |
| Oven | QL | Model 10 Lab Oven | none |
| Silanization solution I | Sigma-Aldrich | 85126 | Hazardous, handle as recommended by provider |
| Glass Petri dish; Pyrex | Fisher Scientific | 316060 | none |
| Electrode/micropipette storage jar | World Precision Instruments | E215 | none |
| Glass dessicator | Fisher Scientific | 08-595E | Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight. |
| Plastic Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11597722 | none |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | S97329 | none |
| Microscope slide | Sigma-Aldrich | S8902 | none |
| Straight microelectrode holder | Warner Instruments | QSW-A15P | with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire |
| Straight microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH3S | with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector |
| 6 cm Petri dish | VWR | 60872-306 | none |
| Nitex mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX750 | none |
| Glue; Loctite epoxy | VWR | 500043-451 | Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing |
| Deionized water | Sigma-Aldrich | 99053 | none |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | none |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | none |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | none |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | none |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | none |
| Sodium Hydroxyde | Sigma-Aldrich | S8045 | none |
| Potassium Acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | none |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | none |
References
- Weber, W. M., Liebold, K. M., Clauss, W. Amiloride-sensitive Na+ conductance in native Xenopus oocytes. Biochimica et biophysica acta. 1239, 201-206 (1995).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. Journal of cell science. 122, 4267-4276 (2009).
- Zhao, M. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Seminars in cell & developmental biology. 20, 674-682 (2009).
- Jaffe, L. F., Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. The Journal of cell biology. 63, 614-628 (1974).
- Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nature protocols. 2, 661-669 (2007).
- Reid, B., Zhao, M. Measurement of bioelectric current with a vibrating probe. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Moore, J. W. The patch clamp: single-channel recording. Science. 224, 50-51 (1984).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of visualized experiments. , (2008).
- McCaig, C. D., Robinson, K. R. The ontogeny of the transepidermal potential difference in frog embryos. Developmental biology. 90, 335-339 (1982).
- Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F. Detection of extracellular calcium gradients with a calcium-specific vibrating electrode. The Journal of cell biology. 110, 1565-1573 (1990).
- The use of the vibrating probe technique to study steady extracellular currents during pollen germination and tube growth. Fertilisation in Higher Plants: molecular and cytological aspects. Cai, G., Cresti, M., Moscatelli, A. , Springer-Verlag. 235-252 (1999).
- Kunkel, J. G., Xu, Y., Shipley, A. M., Feijó, J. A. The use of non-invasive ion-selective microelectrode techniques for the study of plant development. Plant Electrophysiology – Theory and Methods. (ed Volkov AG. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 109-137 (2006).
- Ordonez, N. M., Shabala, L., Gehring, C., Shabala, S. Noninvasive microelectrode ion flux estimation technique (MIFE) for the study of the regulation of root membrane transport by cyclic nucleotides. Methods in molecular biology. 1016, 95-106 (2013).
- Tegg, R. S., Melian, L., Wilson, C. R., Shabala, S. Plant cell growth and ion flux responses to the streptomycete phytotoxin thaxtomin A: calcium and hydrogen flux patterns revealed by the non-invasive MIFE technique. Plant & cell physiology. 46, 638-648 (2005).
- Newman, I. A. Ion transport in roots: measurement of fluxes using ion-selective microelectrodes to characterize transporter function. Plant, cell & environment. 24, 1-14 (2001).
- Kochian, L. V., Shaff, J. E., Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F., Lucas, W. J. Use of an extracellular, ion-selective, vibrating microelectrode system for the quantification of K(+), H (+), and Ca (2+) fluxes in maize roots and maize suspension cells. Planta. 188, 601-610 (1992).
- Doughty, J. M., Langton, P. D. Measurement of chloride flux associated with the myogenic response in rat cerebral arteries. The Journal of physiology. 534, 753-761 (2001).
- Messerli, M. A., Smith, P. J., Lewis, R. C., Robinson, K. R. Chloride fluxes in lily pollen tubes: a critical reevaluation. The Plant journal : for cell and molecular biology. 40, 799-812 (2004).
- Molina, A. J., et al. Neurotransmitter modulation of extracellular H+ fluxes from isolated retinal horizontal cells of the skate. The Journal of physiology. 560, 639-657 (2004).
- Marenzana, M., Shipley, A. M., Squitiero, P., Kunkel, J. G., Rubinacci, A. Bone as an ion exchange organ: evidence for instantaneous cell-dependent calcium efflux from bone not due to resorption. Bone. 37, 545-554 (2005).
- Lew, R. R. Ionic currents and ion fluxes in Neurospora crassa hyphae. Journal of experimental botany. 58, 3475-3481 (2007).
- Vieira, A. C., et al. Ionic components of electric current at rat corneal wounds. PloS one. 6, e17411 (2011).
- Luxardi, G., Reid, B., Maillard, P., Zhao, M. Single cell wound generates electric current circuit and cell membrane potential variations that requires calcium influx. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 6, 662-672 (2014).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. H. , (2007).
- Smith, P. J., Hammar, K., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Trimarchi, J. R. Self-referencing, non-invasive, ion selective electrode for single cell detection of trans-plasma membrane calcium flux. Microscopy research and technique. 46, 398-417 (1999).
- Messerli, M. A., Smith, P. J. Construction theory, and practical considerations for using self-referencing of Ca(2+)-selective microelectrodes for monitoring extracellular Ca(2+) gradients. Methods in cell biology. 99, 91-111 (2010).
- Chambers, J., Hastie, T., Pregibon, D. Ch. 48. Compstat. Momirović, K., Mildner, V. , Physica-Verlag HD. 317-321 (1990).
- Chambers, J. M., Cleveland, W. S., Kleiner, B., Tukey, P. A. Graphical methods for data analysis. , Wadsworth & Brooks/Cole. (1983).
- Burkel, B. M., Benink, H. A., Vaughan, E. M., von Dassow, G., Bement, W. M. A Rho GTPase signal treadmill backs a contractile array. Developmental cell. 23, 384-396 (2012).
- Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current biology : CB. 9, 579-587 (1999).
- Mandato, C. A., Bement, W. M. Contraction and polymerization cooperate to assemble and close actomyosin rings around Xenopus oocyte wounds. The Journal of cell biology. 154, 785-797 (2001).
- Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. The Journal of cell biology. 168, 429-439 (2005).
- Simon, C. M., Vaughan, E. M., Bement, W. M., Edelstein-Keshet, L. Pattern formation of Rho GTPases in single cell wound healing. Molecular biology of the cell. 24, 421-432 (2013).
- Petersen, C. C., Dupont, G. The initiation of a calcium signal in Xenopus oocytes. Cell calcium. 16, 391-403 (1994).
- Horisberger, J. D., Lemas, V., Kraehenbuhl, J. P., Rossier, B. C. Structure-function relationship of Na,K-ATPase. Annual review of physiology. 53, 565-584 (1991).
- Miledi, R. A calcium-dependent transient outward current in Xenopus laevis oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. London, England, , 491-497 (1982).
- Miledi, R., Parker, I. Chloride current induced by injection of calcium into Xenopus oocytes. The Journal of physiology. 357, 173-183 (1984).
- Parker, I., Miledi, R. A calcium-independent chloride current activated by hyperpolarization in Xenopus oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. 233, 191-199 (1988).
- Costa, P. F., Emilio, M. G., Fernandes, P. L., Ferreira, H. G., Ferreira, K. G. Determination of ionic permeability coefficients of the plasma membrane of Xenopus laevis oocytes under voltage clamp. The Journal of physiology. 413, 199-211 (1989).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 385-397 (2012).
- Porterfield, D. M. Measuring metabolism and biophysical flux in the tissue, cellular and sub-cellular domains: recent developments in self-referencing amperometry for physiological sensing. Biosensors. 22, 1186-1196 (2007).
- McLamore, E. S., et al. A self-referencing glutamate biosensor for measuring real time neuronal glutamate flux. Journal of neuroscience methods. 189, 14-22 (2010).
- Yin, M., et al. Highly sensitive and fast responsive fiber-optic modal interferometric pH sensor based on polyelectrolyte complex and polyelectrolyte self-assembled nanocoating. Analytical and bioanalytical chemistry. 399, 3623-3631 (2011).
- Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrode technology for non-invasive real-time measurement of biophysical flux and physiological sensing. The Analyst. 134, 2224-2232 (2009).
- McLamore, E. S., Jaroch, D., Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrodes for measuring spatially resolved, real-time metabolic oxygen flux in plant systems. Planta. 232, 1087-1099 (2010).
- McLamore, E. S., et al. A self referencing platinum nanoparticle decorated enzyme-based microbiosensor for real time measurement of physiological glucose transport. Biosensors & bioelectronics. 26, 2237-2245 (2011).
