Abstract
Cellen van dieren, planten en enkele cellen worden omsloten door een barrière genoemd celmembraan dat het cytoplasma van buitenaf scheidt. Cellagen zoals epithelia vormen een barrière die de binnenzijde scheidt van buitenaf of verschillende compartimenten van multicellulaire organismen. Een belangrijk kenmerk van deze barrières is het differentieel verdeling van de ionen door celmembranen en cellagen. Twee eigenschappen maken het mogelijk deze verdeling: 1) membranen en epithelia weer selectieve permeabiliteit voor specifieke ionen; 2) ionen worden vervoerd door middel van pompen door de celmembranen en cellagen. Deze eigenschappen spelen een cruciale rol in het behoud van het weefsel fysiologie en fungeren als het signaleren signalen na beschadiging, tijdens reparatie, of onder pathologische aandoening. De ion-selectieve zichzelf verwijzende micro-elektrode maakt metingen van specifieke fluxen van ionen zoals calcium, kalium of natrium in enkele cel en weefsel niveau. De micro-elektrode bevat een ionofoor cocktail dieselectief permeabel is voor een specifiek ion. De interne vulling oplossing bevat een set concentratie van het ion van belang. De elektrische potentiaal van de micro-elektrode wordt bepaald door de externe concentratie van de ionen. Aangezien de ionenconcentratie varieert het potentieel van de micro-elektrode verandert als een functie van de log van de ion activiteit. Wanneer heen en weer bewogen buurt van een bron of sink van de ionen (bijvoorbeeld in een concentratiegradiënt vanwege ion flux) de micro-elektrode potentiaal schommelt de amplitude evenredig is met de ion flux / gradiënt. De versterker versterkt het micro-elektrode signaal en de uitgang wordt op de computer. De ionenflux kan dan berekend met de wet van Fick diffusie via de elektrodepotentiaal fluctuatie, de amplitude van micro-elektrode, en andere parameters zoals de specifieke ionenmobiliteit. In dit artikel beschrijven we in detail de methodologie om extracellulaire ion fluxen te meten met behulp van de ion-selectieve self-verwijzingen micro-elektrode eend presenteren een aantal representatieve resultaten.
Introduction
Alle dierlijke cellen zijn omgeven door een lipide dubbellaag membraan dat het cytoplasma van de buitenomgeving gescheiden. De cel onderhoudt een elektrische membraanpotentiaal, negatieve binnen, door actief transport van ionen 1. De membraanpotentiaal is opgeslagen energiebron die de cel kan gebruiken om verschillende moleculaire apparaten werken in het membraan 2. Neuronen en andere exciteerbare cellen grote membraanpotentialen. Spoedig tot natriumkanalen stort de membraanpotentiaal (depolarisatie) en produceert de actiepotentiaal die loopt langs de lengte van het neuron 2 wordt getransporteerd. Naast deze snelle elektrische veranderingen, vele weefsels en organen te genereren en aanzienlijke langdurige elektrische potentialen te handhaven. Bijvoorbeeld, huid en hoornvlies epitheel genereren en trans-epitheliale potentialen en extracellulaire elektrische stroom te handhaven door gerichte pompen van ionen (voornamelijk natrium en chloride) 3.
tent "> Hoewel metingen van endogeen extracellulair elektrische stroom met de trillende probe 4-6 en metingen van membraan of trans-epitheliale potentialen via de micro-elektrode systeem 7-10 laten meten van de elektrische parameters van celmembranen en epitheliale cellagen, ze geven geen vermelding van de ionensoort betrokken.Micro-elektroden met selectieve ionofoor kunt specifieke ion-concentratie in oplossing te meten. Ion gradiënten of flux gemeten kon worden met twee of meer elektroden op verschillende posities. Echter, zou de intrinsieke spanning drift van elke probe verschillend zijn, waardoor onnauwkeurige meting of detectie van een gradiënt die niet aanwezig was. Een enkele elektrode in "self-referencing" -modus waarbij het beweegt bij lage frequentie tussen twee punten lost dit probleem op. Nu is de ion flux kan worden gezien tegen de achtergrond van een relatief langzame en stabiele signaal drift (zie figuur 3B). De ion-gevoelige meetsysteem maakt gebruik van ion-selectieve self-verwijzingen microelectrodes om kleine extracellulaire stromen van ionen in de buurt van weefsels of enkele cellen op te sporen. Het systeem omvat een versterker die het signaal van de micro-elektrode en een micro-stappenmotor en bestuurder de beweging van de micro-elektrode besturingsprocessen. De ion-selectieve micro-elektrode en de referentie-elektrode die de schakeling sluit zijn verbonden met de versterker via een headstage voorversterker (Figuur 1A). Computer software bepaalt de parameters van de micro-elektrode beweging (frequentie, afstand) en registreert ook de uitgang van de versterker. De stappenmotor regelt de micro-elektrode beweging via een driedimensionale micropositioner. Een laagfrequent trillen ion-selectieve micro-electrode werd eerst ontwikkeld in 1990 specifieke calciumflux 11 meten. Evenals calcium, commercieel toegankelijk ionofoor cocktails zijn nu beschikbaar voor MICR makenoelectrodes gevoelig voor natrium, chloride, kalium, waterstof, magnesium, nitraat, ammonium, fluoride, lithium of kwik.
Kortom, het zichzelf verwijzende ion-selectieve micro-elektrode techniek converteert de activiteit van een specifiek ion in een oplossing in een elektrisch potentiaal, die kan worden gemeten door een voltmeter. De ionofoor cocktail is een mengbare vloeistof (biologisch, lipofiele) fase met ionenwisseling eigenschappen. De ionofoor selectief complexen (bindt) specifieke ionen reversibel en overbrengt tussen de waterige oplossing in de micro-elektrode (elektrolyt) en de waterige oplossing waarin het micro-elektrode is ondergedompeld (figuur 1D). Dit ion overdracht leidt tot een elektrochemisch evenwicht en een variatie van de elektrische potentiaal tussen de micro-elektrode en de referentie-elektrode wordt gemeten door de voltmeter. De spanning is evenredig met de logaritme van de specifieke ionen activiteit volgens de Nernst equation waardoor de berekening van de ionenconcentratie (figuur 2A en B).
Momenteel verscheidene systemen kunnen meten ionenflux met een soortgelijk concept of principe. Bijvoorbeeld, de Scanning Ion-selectieve elektrode Technique (SIET) 12,13 of de micro-elektrode Ion Flux Schatting (MIFE) techniek ontwikkeld door Newman en Shabala 14-16 zijn commercieel verkrijgbaar en veel gebruikt door de onderzoeksgemeenschap om specifieke ion te bepalen fluxen die zich op het celmembraan en weefsel in een verscheidenheid van dieren, planten en enkele levende cel modellen. Ion-selectieve micro-elektroden werden gebruikt om waterstof, kalium en calcium flux tussen plantenwortels 17, chloride flux gemeten in ratten cerebrale arteriën 18 en pollen tubes 19, waterstofflux in skate retinale cellen 20, calciumflux in muizenbeenmerg 21 verschillende ion fluxen in schimmeldraden 22 en in rbij cornea 23 en tenslotte calciumflux in eencellige wondgenezing 12,24. Zie ook de volgende beoordeling voor gedetailleerde informatie over de ion-selectieve self-verwijzingen micro-elektroden 25.
Het volgende artikel beschrijft in detail hoe te bereiden en het meten van endogene extracellulaire ion fluxen met behulp van de ion-selectieve self-verwijzingen micro-elektrode techniek op enkele cel niveau uit te voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ion-selectieve Zelf referencing micro-elektrode Voorbereiding
- Bereiding van ion-selectieve micro-elektrode
- Warmte trekt dunwandige borosilicaat haarvaten zonder filament (1,5 mm buitendiameter, 1,12 mm binnendiameter) met een micro-elektrode trekker.
Opmerking: Dit geeft tips 3-4 micrometer in diameter. Kleinere tips hebben een hogere weerstand die microelectrodes gevoeliger zijn voor elektronische ruis produceert en is ook geassocieerd met een langzamere reactie op een verandering in ionenconcentratie. Nuttige informatie kan worden gevonden in de krant gepubliceerd door Smith et al. 26. - Silaniseren de elektroden op het binnenoppervlak hydrofoob hulpmiddel voor retentie van de lipofiele ionofoor cocktail maken. Plaats de micro-elektroden in een metalen rek en warmte O / N in een oven bij> 100 ° C te drogen. Het rek is een metalen plaat met 2 mm diameter gaten geboord deel van de doorgang. Plaats de elektroden in de gaten tip naar boven met een 250 ml glass beker over hen.
- In de ochtend, zet de oven uit en terwijl het dragen van isolerende handschoenen, verwijder voorzichtig de metalen rek met de elektroden en de beker op zijn plaats. Sluit de ovendeur om de warmte vast te houden.
- Draag latex of nitril, laboratoriumjas en oogbescherming. Met een plastic Pasteur pipet, plaats een druppel silanisering oplossing die ik aan de basis van elke elektrode (houd de beker op zijn plaats, gebruik de stromende lip voor toegang pipet). De silanisatie oplossing wordt verdampt door de hete plaat en silanizes de binnenkant van de elektroden. Gebruik een chemische afzuigkap zuurkast voor deze fase. Plaats het rek / beker / elektroden terug in de hete oven gedurende enkele uren om alle resterende silaneren oplossing te verdampen.
Opmerking: Om veiligheidsredenen, niet de oven niet weer aan te zetten. Plaats een etiket op de oven aangeeft dat mag niet worden ingeschakeld als het schadelijke en brandbare damp kunnen bevatten. - Na afkoeling, slaan de micro-elektroden in een micro-elektrode opslag jar insiDe een glas exsiccator met 400 g droogmiddel. Micro-elektroden kan dus worden opgeslagen voor vele weken.
Noot: Een alternatieve silanisatie werkwijze is beschreven in Smith et al 26. - Back vullen van de micro-elektrode met 50 tot 100 gl (een lengte van ongeveer 1 cm) van een oplossing bevattende 100 mM van het ion te meten (zie tabel 1 en figuur 1B). Gebruik een wegwerp plastic Pasteur pipet warmte trok in een bunsenbrander tot een boete filament. Spoel de pipet in dH 2 O daarna om verstopping te voorkomen.
Opmerking: Als alternatief pas de ionenconcentratie van de opvulling oplossing om de concentratie van ionen passen in de uitwendige oplossing 27. - Let op de micro-elektrode onder een dissectiemicroscoop om de afwezigheid van luchtbellen te verzekeren.
- Indien luchtbellen aanwezig zijn kraan de micro-elektrode lichtjes met een nagel terwijl de elektrode verticaal (tip naar beneden) en / of druk op de bubbles uit de tip door het toepassen van tegendruk behulp van een injectiespuit gemodificeerd met een siliconen buis vervangen van de naald.
- Tip vullen van de micro-elektrode met 15-20 nl (een lengte van 30-50 pm), van ion-specifieke ionofoor cocktail (zie tabel 1). Plaats een kleine druppel ionofoor cocktail op de korte zijde van een microscoop dia. Let op de micro-elektrode tip onder een dissectie microscoop en bewegen in de richting van de microscoop dia totdat de micro-elektrode tip raakt de ionofoor cocktail voor slechts ongeveer een halve seconde. Teken de ionofoor cocktail in de micro-elektrode door capillaire druk.
Opmerking: Vermijd een lange kolom van ionofoor cocktail als dit verhoogt de elektrische weerstand van de sonde waarop zij gevoelig zijn voor elektronische storing (ruis) kunnen maken en vertraagt ook de responstijd. - Monteer de micro-elektrode in een rechte micro-elektrode houder met een gouden 1 mm male connector en AgCl (Ag +) draad (Figuur 1B). </ Li>
- Bevestig de micro-elektrode houder aan het hoofd podium gemonteerd op een drie-dimensionale computergestuurde elektronische micropositioner (figuur 1A).
- Plaats de micro-elektrode tip in meetoplossing geschikt voor het monster te meten (fysiologisch zout, kweekmedium, etc.) zodat de micro-elektrode stabiliseren van een uur of twee, of zelfs gedurende de nacht.
- Warmte trekt dunwandige borosilicaat haarvaten zonder filament (1,5 mm buitendiameter, 1,12 mm binnendiameter) met een micro-elektrode trekker.
- Bereiding van de referentie-elektrode
- Referentie-elektroden (figuur 1C) dezelfde capillairen als hierboven. Snijd de capillair met een diamant potlood in 5 cm lengte en vuur-gepolijst aan elk uiteinde voor 1-2 sec in een Bunsen vlam.
- Vul deze elektroden met ~ 200 ul van een 3 M oplossing van NaCl, CH 3 CO 2 K (kaliumacetaat) of KCl met 2% agarose. Kies de oplossing afhankelijk van de ionen te meten (de referentie-elektrode niet de ionen gemeten bevat; zie Tabel 1). Mengenhet agarose en de oplossing en verhit tot bijna koken in een magnetron. Roer tot de agarose op te lossen (de oplossing gaat helder).
- Bevestig de referentie-elektrode om een plastic Pasteur pipet en trekken de hete oplossing in het capillair.
- Laat de elektrode in koude 3 M NaCl, CH 3 CO 2 K of KCl-oplossing en programmeer op deze 3 M oplossing in afgesloten buizen voor gebruik. Gooi alle referentie-elektroden met luchtbellen.
- Monteer de referentie-elektrode in een rechte micro-elektrode houder (pre-gevuld met 3 M-oplossing) met een AgCl (Ag +) pellet binnen en een gouden 2 mm mannelijke connector (figuur 1C) en bevestig de elektrode en houder op een handmatige micro-klepstandsteller gemonteerd op een magnetische standaard.
2. Ion-selectieve Zelf referencing micro-elektrode Calibration
- Het voorbereiden van het kalibreren van oplossingen die het ion van belang als in de referentie-oplossing; zie tabel 1 (bijvoorbeeld kweekmedia, fysiologische zoutoplossing). Dat wil zeggen, moet men ijkoplossing een lagere concentratie van ionen bevatten dan in de meetoplossing en één hoger.
- Gebruik bijvoorbeeld een zoutoplossing die 1 mM van K + bevat. Om deze concentratie beugel los KCl poeder in gedeïoniseerd water tot een concentratie van 10, 1 en 0,1 mM in seriële verdunningen. Gebruik deze kalibratie-oplossingen. Als alternatief gebruik van ten minste twee van deze oplossingen.
- Dompel de ion-selectieve micro-elektrode en de referentie-elektrode in elke ijkoplossing en laat de spanningswaarde stabiliseren 1-3 min voor het opnemen van de overeenkomstige spanning via de speciale software (zie tabel 1).
- Omdat de software slaat de data (versterker output) als een txt-bestand, kopieert u de gegevens in een spreadsheet-bestand. Zet de micro-elektrode-uitgang (mV) tegen de logaritme vande molaire ionenconcentratie (Figuur 2A).
- Breng een lineaire regressie en bereken de Nernst helling, te onderscheppen en R2 waarde. Accepteer de micro-elektrode als de Nernst helling is 58 ± 11 mV / decade voor monovalente ionen en 29 ± 11 mV / decade voor divalente ionen (voor kationen, de Nernst helling positief is, voor anionen is negatief). Bovendien moet goed microelectrodes een sterke lineaire correlatie (Figuur 2B R 2> 0,9) heeft.
Opmerking: De mV-uitgang van de versterker die hier gebruikt geeft mV lezing met een tienvoudige gewin. Waarden moeten worden gedeeld door een factor tien. - Met de lineaire regressie om de ruwe mV uitgang van de micro-elektrode converteren naar de eigenlijke ion concentratie (Figuur 2B).
3. Validatie van de Ion-selectieve micro-elektrode Technique
- De voorbereiding van een kunstmatige bron
- Kunstmatige source haarvaten zijn hetzelfde als haarvatenhierboven. Hitte trek de capillaire met behulp van een micro-elektrode trekker als in stap 1.1.1.
- Backfill deze capillairen met 200 gl van een 1 M oplossing van NaCl, KCl, CaCl 2 2 H 2 O of pH 4 buffer. Kies de kunstmatige bron oplossing afhankelijk van de ionen te meten (zie tabel 1).
Opmerking: Als alternatief, trek elektroden met grotere tip diameter (~ 20 urn) en tip-vullen met dezelfde oplossingen, maar met 0,5-1% agarose (agarose wordt voorkomen dat bulkstroom van de oplossing). - Monteer de kunstmatige bron capillair op een micromanipulator en onder te dompelen in de oplossing wordt gebruikt om de flux van de ionen in de monsters te meten. Laat de kunstmatige bron in de oplossing gedurende 30 min tot 1 h tot een stabiele gradiënt mogelijk.
- Validatie van de ion-selectieve micro-elektrode
- Dompel de ion-selectieve micro-elektrode ongeveer een centimeter vanaf de kunstmatige capillair bron in de oplossing gebruikt measuopnieuw de flux van ionen op de monsters en sluit het circuit met de referentie-elektrode als voorheen. Laat de spanningswaarde stabiliseren 1-3 min voor het opnemen van de overeenkomstige spanning via de speciale software gedurende 1 tot 2 minuten. Deze waarde correspondeert met de bufferwaarde (in de literatuur ook wel aangeduid als referentie, achtergrond of nulwaarde).
- Verplaats de ion-selectieve micro-elektrode tot ongeveer 5 urn van de kunstmatige stralingsbron en laat de spanningswaarde stabiliseren 1-3 min voor het opnemen van de overeenkomstige spanning met de software gedurende 1 tot 2 minuten.
- Herhaal de bovenstaande procedure door het plaatsen van de ion selectieve micro-elektrode bij 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 en 1280 urn afstand van de kunstmatige stralingsbron capillair.
- Pak de data als een txt-bestand en kopieer de waarden in een spreadsheet-bestand.
- Bereken de ion concentratie die overeenkomt met de mV-waarden op dezelfde wijze als de kalibratiewaarden. Plot de waarde.
Neete: Als een ion flux aanwezig is, de micro-elektrode een verschil in ionenconcentratie tussen de twee standen (figuur 3B) detecteert. Indien de kunstmatige stralingsbron bevat meer ionen van het soort gemeten dan de oplossing moet de concentratie hoger dichtbij de bron dan ver weg, het valideren van het vermogen van de ion-selectieve micro-elektrode te kunnen detecteren de richting van een ion flux (in casu efflux want een kunstmatige spoelbak met lager soortelijk ionenconcentratie dan meetmedium, moet instroom zijn).- Bereken de ionenflux behulp Fick's wet van diffusie: J = c μ (dc / dx) waarbij c de ionenconcentratie in de oplossing (mol -3 cm), μ is de ionenmobiliteit (cm mol N -1 sec -1) en dc is de concentratie verschil over afstand dx (cm) (figuur 2C). Ion flux-gegevens worden gewoonlijk in pmol cm -2 s-1 Of -2 nmol cm -1 sec.
Noot:.. Een alternatieve werkwijze ionenflux berekenen is beschreven door Smith et al 26 kunnen worden gebruikt. Belangrijke verschillen omvatten het gebruik van de diffusiecoëfficiënt in plaats van de ionenmobiliteit en aftrekken van de achtergrond ionenflux (ook spanningsdrift of correctiefactor) berekend uit metingen van ionenflux in zoutoplossing zonder monster. - Plot het gemiddelde van de ion fluxen van elke stap tegen de afstand tot de bron (Figuur 2D). Afgestapt van de bron, acht een exponentiële afname van de fluxwaarde valideren het vermogen van de ion-selectieve micro-elektrode verschillende magnitude van ionfluxen voelen.
- Doe de kunstmatige bron validatie eenmaal voor elk specifiek ion bedoeld om de juiste richting en grootte metingen bevestigen met een grote signaal-n te registrerenoise ratio.
Opmerking: Ion flux meting van de buffer, zonder samples geeft het achtergrondniveau of ruis. Typisch, buffer meting toont geen duidelijke fluctuatie van de ion concentratie leidt tot zeer kleine flux die variabele richtingen weergeeft.
- Bereken de ionenflux behulp Fick's wet van diffusie: J = c μ (dc / dx) waarbij c de ionenconcentratie in de oplossing (mol -3 cm), μ is de ionenmobiliteit (cm mol N -1 sec -1) en dc is de concentratie verschil over afstand dx (cm) (figuur 2C). Ion flux-gegevens worden gewoonlijk in pmol cm -2 s-1 Of -2 nmol cm -1 sec.
4. Voorbereiding van de meetkamer
Opmerking: Voordat experimenten, beschouwen het monster moet worden gemeten en hoe het monster moet worden gemonteerd en geïmmobiliseerd voor micro-elektrode metingen.
- Voor Xenopus laevis oöcyten metingen snijd een 1 cm plein van een 800 um nylon mesh (Nitex mesh) en plak het in een plastic petrischaal (figuur 1E).
5. Ion Flux Measurement
- Meet de ionenconcentratie in de buffer gebruikt voor de metingen aan het monster op dezelfde wijze als de ijkoplossing. X. laevis eicellen nodig Mark's Modified Ringer (MMR). D100 NaCl, 2 KCl, CaCl 2, 1 en 5 MgCl HEPES: issolve NaCl, KCl, CaCl, MgCl en HEPES in gedeïoniseerd water tot een uiteindelijke concentratie (mM) te bereiken. Stel de pH van de buffer 7,5 behulp NaOH.
- Het monster in de meetkamer en breng de ion-selectieve micro-elektrode nabij het monster (ongeveer 10 urn afstand) met het micropositioner in de sluitstand van de micro-elektrode (figuur 3A) te definiëren.
- Start de lage frequentie (0,3 Hz) tocht (100 um) van de micro-elektrode tussen de gesloten positie en een positie verwijderd van het monster (afstand) met de speciale software. Zorg ervoor dat de beweging van de micro-elektrode loodrecht op het oppervlak van het monster.
Opmerking: De excursie van de micro-elektrode kan worden ingesteld op de software. Grote excursie verhoogt de helling te lezen waardoor een eenvoudiger detectie van kleine stromen tijdens de meting, terwijl verlengt de sampling interval en vermindert de temporele resolutie. Zien- Start de opname met behulp van de software. De micro-elektrode pauzeert op elke positie en de elektrische potentiaal in mV wordt opgenomen op de computer. Verkrijgen metingen gedurende minstens 2 min, waardoor het signaal stabilisatie. Voor korte time-lapse experimenten, opnemen mogelijke variaties op de positie van belang zijn voor de hele tijd natuurlijk.
- Pak de data als een txt-bestand en kopieer de waarden in een spreadsheet-bestand.
- Bereken de ion concentratie die overeenkomt met de mV-waarden op dezelfde wijze als de kalibratiewaarden. Plot de waarde.
Opmerking: Als een ion flux aanwezig is, de micro-elektrode een verschil in ionenconcentratie tussen de twee standen (figuur 3B) detecteert.- Bereken de ionenflux behulp Fick's wet van diffusie als hiervoor (stap 3.3.1).
- Herhaal de buffer meting voor het meten van een nieuw monster en herhaal de procedure van flux meting en berekening voor elke nieuwemonster.
6. Statistische analyse en presentatie van gegevens
- Test de onafhankelijke werking van de positie en / of van de tijd op ionfluxen onder controleconditie behulp van een ANCOVA model met gemengde effecten 28.
Opmerking: Analyse van covariantie (ANCOVA) is een algemeen lineair model dat mengt regelmatige ANOVA en regressie doordat zowel categorische en continue te nemen als onafhankelijke variabelen. Bovendien, in aanwezigheid van gecorreleerde fouten veroorzaakt door herhaalde metingen per individu en eventuele geneste effecten, gemengde effecten modellen worden gebruikt om nauwkeurige schattingen van zowel vaste als random effecten te modelleren. - Bereken paarsgewijze vergelijkingen met behulp van de Student t-test tussen de groep niveaus met Bonferroni correctie voor meerdere testen 28.
- Genereer boxplots om ion flux metingen samen te vatten op basis van positie en tijd. Omvat p waarden van de Student t paarsgewijze beschrevenhierboven (Figuur 3D) en vermeld significantie niveau van p-waarden als volgt: *: p <0,05; **: P <0,01; ***: P <0.001 29
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben eerder aangetoond dat calcium influx verschijnt na enkele cel verwonding 24. Daarom hebben we gevraagd of andere ion fluxen optreden bij enkele cel verwonding. We gebruikten de X. laevis eicel, een gevestigde model voor enkele cel wondgenezing 30-34 en elektrofysiologische opname 24,35-39. Interessant kaliumionen zijn geconcentreerd binnen X. laevis oöcyten (ongeveer 110 mM), 40 dan in de extracellulaire oplossing gebruikt (in MMR 1x: 1 mM) suggereert een efflux van kalium op verwonding. Om deze hypothese te bevestigen, maten we de kalium- flux tijdens X. laevis eicel celmembraan genezing met behulp van de ion-selectieve self-verwijzingen micro-elektrode.
Om de eicel wond, eerst een capillaire elektrode te trekken met een grote tip grootte (~ 50 micrometer). Bevestig de elektrode naar een rechte elektrode houder en monteren op een handmatige micro-klepstandsteller. Wond de oocyte door het aanraken van het membraan met de elektrode 24. Kort na verwonding detecteerden we een grote efflux van kalium (tot 250 nmol cm -2 s -1; Figuur 3B - D). Aangezien het membraan wond genas Deze flux afgenomen, terug naar verwonde flux waarden gezien in de intacte membraan (~ 5 nmol cm -2 s -1) als de wond genezen (tot 16 min na verwonding; Figuur 3B - D). ANCOVA bleek een significant effect tijd na verwonding op kalium fluxmetingen (p <0.001). Voeg hoc analyses aantoonden significant verhoogd kalium- efflux in 1-2 min (p <0,001) en bij 5-6 min (p <0,05), maar niet 15-16 min na verwonding in vergelijking met intacte celmembraan toestand (figuur 3D). Wij concludeerden dat bij enkele cel verwonding, verschijnt een efflux van kalium ter hoogte van de wonde die afnamen during de loop van de genezing.
| Ion | Ionofoor cocktail | Elektrolyt-oplossing (100 mM) | Referentie-oplossing (3 M) | Kunstmatige source-oplossing (1 M) |
| Ca 2+ | Calciumionofoor Ik Cocktail A (cat # 21048) | CaCl 2 2 H 2 O | KCl | CaCl 2 2 H 2 O |
| Na + | Sodium ionofoor II Cocktail A (cat # 71178) | NaCl | KCl | NaCl |
| Cl - | Chloride ionofoor Ik Cocktail A (cat # 24902) | NaCl | CH 2 CO 2 K (Kalium acetaat) | NaCl |
| K + | Kalium ionofoor Ik Cocktail A (cat # 60031) KCl | NaCl | KCl | |
| H + | Waterstof ionofoor Ik Cocktail A (cat # 95291) | pH 7,0 | KCl | pH 4,0 |
Tabel 1:. Voorbeelden van veelgebruikte ionofoor cocktails Ook getoond zijn passende oplossingen te plaatsen in de micro-elektroden, voor de kunstmatige bron en om te kalibreren. Catalogusnummers zijn afkomstig van Sigma-Aldrich.
Figuur 1:. Ionselectieve micro-elektroden (A) Schematische weergave van de ion-selectieve zichzelf verwijzende micro-elektrode-systeem. (B) Ion-selectieve micro-elektrode. (C) Referentie-elektrode. (D) Ion-uitwisseling tussen de externe oplossing en de microelectrode via de ionofoor. (E) Regeling van de meetkamer gebruikt voor X. laevis eicel.
Figuur 2: Ion-selectieve microelectrodes kalibratie, kunstmatige bron en flux berekening (A) IJkcurve.. (B) Vergelijking van de ijkkromme en berekening van de ionenconcentratie. (C) Berekening van de ionenflux. (D) ion flux gemeten op bepaalde afstanden van de kunstmatige stralingsbron (1 M KCl).
Figuur 3: Evolutie van de kalium-flux bij X. laevis eicel wond tijdens de genezing. (A) Foto en illustratie van de excursievan de ion-selectieve micro-elektrode meet ion concentratie X. laevis eicel wond; de gestippelde lijn tussen 'een' 'en' 'v' 'staat voor het dier-plantaardige as. (B) Illustratie van de variatie van kalium-ion concentratie X. laevis eicel wond tijdens de genezing. (C) Scatter (xy) grafiek die het gemiddelde en de standaardfout van kalium flux gemeten ter hoogte van de wonde op verschillende tijdstippen tijdens X. laevis eicel wondgenezing. (D) Boxplot geeft kalium flux gemeten ter hoogte van de wonde op verschillende tijdstippen tijdens X. laevis oöcyten wondgenezing (n = 16; p waarden aangeduid als volgt: *: p <0.05, ***: p <0.001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meest kritische stappen voor een succesvolle bepaling van extracellulair ion fluxen in vivo: het verminderen van het lawaai, de correcte fabricage van de ion-selectieve microelectrodes en referentie-elektrode, en de positionering van het monster en beide elektroden.
Om de ruis te minimaliseren, dient het registratiesysteem in een geaarde (geaard) Faraday kooi voorkeur met metaal bedekte (trillingsisolatie) tafel die ook geaard. Bovendien moet de microscoop chassis worden geaard. Bronnen van elektrische ruis onder de lichtbron. Een fiber-optic 'fan-less' lichtbron veroorzaakt minimale elektrische ruis. Tenslotte, houdt de zilverdraad en pellet in de micro-elektrode houders gechloreerd minimaliseert ruis (dip in natrium hypochloriet bleekmiddel en spoel in dH 2 O) .De aanwezigheid van luchtbellen in de ion-selectieve micro-elektrode of de referentie-elektrode kan meetfouten mislukking als degeleidbaarheid van de micro-elektrode zal nihil of gecompromitteerd zijn. Het is dus essentieel om de elektroden onder de microscoop te controleren alvorens ze aan te koppelen aan de houders. Zie het protocol voor gedetailleerde procedure om luchtbellen te verwijderen. De correcte positionering van zowel het monster als de microelectrodes nodig om betrouwbare en reproduceerbare resultaten. De meting van ionenflux is afhankelijk van de uitwijking van de micro-elektrode en zijn positie ten opzichte van het monster. Het is belangrijk om precies aan te geven het interessegebied die wordt gemeten aan het monster en plaats de micro-elektrode om een loodrechte beweging van het monster hebben. Elk uitwijking van de micro-elektroden op een manier die niet loodrecht op het monster zal resulteren in veranderde ionfluxen metingen en grotere variatie tussen monsters.
Ionofoor cocktails voor specifieke ionen te meten, bijvoorbeeld kalium, mag de aanwezigheid van andere ionen, zoals natrium detecteren.In het geval dat de meetoplossing bevat een grote hoeveelheid van een concurrerend ion voor de ionofoor cocktail, is het belangrijk om de selectiviteit van de ionofoor cocktail bepalen met behulp van de kunstmatige stralingsbron experiment. Hier, de oplossing wordt gebruikt om de cultuur X. laevis oöcyten (MMR) een hoge concentratie van natrium. Aldus is het belangrijk na te gaan of het kaliumzout ionofoor cocktail ook detecteert natrium. Via de kalium- ionofoor cocktail gevulde micro-elektrode, kunnen we proberen een natrium- flux meten met een kunstmatige bron die hoge natriumconcentratie bevat (1 M NaCl; zie Tabel 1) behoud van dezelfde meetoplossing. De chemische gradiënt bevordert de efflux natrium, maar idealiter sodium flux moeten worden gedetecteerd door kalium-specifieke ionofoor cocktail. Indien een belangrijke flux gemeten, dient de experimentele conditie worden geoptimaliseerd. Bijvoorbeeld zou de concentratie van de concurrerende ionen te worden verlaagd tot het punt waar de microelectrode niet meer zin dat, terwijl deze de natrium-flux door het plasmamembraan leiden tot mogelijke storingen tijdens kalium fluxmetingen kunnen beïnvloeden. Idealiter kan een correctiefactor berekend uit de kunstmatige stralingsbron experiment worden toegepast op de gegevens of andere ionofoor cocktail kan worden getest. Ionenflux metingen met de ionen-selectieve zelfverwijzende micro-electrode kan de meting van ionfluxen optreedt op cellen en weefsels in waterige oplossing. Metingen van ion fluxen in cellen of weefsels die normaal in contact met lucht omgeving vereist de aanwezigheid van een oplossing die niet van nature aanwezig in de omgeving en de ionflux en uitwisseling die onder normale omstandigheden kunnen veranderen. Bijzondere aandacht moet worden gegeven aan de inhoud van dergelijke oplossing definiëren en het minimaliseren van de afwijking van de oorspronkelijke, fysiologische omgeving. Het spectrum van ionen die kan worden gemeten door de ion-selectieve zichzelf verwijzende microelectrode techniek is afhankelijk van de beschikbaarheid en het bestaan van specifieke ionofoor cocktails selectief het ion van belang.
Ionenflux metingen uitgevoerd met de ion-selectieve zichzelf verwijzende micro-electrode worden uitgevoerd in oplossing, gewoonlijk nabij het oppervlak van cellen of weefsels, waarbij de niet-invasieve meting van extracellulair ion fluxen. Deze methode is het niet mogelijk de meting van ion fluxen in weefsels, tussen cel en intercellulaire ruimte. De ion-selectieve zichzelf verwijzende micro-elektrode is niet de enige methode die gemeten ionfluxen maakt in vivo. Een nieuwe alternatieve methode wordt fluorescente reporters bioelektriciteit 41 waarbij de meting van ionfluxen die niet mogelijk zijn via micro-elektroden mogelijk maakt. Deze kleurstoffen mogelijk metingen van ionen fluxen in weefsels en cellen en kan subcellulaire lokalisatie bereiken. Deze techniek kan ruimtelijke informatie van het ion flux binnenin weefsels en cellen, maar niet ion ex verwervenschakelen tussen het weefsel en de extracellulaire ruimte. Bovendien is de fluorescente reporters bio-elektriciteit genereren gewoonlijk semi-kwantitatieve data. Het gebruik van micro-electrode gebaseerde technologie ionfluxen gemeten, is nog geldig is en noodzakelijk en brengt aanvullende informatie over het gebruik van fluorescente reporters bioelektriciteit, waardoor ze complementair dan concurrerende technieken. Bovendien, interessante recente ontwikkelingen zijn amperometrische self-verwijzingen detectors van zuurstof, stikstofoxide en neurotransmitters dopamine en glutamaat 42,43. Amperometrische detectie is gebaseerd op een chemische reactie bij de sensor tip. Nieuwe fiber-optic micro-elektroden ("optrodes") ontwikkeld voor niet-invasieve metabolische zuurstofstroom 34,35 en pH 44 met hoge selectiviteit en gevoeligheid 45,46 meet. Er is nu ook een op enzymen gebaseerde nanodeeltjes bekleed probe gevoelig voor glucose 47.
We hebben gezien dat the ion-selectieve self-verwijzingen micro-elektrode maakt metingen van extracellulaire ion fluxen in vivo. Ionen worden niet alleen uitgewisseld tussen de cellen / weefsels en extracellulaire ruimte, maar ook tussen cellen en weefsels in levende organismen. Het is belangrijk om deze techniek te combineren met andere bio-elektriciteit zoals fluorescerende reporters om de ruimtelijke resolutie van het ion fluxen in weefsels waarderen naast de feitelijke metingen van de ionfluxen nabij het oppervlak. Bovendien ionfluxen een belangrijk onderdeel van de bio-elektrische toestand die cellen en weefsels definieert alsmede celmembraanpotentiaal, trans-epithelia potentiële of extracellulaire elektrische stromen. Belangrijk is, naast het meten van ionfluxen, te meten, in combinatie, celmembraan en trans-epitheel potentieel en extracellulaire elektrische stromen 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IonAmp | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Headstage pre-amplifier | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| MicroStep Driver | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Manual micropositioner | World Precision Instruments | Model KITE-R | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | Model M10 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Vibration isolation table | Newport Inc. | Model VW-3036-OPT-023040 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces | Newport Inc. | Model 360-90 | Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table |
| Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | none |
| Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | none |
| Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament | World Precision Instruments | TW150-4 | none |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | none |
| Metal rack | Made in-house | none | Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel |
| Oven | QL | Model 10 Lab Oven | none |
| Silanization solution I | Sigma-Aldrich | 85126 | Hazardous, handle as recommended by provider |
| Glass Petri dish; Pyrex | Fisher Scientific | 316060 | none |
| Electrode/micropipette storage jar | World Precision Instruments | E215 | none |
| Glass dessicator | Fisher Scientific | 08-595E | Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight. |
| Plastic Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11597722 | none |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | S97329 | none |
| Microscope slide | Sigma-Aldrich | S8902 | none |
| Straight microelectrode holder | Warner Instruments | QSW-A15P | with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire |
| Straight microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH3S | with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector |
| 6 cm Petri dish | VWR | 60872-306 | none |
| Nitex mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX750 | none |
| Glue; Loctite epoxy | VWR | 500043-451 | Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing |
| Deionized water | Sigma-Aldrich | 99053 | none |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | none |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | none |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | none |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | none |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | none |
| Sodium Hydroxyde | Sigma-Aldrich | S8045 | none |
| Potassium Acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | none |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | none |
References
- Weber, W. M., Liebold, K. M., Clauss, W. Amiloride-sensitive Na+ conductance in native Xenopus oocytes. Biochimica et biophysica acta. 1239, 201-206 (1995).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. Journal of cell science. 122, 4267-4276 (2009).
- Zhao, M. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Seminars in cell & developmental biology. 20, 674-682 (2009).
- Jaffe, L. F., Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. The Journal of cell biology. 63, 614-628 (1974).
- Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nature protocols. 2, 661-669 (2007).
- Reid, B., Zhao, M. Measurement of bioelectric current with a vibrating probe. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Moore, J. W. The patch clamp: single-channel recording. Science. 224, 50-51 (1984).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of visualized experiments. , (2008).
- McCaig, C. D., Robinson, K. R. The ontogeny of the transepidermal potential difference in frog embryos. Developmental biology. 90, 335-339 (1982).
- Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F. Detection of extracellular calcium gradients with a calcium-specific vibrating electrode. The Journal of cell biology. 110, 1565-1573 (1990).
- The use of the vibrating probe technique to study steady extracellular currents during pollen germination and tube growth. Fertilisation in Higher Plants: molecular and cytological aspects. Cai, G., Cresti, M., Moscatelli, A. , Springer-Verlag. 235-252 (1999).
- Kunkel, J. G., Xu, Y., Shipley, A. M., Feijó, J. A. The use of non-invasive ion-selective microelectrode techniques for the study of plant development. Plant Electrophysiology – Theory and Methods. (ed Volkov AG. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 109-137 (2006).
- Ordonez, N. M., Shabala, L., Gehring, C., Shabala, S. Noninvasive microelectrode ion flux estimation technique (MIFE) for the study of the regulation of root membrane transport by cyclic nucleotides. Methods in molecular biology. 1016, 95-106 (2013).
- Tegg, R. S., Melian, L., Wilson, C. R., Shabala, S. Plant cell growth and ion flux responses to the streptomycete phytotoxin thaxtomin A: calcium and hydrogen flux patterns revealed by the non-invasive MIFE technique. Plant & cell physiology. 46, 638-648 (2005).
- Newman, I. A. Ion transport in roots: measurement of fluxes using ion-selective microelectrodes to characterize transporter function. Plant, cell & environment. 24, 1-14 (2001).
- Kochian, L. V., Shaff, J. E., Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F., Lucas, W. J. Use of an extracellular, ion-selective, vibrating microelectrode system for the quantification of K(+), H (+), and Ca (2+) fluxes in maize roots and maize suspension cells. Planta. 188, 601-610 (1992).
- Doughty, J. M., Langton, P. D. Measurement of chloride flux associated with the myogenic response in rat cerebral arteries. The Journal of physiology. 534, 753-761 (2001).
- Messerli, M. A., Smith, P. J., Lewis, R. C., Robinson, K. R. Chloride fluxes in lily pollen tubes: a critical reevaluation. The Plant journal : for cell and molecular biology. 40, 799-812 (2004).
- Molina, A. J., et al. Neurotransmitter modulation of extracellular H+ fluxes from isolated retinal horizontal cells of the skate. The Journal of physiology. 560, 639-657 (2004).
- Marenzana, M., Shipley, A. M., Squitiero, P., Kunkel, J. G., Rubinacci, A. Bone as an ion exchange organ: evidence for instantaneous cell-dependent calcium efflux from bone not due to resorption. Bone. 37, 545-554 (2005).
- Lew, R. R. Ionic currents and ion fluxes in Neurospora crassa hyphae. Journal of experimental botany. 58, 3475-3481 (2007).
- Vieira, A. C., et al. Ionic components of electric current at rat corneal wounds. PloS one. 6, e17411 (2011).
- Luxardi, G., Reid, B., Maillard, P., Zhao, M. Single cell wound generates electric current circuit and cell membrane potential variations that requires calcium influx. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 6, 662-672 (2014).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. H. , (2007).
- Smith, P. J., Hammar, K., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Trimarchi, J. R. Self-referencing, non-invasive, ion selective electrode for single cell detection of trans-plasma membrane calcium flux. Microscopy research and technique. 46, 398-417 (1999).
- Messerli, M. A., Smith, P. J. Construction theory, and practical considerations for using self-referencing of Ca(2+)-selective microelectrodes for monitoring extracellular Ca(2+) gradients. Methods in cell biology. 99, 91-111 (2010).
- Chambers, J., Hastie, T., Pregibon, D. Ch. 48. Compstat. Momirović, K., Mildner, V. , Physica-Verlag HD. 317-321 (1990).
- Chambers, J. M., Cleveland, W. S., Kleiner, B., Tukey, P. A. Graphical methods for data analysis. , Wadsworth & Brooks/Cole. (1983).
- Burkel, B. M., Benink, H. A., Vaughan, E. M., von Dassow, G., Bement, W. M. A Rho GTPase signal treadmill backs a contractile array. Developmental cell. 23, 384-396 (2012).
- Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current biology : CB. 9, 579-587 (1999).
- Mandato, C. A., Bement, W. M. Contraction and polymerization cooperate to assemble and close actomyosin rings around Xenopus oocyte wounds. The Journal of cell biology. 154, 785-797 (2001).
- Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. The Journal of cell biology. 168, 429-439 (2005).
- Simon, C. M., Vaughan, E. M., Bement, W. M., Edelstein-Keshet, L. Pattern formation of Rho GTPases in single cell wound healing. Molecular biology of the cell. 24, 421-432 (2013).
- Petersen, C. C., Dupont, G. The initiation of a calcium signal in Xenopus oocytes. Cell calcium. 16, 391-403 (1994).
- Horisberger, J. D., Lemas, V., Kraehenbuhl, J. P., Rossier, B. C. Structure-function relationship of Na,K-ATPase. Annual review of physiology. 53, 565-584 (1991).
- Miledi, R. A calcium-dependent transient outward current in Xenopus laevis oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. London, England, , 491-497 (1982).
- Miledi, R., Parker, I. Chloride current induced by injection of calcium into Xenopus oocytes. The Journal of physiology. 357, 173-183 (1984).
- Parker, I., Miledi, R. A calcium-independent chloride current activated by hyperpolarization in Xenopus oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. 233, 191-199 (1988).
- Costa, P. F., Emilio, M. G., Fernandes, P. L., Ferreira, H. G., Ferreira, K. G. Determination of ionic permeability coefficients of the plasma membrane of Xenopus laevis oocytes under voltage clamp. The Journal of physiology. 413, 199-211 (1989).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 385-397 (2012).
- Porterfield, D. M. Measuring metabolism and biophysical flux in the tissue, cellular and sub-cellular domains: recent developments in self-referencing amperometry for physiological sensing. Biosensors. 22, 1186-1196 (2007).
- McLamore, E. S., et al. A self-referencing glutamate biosensor for measuring real time neuronal glutamate flux. Journal of neuroscience methods. 189, 14-22 (2010).
- Yin, M., et al. Highly sensitive and fast responsive fiber-optic modal interferometric pH sensor based on polyelectrolyte complex and polyelectrolyte self-assembled nanocoating. Analytical and bioanalytical chemistry. 399, 3623-3631 (2011).
- Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrode technology for non-invasive real-time measurement of biophysical flux and physiological sensing. The Analyst. 134, 2224-2232 (2009).
- McLamore, E. S., Jaroch, D., Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrodes for measuring spatially resolved, real-time metabolic oxygen flux in plant systems. Planta. 232, 1087-1099 (2010).
- McLamore, E. S., et al. A self referencing platinum nanoparticle decorated enzyme-based microbiosensor for real time measurement of physiological glucose transport. Biosensors & bioelectronics. 26, 2237-2245 (2011).
