Abstract
Les cellules provenant d'animaux, des plantes et des cellules individuelles sont entourées par une barrière dite de la membrane cellulaire qui sépare le cytoplasme de l'extérieur. des couches de cellules telles que les épithéliums forment également une barrière qui sépare l'intérieur ou de l'extérieur des compartiments différents d'organismes multicellulaires. Une caractéristique clé de ces obstacles est la répartition différentielle des ions à travers les membranes cellulaires ou des couches de cellules. Deux propriétés permettent cette distribution: 1) les membranes et les épithéliums afficher perméabilité sélective aux ions spécifiques; 2) les ions sont transportés à travers des pompes à travers les membranes cellulaires et les couches de cellules. Ces propriétés jouent un rôle crucial dans le maintien de la physiologie des tissus et agissent comme des signaux de signalisation après les dommages, lors de la réparation, ou sous condition pathologique. L'auto-microélectrode référence à sélectivité ionique permet la mesure de flux spécifiques des ions tels que calcium, de potassium ou de sodium à des niveaux de cellules et de tissus simples. Le microélectrodes contient un cocktail de ionophore qui estsélectivement perméable à un ion particulier. La solution de remplissage interne contient une concentration d'ensemble de l'ion d'intérêt. Le potentiel électrique de la micro-électrode est déterminée par la concentration à l'extérieur de l'ion. Comme la concentration en ions varie, le potentiel de la micro-électrode varie en fonction du logarithme de l'activité des ions. En cas de déplacement d'avant en arrière près d'une source ou un puits de l'ion (par exemple dans un gradient de concentration en raison de flux d'ions) le potentiel de microélectrodes fluctue à une amplitude proportionnel au flux d'ions / gradient. L'amplificateur amplifie le signal de micro-électrodes et dont la sortie est enregistré sur l'ordinateur. Le flux ionique peut alors être calculée par la loi de diffusion de Fick en utilisant l'électrode de potentiel de fluctuation, l'excursion de micro-électrodes, et d'autres paramètres tels que la mobilité d'ions spécifique. Dans cet article, nous décrivons en détail la méthodologie pour mesurer les flux d'ions extracellulaires en utilisant l'auto-référencement microélectrodes un sélective d'ionsD présenter quelques résultats représentatifs.
Introduction
Toutes les cellules animales sont entourées d'une membrane de bicouche lipidique, qui sépare le cytoplasme de l'environnement extérieur. La cellule maintient un potentiel de membrane électrique, négative à l'intérieur, par transport actif des ions 1. Le potentiel de membrane est une source d'énergie stockée qui peut utiliser la cellule pour faire fonctionner divers dispositifs moléculaires dans la membrane 2. Les neurones et les autres cellules excitables ont de grands potentiels de membrane. Ouverture rapide des canaux sodiques potentiel effondre la membrane (dépolarisation) et produit le potentiel d'action qui est transporté le long de la longueur du neurone 2. En plus de ces changements rapides électriques, de nombreux tissus et organes et à maintenir génèrent des potentiels électriques significatifs à long terme. Par exemple, la peau et la cornée épithélium génèrent et entretiennent potentiels trans-épithéliales et des courants électriques extracellulaires par le pompage des ions directionnelle (principalement de sodium et de chlorure) 3.
tente "> Bien que les mesures de courant électrique extracellulaire endogène en utilisant la sonde vibrante 6/4 et des mesures de la membrane ou trans-épithéliales potentiels à l'aide du système de micro-électrodes 7-10 permettre la mesure des paramètres électriques des membranes cellulaires et des couches de cellules épithéliales, ils ne donnent pas de indication de l'espèce d'ions concernés.Microélectrodes avec ionophore sélectif peuvent mesurer la concentration d'ions en solution spécifique. Gradients d'ions ou de flux peuvent être mesurés avec deux ou plusieurs électrodes à différentes positions. Cependant, la variation de la tension intrinsèque de chaque sonde serait différent, causant des mesures inexactes ou même la détection d'un gradient qui était absent. Une électrode unique est utilisé en mode "auto-référencement" grâce à quoi il se déplace à basse fréquence entre deux points permet de résoudre ce problème. Maintenant, le flux d'ions peut être vu dans le contexte d'une dérive du signal relativement lent et stable (voir la figure 3B). Le système de mesure sensible aux ions utilise microélectrodes auto-référence à sélectivité ionique pour détecter de petits flux extracellulaires des ions près des tissus ou des cellules individuelles. Le système est constitué d'un amplificateur qui traite le signal de la microélectrode et un micro-moteur pas à pas et le pilote pour commander le mouvement de la microélectrode. Le micro-électrodes à sélectivité ionique et l'électrode de référence qui ferment le circuit sont connectées à l'amplificateur par l'intermédiaire d'un pré-amplificateur headstage (figure 1A). Logiciels détermine les paramètres du mouvement de micro-électrodes (fréquence, distance) et enregistre également la sortie de l'amplificateur. Le moteur pas à pas commande le mouvement de micro-électrodes par l'intermédiaire d'un micropositionneur tridimensionnel. Une faible fréquence de vibration microélectrodes sélectives d'ions a été développé en 1990 pour mesurer le flux de calcium spécifique 11. Ainsi que du calcium, des cocktails ionophores commercialement accessibles sont maintenant disponibles pour faire MICRoelectrodes sensible au sodium, chlorure, potassium, l'hydrogène, le magnésium, le nitrate d'ammonium, le fluorure de lithium, ou du mercure.
Fondamentalement, la technique de micro-électrodes à sélectivité ionique auto-référencement convertit l'activité d'un ion spécifique dissous dans une solution à un potentiel électrique, qui peut être mesurée par un voltmètre. Le cocktail d'ionophore est un liquide non miscible (, organique lipophile) de phase ayant des propriétés d'échange d'ions. L'ionophore forme un complexe se lie sélectivement (ions spécifiques) et les transfère de façon réversible entre la solution aqueuse contenue dans la micro-électrode (électrolyte) et la solution aqueuse dans laquelle est immergée la microélectrode (Figure 1D). Ce transfert d'ions conduit à un équilibre électrochimique et une variation du potentiel électrique entre la micro-électrode et l'électrode de référence est mesurée par le voltmètre. La tension est proportionnelle au logarithme de l'activité spécifique d'ions selon la Nernst equation permettant le calcul de la concentration d'ions (Figure 2A et B).
À l'heure actuelle, plusieurs systèmes permettent la mesure du flux d'ions en utilisant un concept ou un principe similaire. Par exemple, l'électrode Technique Scanning Ion sélectif (SIET) 12,13 ou le (MIFE) technique microélectrodes Ion Flux Estimation développé par Newman et Shabala 14-16 sont disponibles dans le commerce et largement utilisé par la communauté de recherche afin de déterminer ion spécifique fondants se produisant à la membrane cellulaire et tissulaire à travers une variété d'animaux, de plantes et de modèles cellulaires de vie simples. Microélectrodes ioniques sélectives ont été utilisées pour mesurer l'hydrogène, le potassium et le flux de calcium dans les racines des plantes 17, le chlorure de flux dans rat artères cérébrales 18 et dans les tubes polliniques 19, flux d'hydrogène dans des cellules rétiniennes patin 20, le flux de calcium dans les os de la souris 21, divers ions flux dans hyphes 22 et dans rà 23 cornée, et enfin le flux de calcium pendant la plaie d'une cellule unique de guérison 12,24. Voir aussi le commentaire pour plus d'informations sur l'auto-référencement microélectrodes sélectives d'ions 25.
L'article suivant décrit en détail la façon de préparer et d'effectuer la mesure des flux d'ions extracellulaires endogènes en utilisant la technique de micro-électrodes ion-sélective auto-référencement au niveau de la cellule unique.
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Protocol
1. Ion sélectif auto-référencement microélectrodes Préparation
- Préparation de micro-électrodes à sélectivité ionique
- Chaleur tirer minces capillaires de borosilicate paroi sans filament (diamètre extérieur de 1,5 mm, 1,12 mm de diamètre interne) à l'aide d'un extracteur de microélectrodes.
Remarque: Cela donne des conseils 3-4 m de diamètre. Les petites pointes ont une résistance plus élevée qui le rend plus sensible aux micro-électrodes bruit électronique et est également associée à une réponse plus lente à un changement de concentration d'ions. Des informations utiles peuvent être trouvées dans le document publié par Smith et al. 26. - Silaniser les électrodes pour rendre la surface hydrophobe interne pour faciliter la rétention de l'ionophore cocktail lipophile. Placez les microélectrodes dans un support en métal et la chaleur O / N dans un four à> 100 ° C pour les sécher. Le rack est une plaque de métal avec des trous de 2 mm de diamètre foré partie du chemin à travers. Placer les électrodes dans les trous bascule vers le haut avec un 250 ml gbécher lass sur eux.
- Dans la matinée, éteindre le four et, tout en portant des gants isolants, retirez avec précaution le support en métal avec les électrodes et bécher en place. Fermez la porte du four pour conserver la chaleur.
- Porter des gants en latex ou en nitrile, blouse de laboratoire et une protection oculaire. Avec une pipette Pasteur en plastique, placer une goutte de solution de silanisation I à la base de chaque électrode (garder le bécher en place; utiliser le bec verseur pour l'accès de la pipette). La solution de silanisation est vaporisé par la plaque chauffante et silanizes l'intérieur des électrodes. Utilisez une hotte d'extraction chimique pour cette étape. Placer la grille / bécher / électrodes de retour dans le four chaud pendant quelques heures pour permettre à toute solution de silanisation restant à évaporer.
Remarque: Pour des raisons de sécurité, ne mettez pas le four en marche. Placer une étiquette sur le four qui indique qu'il ne doit pas être mis sous tension car elle peut contenir de la vapeur nocifs et inflammables. - Après refroidissement, stocker les microélectrodes dans un bocal insi de stockage de microélectrodesdé un dessiccateur en verre avec 400 g d'agent déshydratant. Microélectrodes peuvent être stockées ainsi pendant plusieurs semaines.
Note: Une méthode de silanisation alternatif est décrit dans Smith et al 26. - Retour-remplir la microélectrode de 50 à 100 pi (une longueur d'environ 1 cm) d'une solution contenant 100 mM de l'ion à mesurer (voir tableau 1 et figure 1B). Utilisez un plastique jetable pipette Pasteur chaleur tiré dans un brûleur Bunsen d'une amende filament. Rincer la pipette dans dH 2 O tard pour empêcher le blocage.
Remarque: En variante, ajuster la concentration en ions de la solution de remblayage pour correspondre à la concentration de l'ion dans la solution externe 27. - Observer la microélectrode sous un microscope à dissection pour assurer l'absence de bulles d'air.
- Si des bulles sont présentes robinet la microélectrode légèrement avec un ongle tout en maintenant l'électrode verticalement (pointe vers le bas) et / ou pousser la bulles à la pointe en appliquant une contre-pression à l'aide d'une seringue modifié avec un tube de silicone de remplacer l'aiguille.
- Tip-remplir la microélectrode de 15 à 20 nl (une longueur de 30-50 um) de spécifique-ion ionophore cocktail (voir le tableau 1). Placer une petite goutte de ionophore cocktail sur le bord court d'une lame de microscope. Observez la pointe de microélectrodes sous un microscope de dissection et le déplacer vers la lame de microscope jusqu'à ce que la pointe de microélectrodes touche le cocktail ionophore pour seulement environ un demi-sec. Dessinez le cocktail ionophore dans le microélectrodes par la pression capillaire.
Note: Eviter une longue colonne de ionophore cocktail car cela augmente la résistance électrique de la sonde qui peut le rendre sensible aux interférences électroniques (bruit) et ralentit également le temps de réponse. - Montez le microélectrodes dans un support de microélectrodes droite avec un 1 mm connecteur mâle de l'or et AgCl (Ag +) fil (figure 1B). </ Li>
- Fixer le support de micro-électrodes à l'étage de tête monté sur un micropositionneur électronique tridimensionnel commandé par ordinateur (figure 1A).
- Placez la pointe de microélectrodes dans la mesure de solution appropriée pour l'échantillon à mesurer (sérum physiologique, milieu de culture, etc.) pour permettre la microélectrode se stabiliser pendant une heure ou deux, ou même la nuit.
- Chaleur tirer minces capillaires de borosilicate paroi sans filament (diamètre extérieur de 1,5 mm, 1,12 mm de diamètre interne) à l'aide d'un extracteur de microélectrodes.
- Préparation de l'électrode de référence
- Les électrodes de référence (Figure 1C) sont les mêmes que ci-dessus capillaires. Couper le capillaire avec un crayon de diamant en 5 cm de longueur et le feu-brillant à chaque extrémité pour 1-2 sec dans un bec Bunsen.
- Remplir avec ces électrodes ~ 200 ul d'une solution 3 M de NaCl, CH 3 CO 2 K (acétate de potassium) ou de KCl avec 2% d'agarose. Choisissez la solution en fonction de l'ion à mesurer (l'électrode de référence ne doit pas contenir l'ion mesuré; voir le tableau 1). Mélangerl'agarose et la solution et on chauffe à l'ébullition presque dans un micro-ondes. Remuez pour dissoudre la gélose (la solution va clair).
- Fixez l'électrode de référence à une pipette Pasteur en plastique et tirer la solution chaude dans le capillaire.
- Déposer l'électrode dans le froid 3 M de NaCl, CH 3 CO 2 K ou d'une solution de KCl et le ranger dans cette solution 3 M dans des tubes scellés avant de les utiliser. Jeter les électrodes de référence avec des bulles d'air.
- Monter l'électrode de référence dans un support de microélectrodes droite culot (pré-remplie avec une solution 3 M) avec un AgCl (Ag +) à l'intérieur et une médaille d'or de 2 mm connecteur mâle (figure 1C) et fixer l'électrode et porte sur un micro-positionneur manuel monté sur un support magnétique.
2. Ion sélectif auto-référencement microélectrodes Calibration
- Préparation des solutions d'étalonnage contenant l'ion d'intérêt que dans la solution de référence; voir le tableau 1 (par exemple de milieux de culture, le sérum physiologique). Autrement dit, une solution d'étalonnage doit contenir une concentration plus faible de l'ion que dans la solution de mesure, et l'un plus élevé.
- Par exemple, utiliser une solution saline qui contient 1 mM de K +. Au support de cette concentration, on dissout la poudre dans de l'eau désionisée de KCl à une concentration de 10, 1 et 0,1 mM dans des dilutions en série. Utilisez ces solutions d'étalonnage. Sinon, utilisez au moins deux de ces solutions.
- Plonger la microélectrodes sélectives d'ions et l'électrode de référence dans chaque solution d'étalonnage et laissez la valeur de tension se stabiliser pendant 1 à 3 min avant d'enregistrer la tension correspondante en utilisant le logiciel dédié (voir le tableau 1).
- Comme le logiciel enregistre les données (de sortie de l'amplificateur) comme un fichier txt, copier les données dans un fichier tableur. Tracer la sortie de micro-électrodes (mV) en fonction du logarithme dela concentration molaire d'ions (Figure 2A).
- Appliquer une régression linéaire et calculer la pente de Nernst, intercepter et R valeur 2. Accepter la microélectrode si la pente de Nernst est de 58 ± 11 mV / décade pour les ions monovalents et 29 ± 11 mV / décade pour les ions bivalents (pour les cations, la pente de Nernst est positif, pour les anions elle est négative). De plus, les bons micro-électrodes doivent avoir une forte corrélation linéaire (R 2> 0,9; Figure 2B).
Remarque: La sortie mV de l'amplificateur utilisé ici donne lecture mV avec un gain de dix. Les valeurs doivent être divisée par un facteur de dix. - Utilisation de la formule de régression linéaire pour convertir la sortie mV brut de la microélectrode en concentration d'ions réelle (figure 2B).
3. Validation de la technique de microélectrodes Ion sélectif
- Préparation d'une source artificielle
- Capillaires sources artificielles sont les mêmes que les capillairesci-dessus. Chaleur tirer le capillaire à l'aide d'un extracteur de microélectrodes comme à l'étape 1.1.1.
- Remblai ces capillaires avec 200 ul d'une solution de NaCl, KCl 1 M, CaCl2 2 H 2 O ou un pH de 4 tampons. Choisir la solution de source artificielle en fonction de l'ion à mesurer (voir le tableau 1).
Remarque: vous pouvez tirer électrodes avec un plus grand diamètre pointe (~ 20 um) et pointe remplir avec les mêmes solutions, mais contenant 0,5-1% agarose (agarose permettra d'éviter tout écoulement masse de la solution). - Montez le capillaire de source artificielle sur un micromanipulateur et la plonger dans la solution utilisée pour mesurer le flux de l'ion dans les échantillons. Laisser la source artificielle dans la solution pendant 30 min à 1 h pour permettre la stabilisation de la pente.
- Validation de la micro-électrode sélective d'ions
- Immerger la microélectrode sélective d'ions d'environ un centimètre de distance à partir de la source artificielle capillaire dans la solution utilisée pour mesure le flux d'ions sur les échantillons et fermer le circuit avec l'électrode de référence comme avant. Soit la valeur de la tension à stabiliser pendant 1 à 3 minutes avant l'enregistrement de la tension correspondant à l'aide du logiciel dédié pendant 1 à 2 min. Cette valeur correspond à la valeur de la mémoire tampon (dans la littérature a également évoqué comme référence, de fond ou de la valeur à blanc).
- Déplacer la microélectrode sélective d'ions à environ 5 um à partir de la source artificielle et soit la valeur de tension pour stabiliser 1 à 3 minutes avant l'enregistrement de la tension correspondant à l'aide du logiciel pendant 1 à 2 min.
- Répéter la procédure ci-dessus en plaçant l'ion sélectif microélectrode à 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 et 1 280 um à une distance capillaire de la source artificielle.
- Extraire les données dans un fichier txt et copier les valeurs dans une feuille de calcul.
- Calculer la concentration en ions correspondant aux valeurs mV de la même façon que pour les valeurs de calibrage. Tracer la valeur.
Nonte: Si un flux d'ions est présente, la microélectrode détecte une différence de concentration d'ions entre les deux positions (figure 3B). Si la source artificielle contient plus d'ions de l'espèce mesurée de la solution, la concentration doit être supérieure à proximité de la source de loin, la validation de la capacité du micro-électrode sélective d'ions à détecter correctement la direction d'un flux d'ions (dans ce cas, efflux; pour un évier artificielle, avec la concentration d'ions spécifique inférieur milieu de mesure, il devrait être afflux).- Calculer le flux d'ions en utilisant la loi de diffusion de Fick: J = c μ (dc / dx) où c est la concentration d'ions dans la solution (mol cm -3), μ est la mobilité d'ions (mole cm N -1 s -1) et dc est la différence de concentration au-dessus de distance dx (cm) (figure 2C). Les données de flux d'ions sont habituellement présentés en pmol cm -2 s-1 Cm -2 ou nmol sec -1.
Remarque:.. Une autre méthode de calcul de flux d'ions décrite par Smith et al 26 peut être utilisé. Les différences comprennent l'utilisation du coefficient de diffusion au lieu de la mobilité des ions et la soustraction de l'arrière-plan du flux d'ions (aussi dériver tension ou le facteur de correction) calculé à partir de la mesure du flux d'ions dans une solution saline sans échantillon. - Tracer la moyenne des flux d'ions de chaque étape sur la distance de la source (figure 2D). Se déplacer loin de la source, d'observer une décroissance exponentielle de la valeur du flux validation de la capacité du micro-électrode à sélectivité ionique pour détecter grandeur différente de flux d'ions.
- Faites la validation de la source artificielle une fois pour chaque ion spécifique destinée à être enregistrée afin de valider ses sens et l'ampleur des mesures correctes avec un grand n signal-ratio d'oise.
Note: Ion mesure de flux de la mémoire tampon sans échantillons indique le niveau ou bruit de fond. Typiquement, la mesure de la mémoire tampon montre pas de fluctuation claire de la concentration d'ions conduisant à très faible flux qui affiche des directions variables.
- Calculer le flux d'ions en utilisant la loi de diffusion de Fick: J = c μ (dc / dx) où c est la concentration d'ions dans la solution (mol cm -3), μ est la mobilité d'ions (mole cm N -1 s -1) et dc est la différence de concentration au-dessus de distance dx (cm) (figure 2C). Les données de flux d'ions sont habituellement présentés en pmol cm -2 s-1 Cm -2 ou nmol sec -1.
4. Préparation de la Chambre de mesure
Remarque: Avant d'expériences, envisager l'échantillon à mesurer et comment l'échantillon doit être monté et immobilisé pour des mesures de microélectrodes.
- Pour Xenopus laevis mesures d'ovocytes couper un carré de 1 cm d'une maille de 800 um de nylon (Nitex mesh) et le coller dans une boîte de Petri en plastique (figure 1E).
5. Flux mesure Ion
- Mesurer la concentration d'ions présents dans le tampon utilisé pour effectuer les mesures sur l'échantillon de la même manière que pour la solution d'étalonnage. X. laevis ovocytes exigent Ringer modification de Mark (ROR). RÉissolve NaCl, KCl, CaCl, et HEPES MgCl dans de l'eau désionisée pour atteindre une concentration finale de (mM): NaCl 100, KCl 2, CaCl 2, MgCl 1 et 5 HEPES. Ajuster le pH du tampon à 7,5 en utilisant du NaOH.
- Placer l'échantillon dans la chambre de mesure et pour apporter le micro-électrode sélective d'ions à proximité de l'échantillon (environ 10 pm environ) en utilisant le micropositionneur pour définir la position proche de la microélectrode (figure 3A).
- Lancer l'excursion basse fréquence (0,3 Hz) (100 um) de la micro-électrode entre la position rapprochée et une position éloignée de l'échantillon (à distance) à l'aide du logiciel dédié. Assurez-vous que le mouvement de la microélectrode est perpendiculaire à la surface de l'échantillon.
Remarque: L'excursion de la microélectrode peut être réglé sur le logiciel. Grand excursion augmente le gradient de lecture permettant une détection plus facile des petites flux pendant le temps de mesure allonge l'intervalle d'échantillonnage et diminue la résolution temporelle. Voir- Lancer l'enregistrement à l'aide du logiciel. La microélectrode fait une pause au niveau de chaque position et le potentiel électrique en mV est enregistré sur l'ordinateur. Obtenir des mesures pendant au moins 2 min, ce qui permet la stabilisation de signal. Pour les courtes expériences time-lapse, fiche variations potentielles à la position de l'intérêt pour l'ensemble du cours du temps.
- Extraire les données dans un fichier txt et copier les valeurs dans une feuille de calcul.
- Calculer la concentration en ions correspondant aux valeurs mV de la même façon que pour les valeurs de calibrage. Tracer la valeur.
Remarque: si un flux d'ions est présente, la microélectrode détecte une différence de concentration d'ions entre les deux positions (figure 3B).- Calculer le flux d'ions en utilisant la loi de diffusion de Fick que précédemment (étape 3.3.1).
- Répéter la mesure de la mémoire tampon avant de mesurer un nouvel échantillon et répéter la procédure de mesure de flux et de calcul pour chaque nouveauéchantillon.
6. Analyse statistique et présentation des données
- Testez les effets indépendants de la position et / ou du temps sur les flux d'ions sous la condition de commande en utilisant un modèle d'analyse de covariance avec des effets mixtes 28.
Remarque: L'analyse de covariance (ANCOVA) est un modèle linéaire général qui mêle régulière ANOVA et de régression en permettant des mesures à la fois qualitatives et continues à être utilisés comme variables indépendantes. En outre, en présence d'erreurs corrélées induits par des mesures répétées par des effets imbriqués individuels et éventuels, les modèles à effets mixtes sont utilisés pour modéliser des estimations précises des deux effets fixes et aléatoires. - Calculer les comparaisons par paires à l'aide de t -test des étudiants entre les niveaux de groupe avec correction de Bonferroni pour les tests multiples 28.
- Générer des boîtes à moustaches pour résumer mesures de flux ionique selon la position et l'heure. Inclure les valeurs de p de la paire de Student décritci-dessus (Figure 3D) et indiquer les niveaux de p valeurs de signification comme suit: *: p <0,05; **: P <0,01; ***: P <0,001 29
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Representative Results
Nous avons précédemment montré que l'afflux de calcium apparaît après une seule cellule 24 blessés. Nous avons donc demandé si d'autres flux d'ions se produisent lors d'une lésion d'une cellule unique. Nous avons utilisé le X. laevis ovocytes, un modèle bien établi pour la cellule cicatrisation seule 30-34 et l'enregistrement électrophysiologique 24,35-39. Fait intéressant, les ions potassium sont plus concentrées à l'intérieur de X. laevis ovocytes (environ 110 mm) 40 que dans la solution extracellulaire utilisée (RMM 1x: 1 mM) suggérant un efflux de potassium lors d'une lésion. Afin de confirmer cette hypothèse, nous avons mesuré le flux de potassium dans le cadre de X. laevis cicatrisation de la membrane cellulaire en utilisant des ovocytes de l'auto-référencement microélectrode sélective d'ions.
Pour blesser l'ovocyte, tirez d'abord une électrode capillaire avec une grande taille de la pointe (~ 50 um). Fixez l'électrode à un porte-électrode droite et monter sur un micro-positionneur manuel. Blesser la oocyte en touchant la membrane avec la pointe d'électrode 24. Peu de temps après, nous avons détecté blessant un grand efflux de potassium (jusqu'à 250 nmol cm -2 s -1; Figure 3b - D). Comme la plaie guérie de la membrane, ce flux a diminué, revenant à des valeurs non blessés flux observés dans la membrane intacte (~ 5 nmol cm -2 s -1) lorsque la plaie a guéri (jusqu'à 16 min après la blessure; Figure 3b - D). ANCOVA a révélé un effet significatif de temps après la blessure sur des mesures de flux de potassium (p <0,001). Les analyses post hoc a révélé une augmentation significative efflux de potassium à 1-2 min (p <0,001) et à 5-6 min (p <0,05), mais pas de 15 à 16 min après la lésion par rapport à l'état intact de la membrane cellulaire (figure 3D). Nous avons conclu que lors d'une lésion d'une cellule unique, un efflux de potassium apparaît au niveau de la plaie qui diminuent Dusonner le cours de guérison.
| Ion | Ionophore cocktail | Solution d'électrolyte (100 mM) | Solution de référence (3 M) | Solution source artificielle (1 M) |
| Ca 2+ | Calcium Ionophore je Cocktail A (cat # 21048) | CaCl 2, 2H 2 O | KCl | CaCl 2, 2H 2 O |
| Na + | Sodium Ionophore II Cocktail A (cat # 71178) | NaCl | KCl | NaCl |
| Cl - | Chloride Ionophore je Cocktail A (cat # 24902) | NaCl | CH 2 CO 2 K (acétate de potassium) | NaCl |
| K + | Potassium Ionophore je Cocktail A (cat # 60031) KCl | NaCl | KCl | |
| H + | Hydrogène Ionophore je Cocktail A (cat # 95291) | pH 7,0 | KCl | pH 4,0 |
Tableau 1:. Des exemples de cocktails ionophores couramment utilisés sont également représentés des solutions appropriées à placer dans les microélectrodes, pour la source artificielle et pour effectuer le calibrage. Les numéros de catalogue sont de Sigma-Aldrich.
Figure 1:. Microélectrodes sélectives d'ions (A) Représentation schématique du système de micro-électrodes auto-référence à sélectivité ionique. Microélectrodes (B) Ion sélectif. (C) l'électrode de référence. (D) d'échange d'ions entre la solution externe et la Microelectrode par l'ionophore. (E) Schéma de la chambre de mesure utilisé pour X. laevis oocyte.
Figure 2: microélectrodes sélectives aux ions étalonnage, source artificielle et de calcul de flux (A) de la courbe d'étalonnage.. (B) L'équation de la courbe d'étalonnage et le calcul de la concentration d'ions. (C) Calcul du flux d'ions. (D) Ion flux mesuré à des distances spécifiques de la source artificielle (1 M KCl).
Figure 3: Evolution du flux de potassium à X. laevis blessure pendant la guérison. (A) la photographie et de l'illustration de l'excursionde la micro-électrode sélective d'ions à mesurer la concentration d'ions à X. laevis oocytes plaie; la ligne en pointillés entre '' une '' et '' V '' représente l'axe animal-végétatif. (B) Illustration de la variation de la concentration en ions potassium à X. laevis oocytes blessure pendant la guérison. (C) Scatter (xy) graphique montrant la moyenne et l'erreur standard de mesure de flux de potassium au niveau de la plaie à différents moments au cours X. laevis ovocytes cicatrisation. (D) Boxplot montrant la mesure de flux de potassium au niveau de la plaie à différents moments au cours de X. laevis ovocytes cicatrisation de la plaie (n = 16; p valeurs indiquées comme suit: *: p <0,05; ***: p <0,001).
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Discussion
Les étapes les plus critiques pour la mesure réussie de flux ioniques extracellulaires in vivo sont les suivants: la réduction du bruit, la fabrication correcte du microélectrodes référence et électrode à sélectivité ionique, et le positionnement de l'échantillon et les deux électrodes.
Afin de minimiser le bruit, le système d'enregistrement doit être mis à la terre dans un (terre) de préférence cage de Faraday avec un (isolation des vibrations) surmonté tableau-métallique qui est également relié à la terre. En outre, le châssis du microscope doit également être mis à la terre. Les sources de bruit électrique comprennent la source de lumière. Une source de lumière à fibre optique 'ventilateur-moins »provoque un bruit électrique minimale. Enfin, en gardant le fil d'argent et de culot dans la microélectrode détenteurs chlorée également minimise le bruit (plongeon dans l'hypochlorite de sodium eau de Javel et rincer à dH 2 O) .La présence de bulles d'air dans la microélectrode sélective d'ions ou dans l'électrode de référence se traduira par la mesure l'échec comme laconductivité de la microélectrode sera nul ou compromis. Ainsi, il est crucial de vérifier les électrodes sous le microscope avant de les monter sur les titulaires. Voir le protocole de procédure détaillée pour éliminer les bulles d'air. Le positionnement correct de l'échantillon et les microélectrodes sont nécessaires pour obtenir des résultats fiables et reproductibles. La mesure du flux d'ions dépend de l'excursion de la microélectrode et sa position par rapport à l'échantillon. Il est important d'identifier précisément la zone d'intérêt qui sera mesurée sur l'échantillon et la position de la microélectrode d'avoir un mouvement perpendiculaire à partir de l'échantillon. Toute excursion de microélectrodes d'une manière qui ne soit pas perpendiculaire à l'échantillon se traduira par ions modifiée fondants mesures et augmentation de la variabilité entre les échantillons.
Cocktails ionophore réservés pour mesurer des ions spécifiques, par exemple le potassium, peuvent également détecter la présence d'autres ions tels que le sodium.Dans le cas où la solution de mesure contient une grande quantité d'un ion en compétition pour le cocktail d'antibiotiques ionophores, il est important de déterminer la sélectivité de l'ionophore de cocktail en utilisant l'expérience de la source artificielle. Ici, la solution utilisée pour la culture X. laevis ovocytes (ROR) contient une forte concentration de sodium. Ainsi, il est important d'évaluer si le cocktail de ionophore de potassium utilisé également détecte sodium. En utilisant le microélectrodes ionophore de potassium cocktail rempli, nous pouvons tenter de mesurer un flux de sodium en utilisant une source artificielle qui contient une forte concentration de sodium (NaCl 1 M; voir le tableau 1) en gardant la même solution de mesure. Le gradient chimique favorise l'efflux de sodium, mais pas idéalement flux de sodium doit être détectée par l'ionophore spécifique de cocktail de potassium. Si un flux significatif est mesurée, la condition expérimentale doit être optimisée. Par exemple, la concentration de l'ion concurrence pourrait être abaissé vers le bas au point le microelectrode ne sent pas plus, alors que cela peut affecter le flux de sodium à travers la membrane plasmatique conduisant à des interférences possibles lors des mesures de flux de potassium. Idéalement, un facteur de correction calculé à partir de l'expérience de la source artificielle peut être appliquée aux données, ou un autre ionophore cocktail peut être testée. Ion Flux mesures en utilisant les microélectrodes autoréférençantes ion-sélective permettent la mesure de flux d'ions se produisant au niveau des cellules et des tissus dans une solution aqueuse. Les mesures de flux d'ions dans des cellules ou tissus qui sont normalement en contact avec un environnement d'air nécessite la présence d'une solution qui est non naturellement présents dans leur environnement et qui peut modifier le flux d'ions et d'échange qui se produit dans des conditions normales. Une attention particulière doit être faite pour définir le contenu de cette solution et de réduire l'écart de l'environnement physiologique d'origine. Le spectre d'ions qui peut être mesurée par les microele auto-référence à sélectivité ioniquectrode technique dépend de la disponibilité et de l'existence de cocktails ionophores sélectifs spécifiques à l'ion d'intérêt.
Ion mesures de flux réalisées avec l'auto-microélectrode référence à sélectivité ionique est réalisé en solution, généralement près de la surface de cellules ou de tissus, ce qui permet la mesure non invasive de flux ioniques extracellulaires. Cette méthode ne permet pas la mesure de flux d'ions à l'intérieur des tissus, entre les cellules et dans l'espace intercellulaire. L'auto-microélectrode référence à sélectivité ionique est pas la seule méthode qui permet la mesure de flux d'ions in vivo. Une nouvelle méthode alternative utilise journalistes de bioélectricité fluorescents 41 qui permet la mesure de flux d'ions qui ne sont pas possible au moyen de microélectrodes. Ces colorants permettent des mesures de flux des ions à l'intérieur de tissus et de cellules et peuvent atteindre localisation subcellulaire. Cette technique peut acquérir des informations spatiales du flux d'ions à l'intérieur des tissus et des cellules, mais pas ex ionchanger entre le tissu et l'espace extracellulaire. En outre, les journalistes de la bioélectricité fluorescentes génèrent généralement des données semi-quantitatives. L'utilisation de la technologie à base de microélectrodes à mesurer les flux d'ions est toujours valable et nécessaire et apporte des informations supplémentaires pour l'utilisation de reporters de bioélectricité fluorescentes, les rendant complémentaires plutôt que concurrentes techniques. En outre, des développements intéressants dernières comprennent des détecteurs ampérométriques auto-référencement de l'oxygène, l'oxyde nitrique et neurotransmetteurs dopamine et le glutamate 42,43. Détection ampérométrique est basé sur une réaction chimique à l'extrémité du capteur. Nouveaux microélectrodes de fibre optique ("optrodes") ont été développés pour mesurer de manière non invasive flux d'oxygène métabolique 34,35 et pH 44 avec une haute sélectivité et la sensibilité 45,46. Il est maintenant aussi une sonde de nanoparticule revêtue à base d'enzymes sensibles au glucose 47.
Nous avons vu que ee ion-sélective auto-référencement microélectrodes permet des mesures de flux d'ions extracellulaires in vivo. Les ions sont non seulement échangés entre les cellules / tissus et l'espace extracellulaire, mais aussi entre les cellules et les tissus dans les organismes vivants. Il est important de combiner cette technique avec les autres comme reporters fluorescents bioélectricité pour apprécier la résolution spatiale du flux d'ions à l'intérieur de tissus en plus des mesures réelles des flux d'ions à proximité de sa surface. En outre, les flux ioniques représentent une partie importante de l'état bioélectrique qui définit les cellules et les tissus avec un potentiel de membrane cellulaire, le potentiel trans-épithéliums ou courants électriques extracellulaires. Il est important, en plus de la mesure du flux d'ions, pour mesurer, en combinaison, la membrane cellulaire et le potentiel trans-épithélium ainsi que les courants électriques 24 extracellulaires.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IonAmp | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Headstage pre-amplifier | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| MicroStep Driver | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Manual micropositioner | World Precision Instruments | Model KITE-R | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | Model M10 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Vibration isolation table | Newport Inc. | Model VW-3036-OPT-023040 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces | Newport Inc. | Model 360-90 | Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table |
| Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | none |
| Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | none |
| Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament | World Precision Instruments | TW150-4 | none |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | none |
| Metal rack | Made in-house | none | Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel |
| Oven | QL | Model 10 Lab Oven | none |
| Silanization solution I | Sigma-Aldrich | 85126 | Hazardous, handle as recommended by provider |
| Glass Petri dish; Pyrex | Fisher Scientific | 316060 | none |
| Electrode/micropipette storage jar | World Precision Instruments | E215 | none |
| Glass dessicator | Fisher Scientific | 08-595E | Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight. |
| Plastic Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11597722 | none |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | S97329 | none |
| Microscope slide | Sigma-Aldrich | S8902 | none |
| Straight microelectrode holder | Warner Instruments | QSW-A15P | with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire |
| Straight microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH3S | with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector |
| 6 cm Petri dish | VWR | 60872-306 | none |
| Nitex mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX750 | none |
| Glue; Loctite epoxy | VWR | 500043-451 | Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing |
| Deionized water | Sigma-Aldrich | 99053 | none |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | none |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | none |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | none |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | none |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | none |
| Sodium Hydroxyde | Sigma-Aldrich | S8045 | none |
| Potassium Acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | none |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | none |
References
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