Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

आयन चयनात्मक स्व संदर्भित Microelectrode तकनीक का प्रयोग कोशिकी आयन अपशिष्टों का मापन

Published: May 3, 2015 doi: 10.3791/52782
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1,4
1Department of Dermatology, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis, 2Departamento de Biologia, Centro de Biologia Molecular e Ambiental, Universidade do Minho, 3Department of Neurology and Center for Neuroscience, University of California, Davis Imaging of Dementia and Aging Laboratory, 4Department of Ophthalmology, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis

Abstract

जानवरों, पौधों और एकल कक्षों से कोशिकाओं के बाहर से कोशिका द्रव्य है कि अलग कोशिका झिल्ली नामक एक बाधा से संलग्न हैं। ऐसे epithelia के रूप में सेल परतों को भी बाहर या बहुकोशिकीय जीव के विभिन्न डिब्बों से अंदर अलग करती है कि एक बाधा के रूप में। इन बाधाओं की एक प्रमुख विशेषता कोशिका झिल्ली या सेल परतों में आयनों के अंतर वितरण है। दो गुण इस वितरण की अनुमति: 1) झिल्ली और epithelia विशिष्ट आयनों को चयनात्मक पारगम्यता प्रदर्शित; 2) आयनों कोशिका झिल्ली और सेल परतों में पंप के माध्यम से ले जाया जाता है। इन गुणों के ऊतक शरीर क्रिया विज्ञान को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और मरम्मत के दौरान, क्षति के बाद संकेतों के संकेत के रूप में कार्य, या रोग की स्थिति के अंतर्गत। आयन चयनात्मक स्वयं को संदर्भित microelectrode ऐसे एकल कोशिका और ऊतक स्तरों पर कैल्शियम, पोटेशियम या सोडियम के रूप में आयनों की विशिष्ट अपशिष्टों के मापन के लिए अनुमति देता है। microelectrode है जो एक ionophore कॉकटेल होता हैएक विशिष्ट आयन करने के लिए चुनिंदा पारगम्य। आंतरिक भरने समाधान हित के आयन का एक सेट एकाग्रता है। microelectrode के बिजली के संभावित आयन के बाहर एकाग्रता से निर्धारित होता है। आयन एकाग्रता भिन्न होता है के रूप में, microelectrode के संभावित आयन की गतिविधि के प्रवेश के एक समारोह के रूप में बदल जाता है। (कारण आयन प्रवाह करने के लिए एक एकाग्रता ढाल में आईई) के आगे और पीछे आयन का एक स्रोत या सिंक के पास ले जाया गया, जब microelectrode के संभावित आयन प्रवाह / ढाल करने के लिए आनुपातिक एक आयाम में उतार चढ़ाव होता रहता। एम्पलीफायर microelectrode के संकेत amplifies और उत्पादन कंप्यूटर पर दर्ज की गई है। आयन प्रवाह तो ऐसे विशिष्ट आयन गतिशीलता के रूप में इलेक्ट्रोड संभावित उतार-चढ़ाव, microelectrode के भ्रमण, और अन्य मापदंडों का उपयोग प्रसार के Fick का कानून द्वारा गणना की जा सकती है। इस पत्र में, हम आयन चयनात्मक स्वयं को संदर्भित microelectrode एक का उपयोग कर कोशिकी आयन अपशिष्टों को मापने के लिए कार्यप्रणाली विस्तार से वर्णनकुछ प्रतिनिधि परिणाम पेश चाहते हैं।

Introduction

सभी पशु कोशिकाओं के बाहर के वातावरण से कोशिका द्रव्य अलग करती है जो एक लिपिड bilayer झिल्ली से घिरे हैं। सेल आयनों 1 के सक्रिय परिवहन के द्वारा, अंदर एक बिजली झिल्ली क्षमता, नकारात्मक रखता है। झिल्ली क्षमता कोशिका झिल्ली 2 में विभिन्न आणविक उपकरणों संचालित करने के लिए उपयोग कर सकते हैं जो एक संग्रहित ऊर्जा स्रोत है। न्यूरॉन्स और अन्य उत्तेजनीय कोशिकाओं बड़े झिल्ली क्षमता है। सोडियम चैनल की रैपिड उद्घाटन झिल्ली क्षमता (विध्रुवण) गिर और न्यूरॉन 2 की लंबाई के साथ ले जाया जाता है, जो संभावित कार्रवाई पैदा करता है। एक तरफ इन तेजी से बिजली के परिवर्तन से, कई ऊतकों और अंगों पैदा करते हैं और महत्वपूर्ण दीर्घकालिक बिजली क्षमता बनाए रखने के लिए। उदाहरण के लिए, त्वचा और कॉर्निया epithelia पैदा करते हैं और आयनों की दिशात्मक पंप (मुख्य रूप से सोडियम और क्लोराइड) 3 से पार उपकला क्षमता और बाह्य बिजली की धाराओं बनाए रखें।

अंतर्जात कोशिकी विद्युत प्रवाह की माप हिल जांच 4-6 और कोशिका झिल्ली और उपकला कोशिका परतों के बिजली के मानकों की माप की अनुमति microelectrode प्रणाली 7-10 का उपयोग कर झिल्ली या पार उपकला क्षमता के माप का उपयोग करते समय तम्बू ">, वे कोई दे शामिल आयन प्रजातियों का संकेत है।

चयनात्मक ionophore साथ microelectrodes समाधान में विशिष्ट आयन एकाग्रता उपाय कर सकते हैं। आयन ढ़ाल या प्रवाह विभिन्न पदों पर दो या दो से अधिक इलेक्ट्रोड से मापा जा सकता है। हालांकि, हर जांच के आंतरिक वोल्टेज बहाव, अलग होना गलत माप या मौजूद नहीं था कि एक ढाल का भी पता लगाने के कारण होता है। यह दो बिंदुओं के बीच कम आवृत्ति पर चलता रहता है जिससे "आत्म संदर्भित" मोड में इस्तेमाल एक एकल इलेक्ट्रोड इस समस्या को हल करती है। अब आयन प्रवाह एक अपेक्षाकृत धीमी और स्थिर संकेत बहाव की पृष्ठभूमि के खिलाफ देखा जा सकता है (3B चित्रा देखें)। आयन के प्रति संवेदनशील माप प्रणाली के ऊतकों या एकल कक्षों के करीब आयनों के छोटे कोशिकी अपशिष्टों का पता लगाने के आयन चयनात्मक स्वयं को संदर्भित microelectrodes का उपयोग करता है। प्रणाली microelectrode की गति को नियंत्रित करने के लिए microelectrode और एक माइक्रो stepper मोटर और ड्राइवर से संकेत प्रक्रियाओं जो एक एम्पलीफायर के होते हैं। सर्किट कि करीब आयन चयनात्मक microelectrode और संदर्भ इलेक्ट्रोड एक headstage के पूर्व एम्पलीफायर (चित्रा 1 ए) के माध्यम से एम्पलीफायर से जुड़े हैं। कम्प्यूटर सॉफ्टवेयर microelectrode के आंदोलन (आवृत्ति, दूरी) के मापदंडों का निर्धारण करता है और यह भी एम्पलीफायर के उत्पादन रिकॉर्ड करता है। stepper मोटर एक तीन आयामी micropositioner के माध्यम से microelectrode के आंदोलन को नियंत्रित करता है। आयन चयनात्मक microelectrode हिल एक कम आवृत्ति पहले विशिष्ट कैल्शियम प्रवाह 11 को मापने के लिए 1990 में विकसित किया गया था। के रूप में अच्छी तरह से कैल्शियम के रूप में, व्यावसायिक रूप से सुलभ ionophore कॉकटेल अब माइकर बनाने के लिए उपलब्ध हैंoelectrodes सोडियम, क्लोराइड, पोटेशियम, हाइड्रोजन, मैग्नीशियम, नाइट्रेट, अमोनियम, फ्लोराइड, लिथियम या पारा के प्रति संवेदनशील।

असल में, स्वयं को संदर्भित आयन चयनात्मक microelectrode तकनीक एक वोल्टमीटर से मापा जा सकता है, जो एक बिजली क्षमता में एक समाधान में भंग एक विशिष्ट आयन की गतिविधि धर्मान्तरित। ionophore कॉकटेल एक अमिश्रणीय तरल आयन एक्सचेंज गुणों के साथ (जैविक, lipophilic) चरण है। ionophore चुनिंदा (बांध) विशिष्ट आयनों reversibly और microelectrode (इलेक्ट्रोलाइट) में निहित जलीय घोल और microelectrode डूब जाता है, जिसमें जलीय घोल (चित्रा -1) के बीच स्थानान्तरण उन्हें परिसरों। इस आयन हस्तांतरण एक विद्युत संतुलन की ओर जाता है और microelectrode और संदर्भ इलेक्ट्रोड के बीच बिजली की क्षमता का एक भिन्नता वोल्टमीटर से मापा जाता है। वोल्टेज नेर्न्स्ट ई के अनुसार विशिष्ट आयन की गतिविधि के लघुगणक के लिए आनुपातिक हैआयन एकाग्रता (2A चित्रा और बी) की गणना की इजाजत दी quation।

वर्तमान में, कई प्रणालियों एक इसी तरह की अवधारणा या सिद्धांत का उपयोग कर आयन प्रवाह की माप अनुमति देते हैं। उदाहरण के लिए, न्यूमैन और Shabala 14-16 द्वारा विकसित की स्कैनिंग आयन चयनात्मक इलेक्ट्रोड तकनीक (एस आई इ टी) 12,13 या Microelectrode आयन फ्लक्स आकलन (MIFE) तकनीक का व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और व्यापक रूप से विशिष्ट आयन निर्धारित करने के लिए अनुसंधान समुदाय द्वारा किया जाता है पशु, पौधे और एक जीवित कोशिका मॉडल की एक किस्म भर में कोशिका झिल्ली और ऊतकों में होने वाली फलाक्सेस। आयन चयनात्मक microelectrodes के मस्तिष्क धमनियों चूहे में 18 और पराग ट्यूबों 19, स्केट रेटिना की कोशिकाओं 20 में हाइड्रोजन प्रवाह, माउस हड्डी 21, विभिन्न आयन में कैल्शियम प्रवाह में हाइड्रोजन, पोटेशियम और कैल्शियम प्रवाह पौधे की जड़ों 17 के पार, क्लोराइड प्रवाह को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है फंगल hyphae 22 में और अनुसंधान में अपशिष्टोंएकल कक्ष घाव के दौरान कॉर्निया 23, और अंत में कैल्शियम प्रवाह पर 12,24 चिकित्सा। यह भी आयन चयनात्मक स्वयं को संदर्भित microelectrodes 25 के बारे में विस्तृत जानकारी के लिए निम्न समीक्षा देखें।

निम्न आलेख तैयार करने और एकल कोशिका के स्तर पर आयन चयनात्मक स्वयं को संदर्भित microelectrode तकनीक का उपयोग कर अंतर्जात कोशिकी आयन अपशिष्टों की माप प्रदर्शन करने के लिए विस्तार से वर्णन किया गया है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. आयन चयनात्मक स्व संदर्भित Microelectrode तैयारी

  1. आयन चयनात्मक microelectrode की तैयारी
    1. हीट एक microelectrode खींचने का उपयोग रेशा (1.5 मिमी बाहरी व्यास, 1.12 मिमी भीतरी व्यास) के बिना पतली दीवारों borosilicate केशिकाओं खींच।
      नोट: इस सुझाव व्यास में 3-4 माइक्रोन देता है। छोटे सुझावों इलेक्ट्रॉनिक शोर करने के लिए microelectrodes के प्रति अधिक संवेदनशील बनाता है और यह भी आयन एकाग्रता में बदलाव के लिए एक धीमी प्रतिक्रिया के साथ जुड़ा हुआ है, जो उच्च प्रतिरोध किया है। उपयोगी जानकारी स्मिथ एट अल। 26 से प्रकाशित समाचार पत्र में पाया जा सकता है।
    2. Lipophilic ionophore कॉकटेल की अवधारण सहायता करने के लिए भीतरी सतह हाइड्रोफोबिक रेंडर करने के लिए इलेक्ट्रोड Silanize। उन्हें सुखाने के लिए> 100 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में एक धातु रैक और गर्मी हे / एन में microelectrodes रखें। रैक 2 मिमी व्यास छेद के साथ एक धातु की थाली के माध्यम से रास्ते से भाग drilled है। मिलीलीटर जी छेद में इलेक्ट्रोड एक 250 के साथ ऊपर की तरफ टिप जगहउन पर लड़की बीकर।
    3. सुबह में, भट्ठी बंद हो और अछूता दस्ताने पहने हुए, ध्यान से जगह में इलेक्ट्रोड और बीकर के साथ धातु रैक को हटा दें। गर्मी बनाए रखने के लिए ओवन दरवाजा बंद करो।
    4. लेटेक्स या nitrile दस्ताने, प्रयोगशाला कोट और नेत्र सुरक्षा पहनें। एक प्लास्टिक पाश्चर विंदुक के साथ, प्रत्येक इलेक्ट्रोड के आधार पर silanization समाधान मैं की एक बूंद जगह (स्थान पर बीकर रखना, पिपेट का उपयोग के लिए डालने का कार्य होंठ का उपयोग करें)। silanization समाधान गर्म थाली से वाष्पीकृत और इलेक्ट्रोड के अंदर silanizes है। इस चरण के लिए एक रासायनिक चिमटा धूआं हुड का प्रयोग करें। कुछ घंटों के लिए किसी भी शेष silanization समाधान लुप्त हो जाना करने की अनुमति देने के लिए गर्म ओवन में रैक / बीकर / इलेक्ट्रोड वापस जगह है।
      नोट: सुरक्षा कारणों के लिए, पीठ पर ओवन बारी नहीं है। यह हानिकारक है और ज्वलनशील वाष्प शामिल हो सकता है के रूप में इसे पर बंद नहीं किया जाना चाहिए का संकेत ओवन पर एक लेबल रखें।
    5. ठंडा करने के बाद, एक microelectrode भंडारण जार insi में microelectrodes की दुकानdesiccant के 400 ग्राम के साथ एक गिलास desiccator डे। Microelectrodes कई हफ्तों के लिए इस प्रकार संग्रहित किया जा सकता है।
      नोट: एक वैकल्पिक silanization विधि स्मिथ एट अल में वर्णित किया गया है 26।
    6. मापा जा आयन के 100 मिमी युक्त समाधान की 50 से 100 μl (लगभग 1 सेमी की लंबाई) (देखें तालिका 1 और चित्रा 1 बी) के साथ microelectrode के पीछे-भरें। ठीक एक रेशा के लिए एक लैम्प बर्नर में खींच लिया एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक पाश्चर विंदुक गर्मी का प्रयोग करें। रुकावट को रोकने के लिए बाद में DH 2 ओ में पिपेट कुल्ला।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, बाहरी समाधान 27 में आयन की एकाग्रता मैच के लिए backfilling समाधान के आयन एकाग्रता समायोजित करें।
    7. हवा के बुलबुले के अभाव सुनिश्चित करने के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत microelectrode को ध्यान से देखें।
      1. खड़ी इलेक्ट्रोड दबाए हुए बुलबुले एक उंगली के नाखून के साथ हल्के microelectrode मौजूद नल हैं, तो नीचे (टिप) और / या बुलबुला धक्कासुई की जगह एक सिलिकॉन ट्यूब के साथ संशोधित एक सिरिंज का उपयोग कर दबाव वापस लगाने से टिप बाहर है।
    8. आयन-विशिष्ट ionophore कॉकटेल के 15 से 20 NL (30-50 माइक्रोन की लंबाई) के साथ microelectrode टिप-भरें (1 टेबल देखें)। एक खुर्दबीन स्लाइड की कमी किनारे पर ionophore कॉकटेल का एक छोटा सा छोटी बूंद रखें। एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत microelectrode टिप को ध्यान से देखें और microelectrode टिप के बारे में केवल आधा एक सेकंड के लिए ionophore कॉकटेल छू तक खुर्दबीन स्लाइड की ओर ले जाएँ। केशिका दबाव से microelectrode में ionophore कॉकटेल ड्रा।
      नोट: इस इलेक्ट्रॉनिक हस्तक्षेप (शोर) के लिए यह अतिसंवेदनशील बना सकते हैं, जो जांच के विद्युत प्रतिरोध बढ़ जाती है और यह भी प्रतिक्रिया समय धीमा कर देती है के रूप में ionophore कॉकटेल का एक लंबा स्तंभ से बचें।
    9. एक सोने की 1 मिमी पुरुष कनेक्टर और AgCl (एजी +) तार (चित्रा 1 बी) के साथ एक सीधे microelectrode धारक में microelectrode के माउंट। </ ली>
    10. एक तीन आयामी कंप्यूटर नियंत्रित इलेक्ट्रॉनिक micropositioner (चित्रा 1 ए) पर मुहिम शुरू की सिर चरण के लिए microelectrode धारक संलग्न।
    11. नमूना मापा जा करने के लिए समाधान उपयुक्त मापने में microelectrode टिप प्लेस (शारीरिक खारा, संस्कृति के माध्यम से, आदि) microelectrode एक घंटा या दो, या यहां तक कि रात भर के लिए स्थिर करने के लिए अनुमति देने के लिए।
  2. संदर्भ इलेक्ट्रोड की तैयारी
    1. संदर्भ इलेक्ट्रोड (चित्रा 1C) के रूप में ऊपर एक ही केशिकाओं हैं। 5 सेमी लंबाई में एक हीरे पेंसिल के साथ केशिका कट और एक लेम्प लौ में 1-2 सेकंड के लिए प्रत्येक के अंत में आग पॉलिश।
    2. NaCl के एक 3 एम समाधान की ~ 200 μl के साथ इन इलेक्ट्रोड भरें, 2% agarose के साथ सीएच 3 सीओ 2 कश्मीर (पोटेशियम एसीटेट) या KCl। आयन के आधार पर समाधान मापा जा करने के लिए चुनें (संदर्भ इलेक्ट्रोड मापा जा रहा आयन को शामिल नहीं करना चाहिए, 1 टेबल देखें)। मिश्रणagarose और लगभग एक माइक्रोवेव में उबलते का हल और गर्मी। Agarose भंग करने के लिए हलचल (समाधान स्पष्ट) हो जाता है।
    3. एक प्लास्टिक पाश्चर विंदुक के संदर्भ इलेक्ट्रोड देते हैं और केशिका में गर्म समाधान निकालना।
    4. का उपयोग करने से पहले सील ट्यूब में यह 3 एम समाधान में ठंड 3 एम NaCl, सीएच 3 सीओ 2 कश्मीर या KCl समाधान और दुकान में इलेक्ट्रोड गिरा। हवा के बुलबुले के साथ किसी भी संदर्भ इलेक्ट्रोड त्यागें।
    5. एक सीधे microelectrode धारक में संदर्भ इलेक्ट्रोड के अंदर (पहले से भरे 3 एम समाधान) के साथ एक AgCl (एजी +) से गोली और एक सोने की 2 मिमी पुरुष कनेक्टर (चित्रा 1C) माउंट और एक हाथ से सूक्ष्म positioner पर इलेक्ट्रोड और धारक देते हैं एक चुंबकीय स्टैंड पर मुहिम शुरू की।

2. आयन चयनात्मक स्व संदर्भित Microelectrode कैलिब्रेशन

  1. संदर्भ समाधान के रूप में ब्याज की आयन युक्त औजार समाधान की तैयारी; 1 टेबल देखें (जैसे संस्कृति मीडिया, शारीरिक खारा) में है कि एकाग्रता ब्रैकेट। यही कारण है, एक अंशांकन समाधान को मापने के समाधान की तुलना में आयन के एक कम एकाग्रता होते हैं, और उच्च एक जरूरी है।
    1. उदाहरण के लिए, + K की 1 मिमी होता है कि खारा का उपयोग करें। इस एकाग्रता वर्ग के लिए, धारावाहिक dilutions में 10, 1 और 0.1 मिमी की एक एकाग्रता के लिए विआयनीकृत पानी में KCl पाउडर भंग। इन अंशांकन समाधान का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, इन समाधान के कम से कम दो का उपयोग करें।
  2. आयन चयनात्मक microelectrode और प्रत्येक अंशांकन समाधान में संदर्भ इलेक्ट्रोड को विसर्जित कर दिया और वोल्टेज मूल्य समर्पित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर इसी वोल्टेज रिकॉर्डिंग से पहले 1 मिनट से 3 के लिए स्थिर करते हैं (1 टेबल देखें)।
  3. सॉफ्टवेयर एक txt फ़ाइल के रूप में डेटा (एम्पलीफायर उत्पादन) बचाता है के रूप में, एक स्प्रेडशीट फ़ाइल में डेटा की प्रतिलिपि। के लघुगणक के खिलाफ microelectrode निर्गम (एम वी) प्लॉटदाढ़ आयन एकाग्रता (2A चित्रा)।
  4. एक रेखीय प्रतिगमन लागू करें और नेर्न्स्ट ढलान, अवरोधन और आर 2 मूल्य की गणना। नेर्न्स्ट ढलान monovalent आयनों के लिए 58 ± 11 एम वी / दशक और द्विसंयोजक आयनों के लिए 29 ± 11 एम वी / दशक अगर microelectrode स्वीकार करें (फैटायनों के लिए, नेर्न्स्ट ढलान anions के लिए यह नकारात्मक है, सकारात्मक है)। साथ ही, अच्छा microelectrodes के एक मजबूत रैखिक संबंध (; चित्रा 2 बी आर 2> 0.9) होना चाहिए।
    नोट: यहां इस्तेमाल किया एम्पलीफायर के एम वी उत्पादन एम वी एक दस गुना लाभ के साथ पढ़ने देता है। मान दस का एक पहलू से विभाजित किया जाना है।
  5. वास्तविक आयन एकाग्रता (चित्रा 2B) में microelectrode के कच्चे एम वी उत्पादन में कन्वर्ट करने के लिए रेखीय प्रतिगमन सूत्र का उपयोग करें।

आयन चयनात्मक Microelectrode तकनीक 3. मान्यकरण

  1. एक कृत्रिम स्रोत की तैयारी
    1. कृत्रिम स्रोत केशिकाओं एक ही केशिकाओं के रूप में कर रहे हैंऊपर दिए गए। हीट कदम 1.1.1 के रूप में एक microelectrode खींचने का उपयोग केशिका खींच।
    2. NaCl, KCl की एक 1 एम समाधान के 200 μl, 2 CaCl 2 एच 2 ओ या पीएच 4 बफर के साथ इन केशिकाओं backfill। चुनें आयन के आधार पर कृत्रिम स्रोत समाधान (1 टेबल देखें) मापा जाएगा।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, बड़ा टिप व्यास (~ 20 माइक्रोन) और साथ इलेक्ट्रोड खींच एक ही समाधान के साथ नोक-भरने लेकिन 0.5-1% agarose युक्त (agarose समाधान के किसी भी थोक के प्रवाह को रोकने जाएगा)।
    3. एक micromanipulator पर कृत्रिम स्रोत केशिका माउंट और नमूनों में आयन के प्रवाह को मापने के लिए इस्तेमाल किया समाधान में विसर्जित कर दिया। ढाल का स्थिरीकरण अनुमति देने के लिए 1 घंटे के लिए 30 मिनट के लिए समाधान में कृत्रिम स्रोत छोड़ दें।
  2. आयन चयनात्मक microelectrode के मान्यकरण
    1. Measu के लिए इस्तेमाल किया समाधान में कृत्रिम स्रोत केशिका से लगभग एक सेंटीमीटर दूर आयन चयनात्मक microelectrode विसर्जितनमूनों पर आयन का प्रवाह फिर से और पहले के रूप में संदर्भ इलेक्ट्रोड के साथ सर्किट बंद कर दें। वोल्टेज मूल्य 1 से 2 मिनट के लिए समर्पित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर इसी वोल्टेज रिकॉर्डिंग से पहले 1 मिनट से 3 के लिए स्थिर करते हैं। यह मान (भी संदर्भ, पृष्ठभूमि या खाली मूल्य के रूप में भेजा साहित्य में) बफर मूल्य से मेल खाती है।
    2. कृत्रिम स्रोत से लगभग 5 माइक्रोन के लिए आयन चयनात्मक microelectrode ले जाएँ और 1 से 2 मिनट के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग कर इसी वोल्टेज रिकॉर्डिंग से पहले वोल्टेज मूल्य 1 मिनट से 3 के लिए स्थिर करते हैं।
    3. कृत्रिम स्रोत केशिका से दूर 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 और 1280 मीटर में आयन चयनात्मक microelectrode रखकर उपरोक्त प्रक्रिया को दोहराएं।
    4. एक txt फ़ाइल के रूप में डेटा निकालने और एक स्प्रेडशीट फ़ाइल में मूल्यों की प्रतिलिपि।
  3. अंशांकन मूल्यों के लिए उसी तरह के रूप में एम वी मूल्यों के लिए इसी आयन एकाग्रता की गणना। मूल्य प्लॉट।
    नहींते: एक आयन प्रवाह मौजूद है, तो microelectrode के दो पदों (3B चित्रा) के बीच आयन एकाग्रता में एक अंतर का पता लगाता है। कृत्रिम स्रोत समाधान की तुलना में मापा प्रजातियों में से अधिक आयनों शामिल है, एकाग्रता को सही ढंग से इस मामले में (एक आयन प्रवाह की दिशा का पता लगाने के लिए आयन चयनात्मक microelectrode की क्षमता को मान्य किया, बहुत दूर से भी स्रोत के लिए उच्च करीब होना चाहिए तपका, एक कृत्रिम सिंक के लिए, मध्यम मापने की तुलना में कम विशिष्ट आयन एकाग्रता के साथ, यह) तांता होना चाहिए।
    1. प्रसार की Fick का कानून का उपयोग कर आयन प्रवाह की गणना: जम्मू = सी μ सी समाधान में आयन एकाग्रता (MOL सेमी -3) है, μ आयन गतिशीलता है, जहां (डीसी / DX) (MOL सेमी एन -1 सेकंड -1) , और डीसी दूरी DX (सेमी) (चित्रा -2) से अधिक एकाग्रता का अंतर है। आयन प्रवाह डेटा आमतौर पर pmol सेमी -2 एस में प्रस्तुत कर रहे हैं-1 या nmol सेमी -2 सेकंड -1।
      नोट:।। स्मिथ एट अल 26 से वर्णित आयन प्रवाह गणना के लिए एक वैकल्पिक विधि का इस्तेमाल किया जा सकता है। मुख्य अंतर प्रसार गुणांक के उपयोग के बजाय आयन गतिशीलता और नमूना बिना नमक के घोल में आयन प्रवाह की माप से गणना की पृष्ठभूमि आयन प्रवाह (भी बहाव या सुधार कारक वोल्टेज) के घटाव शामिल हैं।
    2. स्रोत (चित्रा 2 डी) से दूरी के खिलाफ हर कदम का आयन अपशिष्टों का मतलब प्लॉट। स्रोत से दूर चल रहा है, आयन अपशिष्टों के विभिन्न परिमाण भावना के लिए आयन चयनात्मक microelectrode की क्षमता को मान्य प्रवाह मूल्य का एक घातीय कमी निरीक्षण करते हैं।
    3. एक बड़े संकेत से n के साथ अपनी सही दिशा और परिमाण माप को मान्य करने के क्रम में दर्ज करने के इरादे से प्रत्येक विशिष्ट आयन के लिए एक बार कृत्रिम स्रोत सत्यापन करनाOise अनुपात।
      नोट: नमूने के बिना बफर के आयन प्रवाह माप पृष्ठभूमि स्तर या शोर इंगित करता है। आमतौर पर, बफर माप चर दिशाओं को प्रदर्शित करता है कि बहुत छोटे प्रवाह के लिए अग्रणी आयन एकाग्रता की कोई स्पष्ट उतार-चढ़ाव से पता चलता है।

चैंबर मापने के 4. तैयारी

नोट: प्रयोगों से पहले, नमूना मापा जा करने के लिए विचार और नमूना है कि कैसे घुड़सवार और microelectrode के मापन के लिए स्थिर किया जाना है।

  1. Xenopus डिम्बाणुजनकोशिका माप एक 800 माइक्रोन नायलॉन जाल (nitex जाल) के एक 1 सेमी वर्ग में कटौती और एक प्लास्टिक पेट्री डिश (चित्रा 1E) में यह गोंद laevis लिए।

5. आयन फ्लक्स मापन

  1. अंशांकन समाधान के लिए उसी तरह के रूप में नमूना माप पर प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया बफर में मौजूद आयन एकाग्रता उपाय। एक्स laevis oocytes मार्क संशोधित घंटी (एमएमआर) की आवश्यकता होती है। डी100 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl, 1 MgCl और 5 HEPES: issolve NaCl, KCl, CaCl, MgCl और विआयनीकृत पानी में HEPES (मिमी) के अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए। NaOH का उपयोग कर 7.5 बफर का पीएच को समायोजित करें।
  2. मापने के चेंबर में नमूना प्लेस और microelectrode (चित्रा 3) के करीब स्थिति को परिभाषित करने के लिए micropositioner का उपयोग करने के बारे में (10 माइक्रोन दूर) नमूना के करीब आयन चयनात्मक microelectrode लाने के लिए।
  3. समर्पित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर करीब स्थिति और दूर (दूर) नमूना से एक की स्थिति के बीच microelectrode के कम आवृत्ति (0.3 हर्ट्ज) भ्रमण (100 माइक्रोन) को प्रारंभ करें। Microelectrode के आंदोलन नमूना की सतह को सीधा है कि सुनिश्चित करें।
    नोट: microelectrode के भ्रमण सॉफ्टवेयर पर सेट किया जा सकता है। बड़े भ्रमण माप जबकि दौरान छोटे अपशिष्टों का एक आसान पता लगाने की इजाजत दी पढ़ा ढाल नमूना अंतराल lengthens और अस्थायी समाधान कम हो जाती है बढ़ जाती है। देखना
  4. सॉफ्टवेयर का उपयोग कर रिकॉर्डिंग शुरू। microelectrode के प्रत्येक स्थिति में रुक जाता है और एमवी में बिजली के संभावित कंप्यूटर पर दर्ज की गई है। संकेत स्थिरीकरण की अनुमति देता है, कम से कम 2 मिनट के लिए माप प्राप्त करते हैं। कम समय चूक प्रयोगों, पूरे समय के पाठ्यक्रम के लिए ब्याज की स्थिति में रिकॉर्ड संभावित बदलाव के लिए।
  5. एक txt फ़ाइल के रूप में डेटा निकालने और एक स्प्रेडशीट फ़ाइल में मूल्यों की प्रतिलिपि।
  6. अंशांकन मूल्यों के लिए उसी तरह के रूप में एम वी मूल्यों के लिए इसी आयन एकाग्रता की गणना। मूल्य प्लॉट।
    नोट: एक आयन प्रवाह मौजूद है, तो microelectrode के दो पदों (3B चित्रा) के बीच आयन एकाग्रता में एक अंतर का पता लगाता है।
  7. (कदम 3.3.1) के रूप में पहले प्रसार के Fick का कानून का उपयोग कर आयन प्रवाह की गणना।
  8. एक नया नमूना मापने के पहले बफर माप दोहराएँ और हर नए के लिए प्रवाह माप और गणना की प्रक्रिया को दोहरानेनमूना।

6. सांख्यिकीय विश्लेषण और डेटा प्रस्तुति

  1. और / या मिश्रित प्रभाव 28 के साथ एक ANCOVA मॉडल का उपयोग कर नियंत्रण शर्त के तहत आयन अपशिष्टों पर समय की स्थिति से स्वतंत्र प्रभाव का परीक्षण करें।
    नोट: सहप्रसरण का विश्लेषण (ANCOVA) स्पष्ट और सतत दोनों उपायों स्वतंत्र चर के रूप में इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति देकर नियमित एनोवा और प्रतिगमन घोला जा सकता है कि एक सामान्य रेखीय मॉडल है। इसके अलावा, व्यक्तिगत और अंतिम नीडिंत प्रभाव प्रति दोहराया उपायों द्वारा प्रेरित सहसंबद्ध त्रुटियों की उपस्थिति में मिश्रित प्रभाव मॉडल दोनों तय की और यादृच्छिक प्रभाव का सटीक अनुमान मॉडल करने के लिए उपयोग किया जाता है।
  2. कई परीक्षण 28 के लिए Bonferroni सुधार के साथ समूह के स्तर के बीच छात्र टी -test का उपयोग कर जोड़ो में तुलना की गणना करें।
  3. Boxplots स्थिति और समय के अनुसार आयन प्रवाह माप संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए उत्पन्न करता है। वर्णित जोड़ो में छात्र टी से पी मूल्यों को शामिल करें(चित्रा 3 डी) के ऊपर है और इस प्रकार के रूप में पी मूल्यों के महत्व के स्तर से संकेत मिलता है: *: पी <0.05; **: पी <0.01; ***: पी <0.001 29

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

हम पहले से कैल्शियम बाढ़ एकल कोशिका 24 लोग घायल हो गए के बाद प्रतीत होता है कि पता चला है। इसलिए हम अन्य आयन अपशिष्टों एकल कक्ष लोग घायल हो गए पर पाए जाते हैं कि क्या पूछा। हम एक्स का इस्तेमाल किया डिम्बाणुजनकोशिका, एकल कोशिका घाव भरने 30-34 और electrophysiological रिकॉर्डिंग 24,35-39 के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल laevis। दिलचस्प है, पोटेशियम आयनों एक्स के अंदर और अधिक ध्यान केंद्रित कर रहे हैं laevis oocytes (लगभग 110 मिमी) (एमएमआर 1x में: 1 मिमी) का इस्तेमाल किया कोशिकी समाधान में 40 से अधिक लोग घायल हो गए पर पोटेशियम का एक तपका सुझाव दे। परिकल्पना है कि पुष्टि करने के लिए आदेश में, हम एक्स के दौरान पोटेशियम प्रवाह मापा आयन चयनात्मक स्वयं को संदर्भित microelectrode का उपयोग कर डिम्बाणुजनकोशिका कोशिका झिल्ली चिकित्सा laevis।

डिम्बाणुजनकोशिका घाव करने के लिए, पहली बार एक बड़े टिप आकार (~ 50 माइक्रोन) के साथ एक केशिका इलेक्ट्रोड खींच। एक सीधे इलेक्ट्रोड धारक के लिए इलेक्ट्रोड देते हैं और एक पुस्तिका सूक्ष्म positioner पर माउंट। Oocy घावइलेक्ट्रोड टिप 24 के साथ झिल्ली को छू द्वारा ते। जल्द ही लोग घायल हो गए के बाद हम (; - डी 3B चित्रा 250 nmol सेमी -2 सेकंड -1 तक) पोटेशियम का एक बड़ा तपका का पता चला। (; - डी 3B चित्रा लोग घायल हो गए के बाद 16 मिनट के लिए ऊपर) झिल्ली घाव चंगा के रूप में, इस प्रवाह बरकरार झिल्ली में देखा unwounded प्रवाह मूल्यों (~ 5 nmol सेमी -2 सेकंड -1) घाव चंगा करने के लिए जब लौट कम। ANCOVA पोटेशियम प्रवाह माप पर (पी <0.001) घायल हो गए के बाद समय का एक महत्वपूर्ण प्रभाव का पता चला। हॉक पोस्ट काफी 1-2 मिनट (पी <0.001) पर पोटेशियम तपका वृद्धि हुई है और 5-6 मिनट (पी <0.05) में है, लेकिन पता चला विश्लेषण नहीं बरकरार कोशिका झिल्ली हालत (चित्रा 3 डी) की तुलना में जब लोग घायल हो गए के बाद 15-16 मिनट पर। हम एकल कोशिका लोग घायल हो गए पर, पोटेशियम का एक तपका डु कमी है कि घाव के स्तर पर प्रतीत होता है कि यह निष्कर्ष निकालाउपचार के पाठ्यक्रम की अंगूठी।

आयन Ionophore कॉकटेल इलेक्ट्रोलाइट समाधान (100 मिमी) संदर्भ समाधान (3 एम) कृत्रिम स्रोत समाधान (1 एम)
सीए 2 + कैल्शियम Ionophore मैं कॉकटेल एक (कैट # 21,048) 2 CaCl 2H 2 हे KCl 2 CaCl 2H 2 हे
ना + सोडियम Ionophore द्वितीय कॉकटेल एक (कैट # 71,178) NaCl KCl NaCl
CL - क्लोराइड Ionophore मैं कॉकटेल एक (कैट # 24,902) NaCl 2 Ch सीओ 2 कश्मीर (पोटेशियम एसीटेट) NaCl
+ K पोटेशियम Ionophore मैं कॉकटेल एक (कैट # 60,031) KCl NaCl KCl
एच + हाइड्रोजन Ionophore मैं कॉकटेल एक (कैट # 95,291) पीएच 7.0 KCl पीएच 4.0

तालिका 1:। आमतौर पर इस्तेमाल किया ionophore कॉकटेल के उदाहरण भी दिखाया उचित समाधान कृत्रिम स्रोत के लिए, microelectrodes में जगह और अंशांकन प्रदर्शन कर रहे हैं। सूचि संख्या सिग्मा Aldrich से कर रहे हैं।

चित्र 1
चित्रा 1:। आयन चयनात्मक स्वयं को संदर्भित microelectrode प्रणाली के आयन चयनात्मक microelectrodes (ए) योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (बी) आयन चयनात्मक microelectrode। (सी) संदर्भ इलेक्ट्रोड। (डी) बाहरी समाधान और microel के बीच आयन एक्सचेंजionophore के माध्यम से ectrode। मापने कक्ष (ई) योजना एक्स के लिए इस्तेमाल किया डिम्बाणुजनकोशिका laevis।

चित्र 2
चित्रा 2: आयन चयनात्मक microelectrodes अंशांकन, कृत्रिम स्रोत और प्रवाह गणना (ए) अंशांकन वक्र।। आयन एकाग्रता की अंशांकन वक्र और गणना (बी) समीकरण। आयन प्रवाह (सी) गणना। कृत्रिम स्रोत (1 एम KCl) से विशिष्ट दूरी पर मापा जाता है (डी) आयन प्रवाह।

चित्र तीन
चित्रा 3: एक्स में पोटेशियम प्रवाह का विकास उपचार के दौरान डिम्बाणुजनकोशिका घाव laevis। (ए) के फोटोग्राफ और भ्रमण का चित्रणएक्स में आयन एकाग्रता को मापने आयन चयनात्मक microelectrode के डिम्बाणुजनकोशिका घाव laevis; '' ए '' और '' वी 'के बीच धराशायी लाइन' पशु-वनस्पति अक्ष का प्रतिनिधित्व करता है। एक्स में पोटेशियम आयन एकाग्रता की भिन्नता का (बी) के चित्रण उपचार के दौरान डिम्बाणुजनकोशिका घाव laevis। (सी) तितर बितर (XY) मतलब और एक्स के दौरान अलग समय पर घाव के स्तर पर पोटेशियम प्रवाह माप के मानक त्रुटि दिखा साजिश डिम्बाणुजनकोशिका घाव भरने laevis। (डी) Boxplot एक्स के दौरान अलग समय पर घाव के स्तर पर पोटेशियम प्रवाह माप दिखा डिम्बाणुजनकोशिका घाव भरने laevis (एन = 16; पालन के रूप में संकेत दिया पी मान: *: पी <0.05; ***: पी <0.001)।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

vivo में बाह्य आयन अपशिष्टों के सफल माप के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: शोर में कमी, आयन चयनात्मक microelectrodes और संदर्भ इलेक्ट्रोड का सही निर्माण, और नमूना और दोनों इलेक्ट्रोड की स्थिति।

शोर को कम करने के लिए, रिकॉर्डिंग प्रणाली अधिमानतः भी earthed है जो एक धातु में सबसे ऊपर (कंपन अलगाव) तालिका के साथ एक earthed (जमीन) फैराडे पिंजरे में होना चाहिए। इसके अलावा, माइक्रोस्कोप हवाई जहाज़ के पहिये भी earthed किया जाना चाहिए। बिजली के शोर के सूत्रों का कहना प्रकाश स्रोत शामिल हैं। एक फाइबर ऑप्टिक 'पंखे की कम' प्रकाश स्रोत कम से कम बिजली शोर का कारण बनता है। अंत में, धारकों को भी chlorided microelectrode में चांदी के तार और गोली रखने (सोडियम हाइपोक्लोराइट ब्लीच में डुबकी और DH 2 ओ में कुल्ला) शोर को कम करता है आयन चयनात्मक microelectrode में या माप में परिणाम होगा संदर्भ इलेक्ट्रोड में हवा के बुलबुले की व्याप्ति में उपस्थिति के रूप में विफलताmicroelectrode के चालकता नहीं के बराबर या समझौता हो जाएगा। इस प्रकार, यह धारकों पर उन्हें बढ़ते से पहले खुर्दबीन के नीचे इलेक्ट्रोड सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए विस्तृत प्रक्रिया के लिए प्रोटोकॉल देखें। नमूना और microelectrodes दोनों की सही स्थिति विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं। आयन प्रवाह की माप microelectrode के भ्रमण और नमूना करने के लिए अपनी स्थिति रिश्तेदार पर निर्भर है। यह ठीक नमूना पर मापा जाएगा कि ब्याज के क्षेत्र की पहचान और नमूना से एक सीधा आंदोलन करने का microelectrode की स्थिति के लिए महत्वपूर्ण है। बदल आयन में परिणाम होगा नमूना सीधा करने के लिए नहीं है कि एक तरह से microelectrodes का कोई भी भ्रमण माप और नमूनों के बीच वृद्धि की परिवर्तनशीलता फलाक्सेस।

विशिष्ट आयनों को मापने के लिए समर्पित Ionophore कॉकटेल, उदाहरण के लिए पोटेशियम, सोडियम भी ऐसे ही अन्य आयनों की मौजूदगी समझ सकता है।मापने समाधान ionophore कॉकटेल के लिए एक प्रतिस्पर्धा आयन के एक उच्च मात्रा में होता है उस मामले में, यह कृत्रिम स्रोत प्रयोग का उपयोग करके ionophore कॉकटेल के चयनात्मकता निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इधर, समाधान एक्स संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया laevis oocytes (एमएमआर) सोडियम की एक उच्च एकाग्रता है। इस प्रकार, यह भी इस्तेमाल किया पोटेशियम ionophore कॉकटेल सोडियम होश आकलन है कि महत्वपूर्ण है। (1 एम NaCl, 1 टेबल देखें) पोटेशियम ionophore कॉकटेल भरा microelectrode उपयोग करके, हम उच्च सोडियम एकाग्रता में शामिल है कि एक कृत्रिम स्रोत का उपयोग कर एक सोडियम प्रवाह को मापने के लिए प्रयास कर सकते हैं एक ही मापने समाधान रखते हुए। रासायनिक ढाल सोडियम की तपका के पक्ष में है, लेकिन आदर्श कोई सोडियम प्रवाह पोटेशियम-विशिष्ट ionophore कॉकटेल ने पता लगाया जाना चाहिए। एक महत्वपूर्ण प्रवाह मापा जाता है, तो प्रयोगात्मक हालत अनुकूलित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, प्रतिस्पर्धा आयन की एकाग्रता बिंदु मीटर से नीचे उतारा जा सकता हैइस पोटेशियम प्रवाह माप के दौरान संभावित हस्तक्षेप करने के लिए अग्रणी प्लाज्मा झिल्ली में सोडियम प्रवाह को प्रभावित कर सकता है, जबकि icroelectrode अब यह समझ नहीं है। आदर्श रूप में, कृत्रिम स्रोत प्रयोग से गणना एक संशोधन के कारक डेटा के लिए लागू किया जा सकता है, या किसी अन्य ionophore कॉकटेल का परीक्षण किया जा सकता है। आयन आयन चयनात्मक स्वयं को संदर्भित microelectrode का उपयोग कर माप आयन अपशिष्टों की माप के जलीय घोल में कोशिकाओं और ऊतकों में होने वाली अनुमति देने के प्रवाह। एक हवा वातावरण के संपर्क में सामान्य रूप से कर रहे हैं कि कोशिकाओं या ऊतकों में आयन अपशिष्टों का माप अपने वातावरण में स्वाभाविक रूप से मौजूद नहीं है और कहा कि सामान्य परिस्थितियों में होता है कि आयन प्रवाह और विनिमय बदल सकते हैं कि एक समाधान की उपस्थिति की आवश्यकता है। विशिष्ट ध्यान में इस तरह के समाधान की सामग्री को परिभाषित करने और मूल, मनोवैज्ञानिक वातावरण से विचलन को कम से कम करने के लिए किया जाना है। आयन चयनात्मक स्वयं को संदर्भित microele से मापा जा सकता है कि आयनों के स्पेक्ट्रमctrode तकनीक हित के आयन को चयनात्मक विशिष्ट ionophore कॉकटेल की उपलब्धता और अस्तित्व पर निर्भर करता है।

आयन चयनात्मक स्वयं को संदर्भित microelectrode के साथ प्रदर्शन किया आयन प्रवाह माप कोशिकी आयन अपशिष्टों के गैर इनवेसिव माप की इजाजत दी है, आमतौर पर कोशिकाओं या ऊतकों की सतह के पास, समाधान में किया जाता है। इस विधि सेल और कहनेवाला अंतरिक्ष के बीच, ऊतकों के अंदर आयन अपशिष्टों की माप की अनुमति नहीं है। आयन चयनात्मक स्वयं को संदर्भित microelectrode विवो में आयन अपशिष्टों की माप की अनुमति देता है कि एकमात्र तरीका नहीं है। एक वैकल्पिक नई विधि फ्लोरोसेंट bioelectricity संवाददाताओं microelectrodes का उपयोग संभव नहीं हैं कि आयन अपशिष्टों की माप के लिए सक्षम बनाता है जो 41 का उपयोग करता है। इन रंगों के ऊतकों और कोशिकाओं के अंदर आयनों अपशिष्टों की माप की अनुमति और subcellular स्थानीयकरण हासिल कर सकते हैं। इस तकनीक के ऊतकों और कोशिकाओं लेकिन आयन नहीं पूर्व अंदर आयन प्रवाह के स्थानिक जानकारी प्राप्त कर सकते हैंऊतक और बाह्य अंतरिक्ष के बीच बदल जाते हैं। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट bioelectricity संवाददाताओं आमतौर पर अर्द्ध मात्रात्मक डेटा उत्पन्न करते हैं। आयन अपशिष्टों को मापने के लिए microelectrode आधारित प्रौद्योगिकी का उपयोग अभी भी वैध है और आवश्यक है और उन्हें पूरक बनाने के बजाय तकनीक प्रतिस्पर्धा, फ्लोरोसेंट bioelectricity संवाददाताओं का उपयोग करने के लिए अतिरिक्त जानकारी लाता है। इसके अलावा, दिलचस्प हाल के घटनाक्रम ऑक्सीजन, नाइट्रिक ऑक्साइड और न्यूरोट्रांसमीटर डोपामाइन और ग्लूटामेट 42,43 के Amperometric स्वयं को संदर्भित डिटेक्टरों शामिल हैं। Amperometric संवेदन सेंसर नोक पर एक रासायनिक प्रतिक्रिया पर आधारित है। नई फाइबर ऑप्टिक microelectrodes ("optrodes") गैर invasively चयापचय ऑक्सीजन प्रवाह 34,35 और उच्च चयनात्मकता और संवेदनशीलता 45,46 के साथ पीएच 44 को मापने के लिए विकसित किया गया है। 47 ग्लूकोज के प्रति संवेदनशील एक एंजाइम आधारित nanoparticle में लिपटे जांच अब भी है।

हम वें देखा है किई आयन चयनात्मक स्वयं को संदर्भित microelectrode विवो में बाह्य आयन अपशिष्टों के मापन के लिए सक्षम बनाता है। आयनों के ही रहने वाले जीवों के भीतर कोशिकाओं और ऊतकों के बीच कोशिकाओं / ऊतकों और बाह्य अंतरिक्ष लेकिन यह भी के बीच आदान-प्रदान नहीं कर रहे हैं। यह इसकी सतह के पास आयन अपशिष्टों का वास्तविक माप के अलावा ऊतकों के अंदर आयन अपशिष्टों के स्थानिक संकल्प की सराहना करने के क्रम में इस तरह के फ्लोरोसेंट bioelectricity संवाददाताओं के रूप में अन्य लोगों के साथ इस तकनीक का गठबंधन करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, आयन अपशिष्टों सेल झिल्ली क्षमता, ट्रांस-epithelia संभावित या बाह्य बिजली की धाराओं के साथ मिलकर कोशिकाओं और ऊतकों को परिभाषित करता है कि bioelectric राज्य का एक महत्वपूर्ण हिस्सा प्रतिनिधित्व करते हैं। यह संयोजन, कोशिका झिल्ली और ट्रांस-epithelia क्षमता के रूप में अच्छी तरह से बाह्य बिजली की धाराओं 24 में, को मापने के लिए, आयन अपशिष्टों की माप के अलावा, महत्वपूर्ण है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IonAmp   BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA none amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
IonAmp32   BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA none software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Headstage pre-amplifier  BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA INA116 BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
MicroStep Driver  BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA none three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Manual micropositioner   World Precision Instruments  Model KITE-R Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Magnetic stand    World Precision Instruments Model M10 Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Vibration isolation table   Newport Inc.      Model VW-3036-OPT-023040 Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces Newport Inc.      Model 360-90 Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table
Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel Newport Inc.      460PD-X none
Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel Newport Inc. 460A-XY none
Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament  World Precision Instruments  TW150-4 none
Electrode puller  Narishige  PC-10 none
Metal rack Made in-house none Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel
Oven QL Model 10 Lab Oven none
Silanization solution I  Sigma-Aldrich 85126 Hazardous, handle as recommended by provider 
Glass Petri dish; Pyrex Fisher Scientific 316060 none
Electrode/micropipette storage jar World Precision Instruments  E215 none
Glass dessicator Fisher Scientific 08-595E Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight.
Plastic Pasteur pipette  Fisher Scientific 11597722 none
Bunsen burner Fisher Scientific S97329 none
Microscope slide Sigma-Aldrich S8902 none
Straight microelectrode holder Warner Instruments QSW-A15P with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire
Straight microelectrode holder  World Precision Instruments MEH3S with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector 
6 cm Petri dish VWR 60872-306 none
Nitex mesh Dynamic Aqua-Supply Ltd. NTX750 none
Glue; Loctite epoxy VWR 500043-451 Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing
Deionized water  Sigma-Aldrich 99053 none
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653 none
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P9333 none
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C1016 none
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M8266 none
Hepes Sigma-Aldrich H3375 none
Sodium Hydroxyde Sigma-Aldrich S8045 none
Potassium Acetate Sigma-Aldrich P1190 none
Agarose Sigma-Aldrich A9539 none

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weber, W. M., Liebold, K. M., Clauss, W. Amiloride-sensitive Na+ conductance in native Xenopus oocytes. Biochimica et biophysica acta. 1239, 201-206 (1995).
  2. McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. Journal of cell science. 122, 4267-4276 (2009).
  3. Zhao, M. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Seminars in cell & developmental biology. 20, 674-682 (2009).
  4. Jaffe, L. F., Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. The Journal of cell biology. 63, 614-628 (1974).
  5. Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nature protocols. 2, 661-669 (2007).
  6. Reid, B., Zhao, M. Measurement of bioelectric current with a vibrating probe. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  7. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  8. Moore, J. W. The patch clamp: single-channel recording. Science. 224, 50-51 (1984).
  9. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of visualized experiments. , (2008).
  10. McCaig, C. D., Robinson, K. R. The ontogeny of the transepidermal potential difference in frog embryos. Developmental biology. 90, 335-339 (1982).
  11. Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F. Detection of extracellular calcium gradients with a calcium-specific vibrating electrode. The Journal of cell biology. 110, 1565-1573 (1990).
  12. The use of the vibrating probe technique to study steady extracellular currents during pollen germination and tube growth. Fertilisation in Higher Plants: molecular and cytological aspects. Cai, G., Cresti, M., Moscatelli, A. , Springer-Verlag. 235-252 (1999).
  13. Kunkel, J. G., Xu, Y., Shipley, A. M., Feijó, J. A. The use of non-invasive ion-selective microelectrode techniques for the study of plant development. Plant Electrophysiology – Theory and Methods. (ed Volkov AG. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 109-137 (2006).
  14. Ordonez, N. M., Shabala, L., Gehring, C., Shabala, S. Noninvasive microelectrode ion flux estimation technique (MIFE) for the study of the regulation of root membrane transport by cyclic nucleotides. Methods in molecular biology. 1016, 95-106 (2013).
  15. Tegg, R. S., Melian, L., Wilson, C. R., Shabala, S. Plant cell growth and ion flux responses to the streptomycete phytotoxin thaxtomin A: calcium and hydrogen flux patterns revealed by the non-invasive MIFE technique. Plant & cell physiology. 46, 638-648 (2005).
  16. Newman, I. A. Ion transport in roots: measurement of fluxes using ion-selective microelectrodes to characterize transporter function. Plant, cell & environment. 24, 1-14 (2001).
  17. Kochian, L. V., Shaff, J. E., Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F., Lucas, W. J. Use of an extracellular, ion-selective, vibrating microelectrode system for the quantification of K(+), H (+), and Ca (2+) fluxes in maize roots and maize suspension cells. Planta. 188, 601-610 (1992).
  18. Doughty, J. M., Langton, P. D. Measurement of chloride flux associated with the myogenic response in rat cerebral arteries. The Journal of physiology. 534, 753-761 (2001).
  19. Messerli, M. A., Smith, P. J., Lewis, R. C., Robinson, K. R. Chloride fluxes in lily pollen tubes: a critical reevaluation. The Plant journal : for cell and molecular biology. 40, 799-812 (2004).
  20. Molina, A. J., et al. Neurotransmitter modulation of extracellular H+ fluxes from isolated retinal horizontal cells of the skate. The Journal of physiology. 560, 639-657 (2004).
  21. Marenzana, M., Shipley, A. M., Squitiero, P., Kunkel, J. G., Rubinacci, A. Bone as an ion exchange organ: evidence for instantaneous cell-dependent calcium efflux from bone not due to resorption. Bone. 37, 545-554 (2005).
  22. Lew, R. R. Ionic currents and ion fluxes in Neurospora crassa hyphae. Journal of experimental botany. 58, 3475-3481 (2007).
  23. Vieira, A. C., et al. Ionic components of electric current at rat corneal wounds. PloS one. 6, e17411 (2011).
  24. Luxardi, G., Reid, B., Maillard, P., Zhao, M. Single cell wound generates electric current circuit and cell membrane potential variations that requires calcium influx. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 6, 662-672 (2014).
  25. Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. H. , (2007).
  26. Smith, P. J., Hammar, K., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Trimarchi, J. R. Self-referencing, non-invasive, ion selective electrode for single cell detection of trans-plasma membrane calcium flux. Microscopy research and technique. 46, 398-417 (1999).
  27. Messerli, M. A., Smith, P. J. Construction theory, and practical considerations for using self-referencing of Ca(2+)-selective microelectrodes for monitoring extracellular Ca(2+) gradients. Methods in cell biology. 99, 91-111 (2010).
  28. Chambers, J., Hastie, T., Pregibon, D. Ch. 48. Compstat. Momirović, K., Mildner, V. , Physica-Verlag HD. 317-321 (1990).
  29. Chambers, J. M., Cleveland, W. S., Kleiner, B., Tukey, P. A. Graphical methods for data analysis. , Wadsworth & Brooks/Cole. (1983).
  30. Burkel, B. M., Benink, H. A., Vaughan, E. M., von Dassow, G., Bement, W. M. A Rho GTPase signal treadmill backs a contractile array. Developmental cell. 23, 384-396 (2012).
  31. Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current biology : CB. 9, 579-587 (1999).
  32. Mandato, C. A., Bement, W. M. Contraction and polymerization cooperate to assemble and close actomyosin rings around Xenopus oocyte wounds. The Journal of cell biology. 154, 785-797 (2001).
  33. Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. The Journal of cell biology. 168, 429-439 (2005).
  34. Simon, C. M., Vaughan, E. M., Bement, W. M., Edelstein-Keshet, L. Pattern formation of Rho GTPases in single cell wound healing. Molecular biology of the cell. 24, 421-432 (2013).
  35. Petersen, C. C., Dupont, G. The initiation of a calcium signal in Xenopus oocytes. Cell calcium. 16, 391-403 (1994).
  36. Horisberger, J. D., Lemas, V., Kraehenbuhl, J. P., Rossier, B. C. Structure-function relationship of Na,K-ATPase. Annual review of physiology. 53, 565-584 (1991).
  37. Miledi, R. A calcium-dependent transient outward current in Xenopus laevis oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. London, England, , 491-497 (1982).
  38. Miledi, R., Parker, I. Chloride current induced by injection of calcium into Xenopus oocytes. The Journal of physiology. 357, 173-183 (1984).
  39. Parker, I., Miledi, R. A calcium-independent chloride current activated by hyperpolarization in Xenopus oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. 233, 191-199 (1988).
  40. Costa, P. F., Emilio, M. G., Fernandes, P. L., Ferreira, H. G., Ferreira, K. G. Determination of ionic permeability coefficients of the plasma membrane of Xenopus laevis oocytes under voltage clamp. The Journal of physiology. 413, 199-211 (1989).
  41. Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 385-397 (2012).
  42. Porterfield, D. M. Measuring metabolism and biophysical flux in the tissue, cellular and sub-cellular domains: recent developments in self-referencing amperometry for physiological sensing. Biosensors. 22, 1186-1196 (2007).
  43. McLamore, E. S., et al. A self-referencing glutamate biosensor for measuring real time neuronal glutamate flux. Journal of neuroscience methods. 189, 14-22 (2010).
  44. Yin, M., et al. Highly sensitive and fast responsive fiber-optic modal interferometric pH sensor based on polyelectrolyte complex and polyelectrolyte self-assembled nanocoating. Analytical and bioanalytical chemistry. 399, 3623-3631 (2011).
  45. Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrode technology for non-invasive real-time measurement of biophysical flux and physiological sensing. The Analyst. 134, 2224-2232 (2009).
  46. McLamore, E. S., Jaroch, D., Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrodes for measuring spatially resolved, real-time metabolic oxygen flux in plant systems. Planta. 232, 1087-1099 (2010).
  47. McLamore, E. S., et al. A self referencing platinum nanoparticle decorated enzyme-based microbiosensor for real time measurement of physiological glucose transport. Biosensors & bioelectronics. 26, 2237-2245 (2011).

Tags

सेलुलर जीवविज्ञान अंक 99 आयन चयनात्मक आत्म संदर्भित microelectrode बाह्य आयन अपशिष्टों,
आयन चयनात्मक स्व संदर्भित Microelectrode तकनीक का प्रयोग कोशिकी आयन अपशिष्टों का मापन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luxardi, G., Reid, B., Ferreira, F., … More

Luxardi, G., Reid, B., Ferreira, F., Maillard, P., Zhao, M. Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique. J. Vis. Exp. (99), e52782, doi:10.3791/52782 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter