Abstract
Le cellule ottenute da animali, piante e cellule singole sono racchiusi da una barriera chiamato la membrana cellulare che separa il citoplasma dall'esterno. Strati cellulari come epiteli formano anche una barriera che separa l'interno dall'esterno o diversi compartimenti di organismi multicellulari. Una caratteristica fondamentale di queste barriere è la distribuzione differenziale di ioni attraverso le membrane cellulari o strati di cellule. Due proprietà consentono questa distribuzione: 1) membrane e epiteli mostrano permeabilità selettiva di ioni specifici; 2) gli ioni sono trasportati attraverso le pompe attraverso le membrane cellulari e strati di cellule. Queste proprietà giocano un ruolo cruciale nel mantenimento della fisiologia dei tessuti e fungono da segnalazione spunti dopo i danni, durante la riparazione, o in condizioni patologiche. L'auto-riferimento microelettrodo ionoselettivo consente misurazioni di flussi specifici di ioni come calcio, potassio o sodio a livelli cellulari e tissutali singoli. Il microelettrodo contiene un cocktail ionoforo che èselettivamente permeabile ad uno ione specifico. La soluzione di riempimento interna contiene una concentrazione insieme di ione di interesse. Il potenziale elettrico del microelettrodo è determinata dalla concentrazione fuori dello ione. Poiché la concentrazione di ioni varia, il potenziale del microelettrodo cambia in funzione del log della attività ionica. Quando spostato avanti e indietro vicino a una fonte o affondare dello ione (cioè in un gradiente di concentrazione dovuto al flusso di ioni) il potenziale microelettrodo oscilla ad una ampiezza proporzionale al flusso di ioni / gradiente. L'amplificatore amplifica il segnale microelettrodo e la produzione è registrata sul computer. Il flusso di ioni può essere calcolata dalla legge di Fick della diffusione usando le fluttuazioni potenziale dell'elettrodo, l'escursione di microelettrodo, e altri parametri quali la mobilità ionica specifico. In questo articolo, si descrive nel dettaglio la metodologia per misurare flussi ionici extracellulari con il autoreferenziale microelettrodi uno ione-selettivod presentare alcuni risultati rappresentativi.
Introduction
Tutte le cellule animali sono circondate da una membrana a doppio strato lipidico che separa il citoplasma dall'ambiente esterno. La cella mantiene un potenziale di membrana elettrico, negativa all'interno, dal trasporto attivo di ioni 1. Il potenziale di membrana è una fonte di energia accumulata che la cellula può utilizzare per operare vari dispositivi molecolari nella membrana 2. I neuroni e le altre cellule eccitabili hanno grandi potenziali di membrana. Rapid apertura dei canali del sodio crolla il potenziale di membrana (depolarizzazione) e produce il potenziale di azione che viene trasportato lungo la lunghezza del neurone 2. Oltre a questi cambiamenti rapidi elettrici, molti tessuti e organi generare e mantenere significativi potenziali elettrici a lungo termine. Ad esempio, la pelle e dell'epitelio corneale generare e mantenere potenziali trans-epiteliali e correnti elettriche extracellulari pompando direzionale di ioni (soprattutto sodio e cloruro) 3.
tenda "> Mentre misure di corrente elettrica endogena extracellulare utilizzando la sonda vibrante 4-6 e le misurazioni dei potenziali di membrana o trans-epiteliali utilizzando il sistema microelettrodo 7-10 consentire la misurazione dei parametri elettrici di membrane cellulari e strati di cellule epiteliali, non danno indicazione della specie ionici coinvolti.Microelettrodi con ionophore selettivo in grado di misurare la concentrazione di ioni in soluzione specifica. Gradienti ionici o flusso possono essere misurati con due o più elettrodi in posizioni diverse. Tuttavia, la deriva della tensione intrinseca di ciascuna sonda sarebbe diversa, causando misurazioni imprecise o anche il rilevamento di un gradiente che non era presente. Un singolo elettrodo utilizzato in modalità "auto-riferimento" in cui si muove a bassa frequenza tra due punti risolve questo problema. Ora il flusso di ioni può essere visto sullo sfondo di una deriva del segnale relativamente lento e stabile (vedere Figura 3B). Il sistema di misurazione sensibile agli ioni utilizza microelettrodi autoreferenziali ionoselettivi di rilevare piccoli flussi extracellulari di ioni nei pressi di tessuti o cellule singole. Il sistema è costituito da un amplificatore che elabora il segnale dal microelettrodo e un motore passo-passo micro e guidatore a controllare il movimento del microelettrodo. Il microelettrodo ione-selettivo e l'elettrodo di riferimento che chiude il circuito sono collegati all'amplificatore tramite un headstage preamplificatore (Figura 1A). Software determina i parametri del movimento microelettrodo (frequenza, distanza) e registra anche l'uscita dell'amplificatore. Il motore passo-passo controlla il movimento tramite un microelettrodo micropositioner tridimensionale. Una bassa frequenza di oscillazione microelettrodi ione-selettivo è stato sviluppato nel 1990 per misurare il flusso di calcio specifica 11. Così come il calcio, cocktail ionofori accessibili in commercio sono ora disponibili a fare microelectrodes sensibile al sodio, cloruro, potassio, idrogeno, magnesio, nitrato, ammonio, fluoruro, litio o mercurio.
Fondamentalmente, la tecnica microelettrodo ionoselettivo autoreferenziale converte l'attività di uno ione specifico disciolto in una soluzione in un potenziale elettrico, che può essere misurata con un voltmetro. Il cocktail ionoforo è un liquido immiscibile fase (organica, lipofila) con proprietà a scambio ionico. L'ionoforo complessi selettivamente (binding) ioni specifici reversibilmente e li trasferisce tra la soluzione acquosa contenuta nel microelettrodo (elettrolita) e la soluzione acquosa in cui è immerso il microelettrodo (Figura 1D). Questo trasferimento di ioni porta un equilibrio elettrochimico e una variazione di potenziale elettrico tra il microelettrodo e l'elettrodo di riferimento è misurata dal voltmetro. La tensione è proporzionale al logaritmo dell'attività ione specifico secondo l'Nernst equation consentendo il calcolo della concentrazione di ioni (Figura 2A e B).
Attualmente, alcuni sistemi permettono la misurazione del flusso ionico usando un concetto o principio simile. Ad esempio, l'elettrodo tecnica di scansione ionoselettivo (SIET) 12,13 o il (MIFE) tecnica microelettrodo Ion Flux Stima sviluppata da Newman e Shabala 14-16 sono disponibili in commercio e ampiamente utilizzati dalla comunità di ricerca al fine di determinare ione specifico fondenti si verificano a membrana e tessuti cellulari attraverso una varietà di animali, piante e modelli a cella singola vita. Microelettrodi ionoselettivi sono stati utilizzati per misurare l'idrogeno, il potassio e il flusso di calcio attraverso le radici delle piante 17, flux cloruro nel ratto arterie cerebrali 18 e in tubetti pollinici 19, flusso di idrogeno in cellule retiniche pattino 20, flusso di calcio nelle ossa del mouse 21, ione vari flussi di ife fungine e 22 in ra 23 della cornea, e, infine, il flusso di calcio durante ferita singola cellula di guarigione 12,24. Si veda anche la seguente recensione per informazioni dettagliate sul ionoselettive autoreferenziali microelettrodi 25.
Il seguente articolo descrive in dettaglio come preparare ed eseguire la misurazione di flussi ionici endogeni extracellulari utilizzando l'autoreferenziale tecnica microelettrodi ionico selettivo a livello di singola cellula.
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Protocol
1. Ion-selettivi autoreferenziale microelettrodo Preparazione
- Preparazione di microelettrodo ione-selettivi
- Tirare calore sottili capillari borosilicato a parete senza filamento (diametro esterno 1,5 mm 1,12 millimetri di diametro interno) con un estrattore microelettrodo.
Nota: questo dà consigli 3-4 micron di diametro. Punte piccole hanno resistenza superiore che rende microelettrodi più sensibili al rumore elettronico ed è anche associato ad una risposta più lenta ad una variazione della concentrazione di ioni. Informazioni utili si possono trovare nel documento pubblicato da Smith et al. 26. - Silanizzata gli elettrodi per rendere idrofoba la superficie interna per favorire la ritenzione del cocktail ionoforo lipofilo. Posizionare i microelettrodi in un rack metallo e calore O / N in stufa a> 100 ° C per asciugarlo. Il rack è una piastra metallica con due millimetri fori di diametro forato parte fino in fondo. Posizionare gli elettrodi nei fori punta verso l'alto con una da 250 ml gcoppa lass su di loro.
- Al mattino, spegnere il forno e indossando guanti isolanti, rimuovere con attenzione il rack di metallo con gli elettrodi e coppa in atto. Chiudere la porta del forno per trattenere il calore.
- Indossare lattice o nitrile, camice da laboratorio e occhiali di protezione. Con una plastica pipetta Pasteur, una goccia di soluzione di silanizzazione che alla base di ciascun elettrodo (mantenere il becher in luogo, utilizzare il beccuccio per l'accesso pipetta). La soluzione silanizzazione viene vaporizzato dalla piastra calda e silanizes l'interno degli elettrodi. Utilizzare una cappa aspirante chimico per questa fase. Posizionare i rack / bicchiere / elettrodi in forno caldo per qualche ora per permettere qualsiasi soluzione silanizzazione residuo di evaporare.
Nota: per motivi di sicurezza, non accendere il forno indietro. Collocare un'etichetta sul forno indicare che non deve essere acceso in quanto può contenere vapori nocivi e infiammabili. - Dopo il raffreddamento, memorizzare i microelettrodi in una memoria microelettrodo barattolo inside essiccatore bicchiere con 400 g di essiccante. Microelettrodi possono essere conservati così per molte settimane.
Nota: Un metodo alternativo è descritto silanizzazione in Smith et al 26. - Back-riempire il microelettrodo con 50 a 100 microlitri (una lunghezza di circa 1 cm) di una soluzione contenente 100 mM dello ione da misurare (vedi Tabella 1 e Figura 1B). Utilizzare una plastica Pasteur calore pipetta monouso tirato in un becco Bunsen per una multa filamento. Sciacquare la pipetta in dH 2 O in seguito per evitare il blocco.
Nota: In alternativa, regolare la concentrazione di ioni della soluzione riempimento per abbinare la concentrazione di ioni nella soluzione esterna 27. - Osservare il microelettrodo sotto un microscopio da dissezione per garantire l'assenza di bolle d'aria.
- Se le bolle sono presenti rubinetto microelettrodo leggermente con un'unghia mentre si tiene l'elettrodo in verticale (punta verso il basso) e / o spingere la bollas la punta applicando contropressione usando una siringa modificato con un tubo in silicone sostituire l'ago.
- Tip-riempire il microelettrodo con 15-20 nl (una lunghezza di 30-50 micron) di specifici ioni ionophore cocktail (vedi tabella 1). Mettere una piccola goccia di ionophore cocktail sul lato corto di un vetrino da microscopio. Osservare la punta microelettrodo sotto un microscopio da dissezione e spostarlo verso il vetrino da microscopio fino alla punta microelettrodo tocca il cocktail ionoforo solo per circa mezzo secondo. Disegnare il cocktail ionoforo nel microelettrodo dalla pressione capillare.
Nota: evitare una lunga colonna di ionophore cocktail come questo aumenta la resistenza elettrica della sonda che può rendere sensibili alle interferenze elettroniche (rumore) e rallenta anche il tempo di risposta. - Montare il microelettrodo in un supporto microelettrodo dritto con un oro 1 millimetri connettore maschio e AgCl (Ag +) filo (Figura 1B). </ Li>
- Fissare il supporto microelettrodo allo stadio testa montata su un computer controllato tridimensionale micropositioner elettronico (Figura 1A).
- Posizionare la punta microelettrodo in misura soluzione appropriata per il campione da misurare (soluzione salina fisiologica, terreno di coltura, etc.) per consentire il microelettrodo si stabilizzi per un ora o due, o anche durante la notte.
- Tirare calore sottili capillari borosilicato a parete senza filamento (diametro esterno 1,5 mm 1,12 millimetri di diametro interno) con un estrattore microelettrodo.
- Preparazione dell'elettrodo di riferimento
- Elettrodi di riferimento (Figura 1C) sono gli stessi capillari come sopra. Tagliare il capillare con una matita diamante in cinque centimetri di lunghezza e fuoco lucidato a ciascuna estremità per 1-2 secondi in una fiamma Bunsen.
- Riempire questi elettrodi con ~ 200 ml di una soluzione di NaCl 3 M, CH 3 CO 2 K (acetato di potassio) o KCl con 2% di agarosio. Scegliere la soluzione a seconda dello ione da misurare (l'elettrodo di riferimento non deve contenere lo ione da misurare; vedere Tabella 1). Mescolarel'agarosio e la soluzione e calore per quasi bollire in un forno. Mescolare per sciogliere l'agarosio (la soluzione va chiaro).
- Attaccare l'elettrodo di riferimento a un Pasteur pipetta di plastica e disegnare la soluzione calda nel capillare.
- Eliminare l'elettrodo nella fredda 3 M NaCl, CH 3 CO 2 K o soluzione KCl e conservare in questa soluzione 3 M in tubi sigillati prima dell'uso. Eliminare eventuali elettrodi di riferimento con le bolle d'aria.
- Montare l'elettrodo di riferimento in un supporto microelettrodo retta pellet (pre-riempita con 3 M soluzione) con AgCl (Ag +) all'interno ed un oro 2 millimetri connettore maschio (Figura 1C) e fissare l'elettrodo e supporto su un micro-posizionatore manuale montato su un supporto magnetico.
2. Ion-selettivi autoreferenziale microelettrodo Calibrazione
- Preparare soluzioni taratura contenenti lo ione di interesse come nella soluzione di riferimento; vedi Tabella 1 (es terreni di coltura, soluzione salina fisiologica). Cioè, una soluzione di calibrazione deve contenere una concentrazione inferiore di ioni che nella soluzione di misura, e uno superiore.
- Ad esempio, utilizzare salina contenente 1 mM di K +. Alla staffa questa concentrazione, sciogliere KCl polvere in acqua deionizzata ad una concentrazione di 10, 1 e 0,1 mM in diluizioni seriali. Utilizzare queste soluzioni di taratura. In alternativa, utilizzare almeno due di queste soluzioni.
- Immergere il microelettrodo ione-selettivo e l'elettrodo di riferimento in ciascuna soluzione di taratura e lasciare che il valore di tensione stabilizzi per 1 a 3 min prima di registrare la tensione corrispondente utilizzando il software dedicato (vedi Tabella 1).
- Poiché il software salva i dati (uscita dell'amplificatore) come un file txt, copiare i dati in un file di foglio di calcolo. Tracciare l'uscita microelettrodo (mV) contro il logaritmo dellala concentrazione molare di ioni (Figura 2A).
- Applicare una regressione lineare e calcolare il Nernst pendio, intercettare e valore R 2. Accettare il microelettrodo se la pendenza di Nernst è 58 ± 11 mV / decade per gli ioni monovalenti e 29 ± 11 mV / decade per ioni bivalenti (per cationi, la pendenza Nernst è positivo, per anioni è negativo). Inoltre, buone microelettrodi dovrebbero avere una forte correlazione lineare (R 2> 0.9; Figura 2B).
Nota: L'uscita mV dell'amplificatore usato qui dà lettura mV con un guadagno di dieci volte. I valori devono essere diviso per un fattore di dieci. - Utilizzare la formula di regressione lineare per convertire l'uscita grezza mV del microelettrodo in concentrazione di ioni reale (Figura 2B).
3. La convalida della tecnica microelettrodo ionoselettivo
- Preparazione di una sorgente artificiale
- Capillari sorgenti artificiali sono le stesse come capillarisopra. Calore tirare il capillare con un estrattore microelettrodo come al punto 1.1.1.
- Backfill questi capillari con 200 ml di una soluzione di NaCl, KCl 1 M, CaCl 2 2 H 2 O o pH 4 buffer. Scegliere la soluzione sorgente artificiale seconda ione da misurare (vedi Tabella 1).
Nota: in alternativa, tirare elettrodi con grande diametro della punta (~ 20 micron) e mancia riempire con le stesse soluzioni, ma contenente 0,5-1% agarosio (agarosio impedirà qualsiasi flusso di massa di soluzione). - Montare capillare sorgente artificiale su un micromanipolatore ed immergerlo nella soluzione usata per misurare il flusso dello ione nei campioni. Lasciare la sorgente artificiale nella soluzione per 30 minuti per 1 ora per permettere la stabilizzazione del gradiente.
- Convalida del microelettrodo ionico selettivo
- Immergere il microelettrodo ionoselettivo circa un centimetro di distanza dal capillare sorgente artificiale nella soluzione utilizzata per misure il flusso di ioni sui campioni e chiudere il circuito con l'elettrodo di riferimento come prima. Che il valore di tensione stabilizzi per 1 a 3 min prima di registrare la tensione corrispondente utilizzando il software dedicato per 1 a 2 min. Questo valore corrisponde al valore del tampone (in letteratura indicato anche come riferimento, sfondo o valore di bianco).
- Spostare il microelettrodo ionoselettivo a circa 5 micron dalla sorgente artificiale e lasciare che il valore di tensione stabilizzi per 1 a 3 min prima di registrare la tensione corrispondente utilizzando il software per 1 a 2 min.
- Ripetere la procedura sopra posizionando il microelettrodo selettivo ione a 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 e 1280 micron lontano dal capillare sorgente artificiale.
- Estrarre i dati come un file txt e copiare i valori in un foglio di calcolo.
- Calcolare la concentrazione di ioni corrispondente ai valori mV nello stesso modo come per i valori di calibrazione. Tracciare il valore.
Note: Se un flusso di ioni è presente, il microelettrodo rileva una differenza di concentrazione di ioni tra le due posizioni (Figura 3B). Se la sorgente artificiale contiene più ioni della specie misurati rispetto alla soluzione, la concentrazione dovrebbe essere superiore vicino alla fonte di lontano, convalidando la capacità del microelettrodo ione-selettivo, per rilevare correttamente la direzione di un flusso di ioni (in questo caso efflusso, per un dissipatore artificiale, con una concentrazione di ioni specifico inferiore misura media, dovrebbe essere afflusso).- Calcolare il flusso ionico usando la legge di Fick di diffusione: J = c μ (dc / dx) dove c è la concentrazione di ioni nella soluzione (mol cm -3), μ è la mobilità ionica (mol cm N -1 sec -1) e dc è la differenza di concentrazione a distanza dx (cm) (Figura 2C). Dati flusso di ioni di solito sono presentati in pmol cm -2 s-1 O nmol cm -2 s -1.
Nota:.. Un metodo alternativo di calcolo flusso di ioni descritto da Smith et al 26 può essere utilizzato. Differenze principali includono l'uso del coefficiente di diffusione anziché la mobilità ionica e la sottrazione del flusso sfondo ione (anche tensione deriva o fattore di correzione) calcolata dalla misura del flusso di ioni in soluzione salina senza campione. - Tracciare la media dei flussi ionici di ogni passo contro la distanza dalla sorgente (Figura 2D). Allontanandosi dalla sorgente, osservare una diminuzione esponenziale del valore di flusso convalidare la capacità del microelettrodo ione-selettivi per rilevare diversa grandezza dei flussi ionici.
- Effettuare la convalida sorgente artificiale volta per ogni ione specifico destinato ad essere registrata per convalidare il corretto direzione e la grandezza misurazioni con un grande segnale-nRapporto Oise.
Nota: Ion misurazione del flusso del buffer senza campioni risulta il livello di fondo o rumore. Tipicamente, la misura del buffer non presenta alcuna chiara fluttuazione della concentrazione di ioni conduce a molto piccolo flusso che mostra direzioni variabili.
- Calcolare il flusso ionico usando la legge di Fick di diffusione: J = c μ (dc / dx) dove c è la concentrazione di ioni nella soluzione (mol cm -3), μ è la mobilità ionica (mol cm N -1 sec -1) e dc è la differenza di concentrazione a distanza dx (cm) (Figura 2C). Dati flusso di ioni di solito sono presentati in pmol cm -2 s-1 O nmol cm -2 s -1.
4. Preparazione della camera di misurazione
Nota: Prima di esperimenti, si consideri il campione da misurare e come il campione deve essere montato e immobilizzato per misure microelettrodi.
- Per Xenopus laevis misurazioni ovociti tagliati da 1 cm quadrato di una rete di 800 micron di nylon (maglia Nitex) e colla in un piatto di plastica Petri (Figura 1E).
5. Ion Flux misura
- Misurare la concentrazione di ioni presenti nel buffer utilizzato per eseguire le misurazioni sul campione nello stesso modo come per la soluzione di calibrazione. X. ovociti laevis richiedono Modified Ringer Mark (MMR). Dissolve NaCl, KCl, CaCl, MgCl e HEPES in acqua deionizzata per raggiungere una concentrazione finale di (mM): 100 NaCl, KCl 2, 2 CaCl, 1 MgCl e 5 HEPES. Regolare il pH del tampone a 7,5 usando NaOH.
- Posizionare il campione nella camera di misura e portare il microelettrodo ionoselettivo vicino al campione (circa 10 micron di distanza) utilizzando il micropositioner per definire la posizione di chiusura del microelettrodo (Figura 3A).
- Avviare l'escursione bassa frequenza (0,3 Hz) (100 micron) del microelettrodo tra la posizione di chiusura ed una posizione di distanza dal campione (distante) utilizzando il software dedicato. Assicurarsi che il movimento del microelettrodo è perpendicolare alla superficie del campione.
Nota: L'escursione del microelettrodo può essere impostato sul software. Grande escursione aumenta il gradiente di lettura permettendo una facile individuazione di piccoli flussi durante il tempo di misurazione allunga l'intervallo di campionamento e diminuisce la risoluzione temporale. Vedere- Avviare la registrazione tramite il software. Il microelettrodo ferma in ogni punto ed il potenziale elettrico in mV è registrato sul computer. Ottenere misurazioni per almeno 2 minuti, consentendo la stabilizzazione del segnale. Per gli esperimenti time-lapse brevi, registrano potenziali variazioni in corrispondenza della posizione di interesse per tutto il corso del tempo.
- Estrarre i dati come un file txt e copiare i valori in un foglio di calcolo.
- Calcolare la concentrazione di ioni corrispondente ai valori mV nello stesso modo come per i valori di calibrazione. Tracciare il valore.
Nota: Se un flusso di ioni è presente, il microelettrodo rileva una differenza di concentrazione di ioni tra le due posizioni (Figura 3B).- Calcolare il flusso ionico usando la legge di Fick di diffusione come prima (fase 3.3.1).
- Ripetere la misura tampone prima di misurare un nuovo campione e ripetere la procedura di misura del flusso e di calcolo per ogni nuovocampione.
6. Analisi statistica dei dati e presentazione
- Verificare gli effetti indipendenti della posizione e / o del tempo su flussi ionici sotto la condizione di controllo che utilizzano un modello ANCOVA con effetti misti 28.
Nota: L'analisi della covarianza (ANCOVA) è un modello lineare generale che mescola regolare ANOVA e regressione, consentendo misure sia categoriali e continui a essere utilizzati come variabili indipendenti. Inoltre, in presenza di errori correlati indotti da misure ripetute per effetti nidificati individuali ed eventuali, modelli ad effetti misti vengono utilizzati per modellare stime accurate sia effetti fissi e casuali. - Calcola confronti a coppie con Student t-test tra i livelli di gruppo con correzione di Bonferroni per test multipli 28.
- Generare grafici a scatole per riassumere misure di flusso di ioni a seconda della posizione e del tempo. Includere valori di p dalla t Student coppie descrittosopra (Figura 3D) e indicare i livelli di significatività dei valori p come segue: *: p <0.05; **: P <0.01; ***: P <0.001 29
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Representative Results
Abbiamo precedentemente dimostrato che l'influsso di calcio compare dopo singola cellula ferendone 24. Abbiamo quindi chiesto se gli altri flussi ionici si verificano su di ferimento singola cellula. Abbiamo usato la X. laevis ovocita, un modello consolidato per singola cella la guarigione delle ferite 30-34 e registrazione elettrofisiologica 24,35-39. È interessante notare, gli ioni potassio sono più concentrati all'interno X. laevis ovociti (circa 110 mm) 40 rispetto alla soluzione extracellulare utilizzata (in MMR 1x: 1 mm) suggerendo un efflusso di potassio sul ferimento. Per confermare questa ipotesi, abbiamo misurato il flusso di potassio nel corso di X. laevis cellula ovocita membrana guarigione utilizzando il autoreferenziale microelettrodi ioni-selettivi.
Per ferire l'ovocita, prima tirare un elettrodo capillare con un grande formato di punta (~ 50 micron). Attaccare l'elettrodo ad un portaelettrodo dritto e montare su un micro-posizionatore manuale. Ferita la oocyte toccando la membrana con l'elettrodo 24. Subito dopo il ferimento abbiamo rilevato una grande efflusso di potassio (fino a 250 nmol cm -2 sec -1; Figura 3B - D). Come la ferita guarita membrana, questo flusso diminuita, tornando su valori illesi flusso visto nella membrana intatto (~ 5 nmol cm -2 sec -1) quando la ferita guarita (fino a 16 minuti dopo il ferimento; Figura 3B - D). ANCOVA rivelato un effetto significativo di tempo dopo il ferimento su misure di flusso di potassio (p <0.001). Post hoc analisi hanno rivelato significativamente aumentato efflusso di potassio a 1-2 min (p <0.001) ea 5-6 min (p <0,05), ma Non a 15-16 min dopo ferendo rispetto ai intatta condizione membrana cellulare (Figura 3D). Abbiamo concluso che al ferimento singola cellula, un efflusso di potassio appare a livello della ferita che diminuisce dusuonare il corso di guarigione.
| Ione | Ionophore cocktail | Soluzione di elettroliti (100 mm) | Soluzione di riferimento (3 M) | Soluzione di fonte artificiale (1 M) |
| Ca 2+ | Il calcio ionoforo I Cocktail A (cat # 21048) | CaCl 2 2H 2 O | KCl | CaCl 2 2H 2 O |
| Na + | Sodium ionoforo II Cocktail A (cat # 71178) | NaCl | KCl | NaCl |
| Cl - | Chloride ionoforo I Cocktail A (cat # 24902) | NaCl | CH 2 CO 2 K (Potassio Acetate) | NaCl |
| K + | Potassio ionoforo I Cocktail A (cat # 60031) KCl | NaCl | KCl | |
| H + | L'idrogeno ionoforo I Cocktail A (cat # 95291) | pH 7,0 | KCl | pH 4.0 |
Tabella 1:. Esempi di cocktail ionofori comunemente utilizzati anche mostrato consiste in soluzioni appropriate da inserire nella microelettrodi, per l'origine artificiale e per eseguire la calibrazione. I numeri di catalogo sono di Sigma-Aldrich.
Figura 1:. Microelettrodi ionoselettivi (A) Rappresentazione schematica del sistema microelettrodo autoreferenziale ione-selettivo. Microelettrodo (B) ionoselettivo. (C) elettrodo di riferimento. (D) scambio ionico tra la soluzione esterna e il Microelectrode tramite il ionoforo. (E) Schema di camera di misurazione utilizzato per X. laevis ovocita.
Figura 2: microelettrodi Ion-selettivi di calibrazione, di origine artificiale e calcolo del flusso (A) Curva di calibrazione.. (B) Equazione della curva di calibrazione e calcolo della concentrazione di ioni. (C) Calcolo del flusso di ioni. Flusso (D) Ion misurato a distanze specifiche dalla sorgente artificiale (1 M KCl).
Figura 3: Evoluzione del flusso di potassio ad X. laevis ovocita ferite durante la guarigione. (A) Fotografia e illustrazione dell'escursionedel microelettrodo ionoselettivo misurare la concentrazione di ioni a X. laevis ovocita ferita; la linea tratteggiata tra '' a '' e '' V '' rappresenta l'asse animale-vegetale. (B) Illustrazione della variazione della concentrazione di ioni potassio a X. laevis ovocita ferite durante la guarigione. (C) Scatter (xy) diagramma che mostra la media e l'errore standard di misura potassio flusso a livello della ferita in tempi diversi durante X. laevis ovocita la guarigione delle ferite. (D) Boxplot mostrando misurazione flusso di potassio a livello della ferita in tempi diversi durante X. laevis ovocita Wound Healing (n = 16; p valori indicati come segue: *: p <0.05; ***: p <0.001).
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Discussion
Le fasi più critiche per la misurazione successo flussi ionici extracellulari in vivo sono: la riduzione del rumore, la corretta realizzazione dell'elettrodo microelettrodi ionoselettivi e riferimento, e il posizionamento del campione e due elettrodi.
Per minimizzare il rumore, il sistema di registrazione dovrebbe essere collegato a terra (massa) gabbia di Faraday preferibilmente con un (isolamento dalle vibrazioni) Tavolo metallo con ripiano che è anche collegata a terra. Inoltre, il telaio microscopio dovrebbe anche essere collegato a terra. Le fonti di rumore elettrico includono la sorgente luminosa. Una sorgente di luce 'fan-less' fibra ottica provoca rumore elettrico minimo. Infine, mantenendo il filo d'argento e pellet nel microelettrodo titolari clorurata anche minimizza il rumore (tuffo di sodio ipoclorito di candeggina e sciacquare in dH 2 O) .La presenza di bolle d'aria nel microelettrodi ionico selettivo o l'elettrodo di riferimento si tradurrà in misura fallimento come laconducibilità del microelettrodo sarà nullo o compromessa. Pertanto, è fondamentale per verificare gli elettrodi al microscopio prima di montare sui supporti. Vedere il protocollo per la procedura dettagliata per eliminare le bolle d'aria. Il corretto posizionamento sia del campione e le microelettrodi sono necessari al fine di garantire risultati affidabili e riproducibili. La misurazione del flusso di ioni dipende l'escursione del microelettrodo e la sua posizione rispetto al campione. È importante identificare con precisione l'area di interesse che sarà misurato sul campione e posizionare il microelettrodo avere dal campione un movimento perpendicolare. Qualsiasi escursione delle microelettrodi in un modo che non è perpendicolare al campione comporterà ione alterato fondenti misurazioni e maggiore variabilità tra i campioni.
Cocktail ionoforo dedicati per misurare ioni specifici, ad esempio il potassio, possono anche rilevare la presenza di altri ioni, come il sodio.Nel caso in cui la soluzione di misura contiene una quantità elevata di uno ione in competizione per il cocktail ionoforo, è importante determinare la selettività del cocktail ionoforo utilizzando l'esperimento sorgente artificiale. Qui, la soluzione utilizzata per la cultura X. ovociti laevis (MMR) contiene un'alta concentrazione di sodio. Pertanto, è importante valutare se il cocktail ionoforo potassio utilizzata anche rileva sodio. Utilizzando il microelettrodo ionoforo potassio cocktail riempito, possiamo tentare di misurare un flusso di sodio utilizzando una sorgente artificiale che contiene alta concentrazione di sodio (1 M NaCl, vedi Tabella 1) mantenendo la stessa soluzione di misura. Il gradiente chimica favorisce l'efflusso di sodio, ma idealmente non flusso di sodio deve essere rivelata con ionoforo cocktail specifico potassio. Se un flusso significativo è misurata, la condizione sperimentale deve essere ottimizzato. Ad esempio, la concentrazione dello ione concorrente potrebbe essere abbassato fino al punto al microelectrode non percepisce più, mentre questo può influenzare il flusso di sodio attraverso la membrana plasmatica che porta a possibili interferenze durante le misure di flusso di potassio. Idealmente, un fattore di correzione calcolato dall'esperimento sorgente artificiale può essere applicato ai dati, o un altro cocktail ionoforo può essere testato. Ion cambiamento continuo misurazioni utilizzando i microelettrodi autoreferenziali ionoselettivi permettono la misurazione di flussi ionici che si verificano in cellule e tessuti in soluzione acquosa. Misure di flussi ionici in cellule o tessuti che sono normalmente a contatto con un ambiente di aria richiede la presenza di una soluzione che non è naturalmente presente nel loro ambiente e che può alterare il flusso di ioni e di scambio che si verifica in condizioni normali. Particolare attenzione deve essere fatta per definire il contenuto di tale soluzione e minimizzare la deviazione dall'ambiente originale, fisiologico. Lo spettro di ioni che possono essere misurati dai microele autoreferenziali ionoselettivitecnica ctrode dipende dalla disponibilità e l'esistenza di specifici cocktail ionofori selettivi allo ione di interesse.
Misure di flusso Ion eseguite con la autoreferenziale microelettrodi ioni-selettivi sono fatti in soluzione, di solito vicino alla superficie di cellule o tessuti, permettendo la misurazione non invasiva di flussi ionici extracellulari. Questo metodo non consente la misurazione di flussi ionici nei tessuti, tra cellula e lo spazio intercellulare. L'auto-riferimento microelettrodo ionoselettivo non è l'unico metodo che permette di misurare flussi ionici in vivo. Un nuovo metodo alternativo utilizza reporter bioelettricità fluorescenti 41 che consente di misurare flussi ionici che non sono possibili utilizzando microelettrodi. Questi coloranti consentono misurazioni di ioni flussi all'interno tessuti e cellule e possono ottenere una localizzazione subcellulare. Questa tecnica può acquisire informazioni spaziali del flusso di ioni all'interno dei tessuti e cellule, ma non ionico excambiare tra il tessuto e lo spazio extracellulare. Inoltre, i giornalisti bioelettricità fluorescenti di solito generano dati semi-quantitativi. L'uso della tecnologia basata microelettrodi-per misurare flussi ionici è ancora valido e necessario e porta informazioni aggiuntive per l'utilizzo del reporter bioelettricità fluorescenti, che li rende complementari piuttosto che tecniche di competere. Inoltre, interessanti sviluppi recenti ricordiamo rivelatori amperometrici autoreferenziali di ossigeno, ossido di azoto e neurotrasmettitori dopamina e il glutammato 42,43. Rilevamento amperometrico si basa su una reazione chimica sulla punta del sensore. Microelettrodi nuova fibra ottica ("optrodes"), sono stati sviluppati per misurare in modo non invasivo flusso di ossigeno metabolica 34,35 e pH 44 con alta selettività e sensibilità 45,46. Ora c'è anche una sonda nanoparticelle rivestite a base di enzimi sensibili al glucosio 47.
Abbiamo visto che the ioni-selettivi autoreferenziale microelettrodi consente misurazioni dei flussi di ioni extracellulari in vivo. Gli ioni sono non solo scambiati fra le cellule / dei tessuti e lo spazio extracellulare, ma anche tra le cellule e tessuti negli organismi viventi. È importante combinare questa tecnica con altri, come reporter bioelettricità fluorescenti per apprezzare la risoluzione spaziale dei flussi ionici nei tessuti oltre alle misure reali dei flussi ionici vicino la sua superficie. Inoltre, flussi ionici rappresentano una parte importante dello stato bioelettrica che definisce cellule e tessuti con potenziale di membrana cellulare, potenziale trans-epiteli o correnti elettriche extracellulari. È importante, in aggiunta alla misurazione di flussi ionici, di misurare, in combinazione, membrana cellulare e potenziale trans-epiteli e correnti elettriche extracellulari 24.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IonAmp | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Headstage pre-amplifier | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| MicroStep Driver | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Manual micropositioner | World Precision Instruments | Model KITE-R | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | Model M10 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Vibration isolation table | Newport Inc. | Model VW-3036-OPT-023040 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces | Newport Inc. | Model 360-90 | Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table |
| Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | none |
| Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | none |
| Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament | World Precision Instruments | TW150-4 | none |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | none |
| Metal rack | Made in-house | none | Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel |
| Oven | QL | Model 10 Lab Oven | none |
| Silanization solution I | Sigma-Aldrich | 85126 | Hazardous, handle as recommended by provider |
| Glass Petri dish; Pyrex | Fisher Scientific | 316060 | none |
| Electrode/micropipette storage jar | World Precision Instruments | E215 | none |
| Glass dessicator | Fisher Scientific | 08-595E | Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight. |
| Plastic Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11597722 | none |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | S97329 | none |
| Microscope slide | Sigma-Aldrich | S8902 | none |
| Straight microelectrode holder | Warner Instruments | QSW-A15P | with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire |
| Straight microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH3S | with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector |
| 6 cm Petri dish | VWR | 60872-306 | none |
| Nitex mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX750 | none |
| Glue; Loctite epoxy | VWR | 500043-451 | Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing |
| Deionized water | Sigma-Aldrich | 99053 | none |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | none |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | none |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | none |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | none |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | none |
| Sodium Hydroxyde | Sigma-Aldrich | S8045 | none |
| Potassium Acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | none |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | none |
References
- Weber, W. M., Liebold, K. M., Clauss, W. Amiloride-sensitive Na+ conductance in native Xenopus oocytes. Biochimica et biophysica acta. 1239, 201-206 (1995).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. Journal of cell science. 122, 4267-4276 (2009).
- Zhao, M. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Seminars in cell & developmental biology. 20, 674-682 (2009).
- Jaffe, L. F., Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. The Journal of cell biology. 63, 614-628 (1974).
- Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nature protocols. 2, 661-669 (2007).
- Reid, B., Zhao, M. Measurement of bioelectric current with a vibrating probe. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Moore, J. W. The patch clamp: single-channel recording. Science. 224, 50-51 (1984).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of visualized experiments. , (2008).
- McCaig, C. D., Robinson, K. R. The ontogeny of the transepidermal potential difference in frog embryos. Developmental biology. 90, 335-339 (1982).
- Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F. Detection of extracellular calcium gradients with a calcium-specific vibrating electrode. The Journal of cell biology. 110, 1565-1573 (1990).
- The use of the vibrating probe technique to study steady extracellular currents during pollen germination and tube growth. Fertilisation in Higher Plants: molecular and cytological aspects. Cai, G., Cresti, M., Moscatelli, A. , Springer-Verlag. 235-252 (1999).
- Kunkel, J. G., Xu, Y., Shipley, A. M., Feijó, J. A. The use of non-invasive ion-selective microelectrode techniques for the study of plant development. Plant Electrophysiology – Theory and Methods. (ed Volkov AG. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 109-137 (2006).
- Ordonez, N. M., Shabala, L., Gehring, C., Shabala, S. Noninvasive microelectrode ion flux estimation technique (MIFE) for the study of the regulation of root membrane transport by cyclic nucleotides. Methods in molecular biology. 1016, 95-106 (2013).
- Tegg, R. S., Melian, L., Wilson, C. R., Shabala, S. Plant cell growth and ion flux responses to the streptomycete phytotoxin thaxtomin A: calcium and hydrogen flux patterns revealed by the non-invasive MIFE technique. Plant & cell physiology. 46, 638-648 (2005).
- Newman, I. A. Ion transport in roots: measurement of fluxes using ion-selective microelectrodes to characterize transporter function. Plant, cell & environment. 24, 1-14 (2001).
- Kochian, L. V., Shaff, J. E., Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F., Lucas, W. J. Use of an extracellular, ion-selective, vibrating microelectrode system for the quantification of K(+), H (+), and Ca (2+) fluxes in maize roots and maize suspension cells. Planta. 188, 601-610 (1992).
- Doughty, J. M., Langton, P. D. Measurement of chloride flux associated with the myogenic response in rat cerebral arteries. The Journal of physiology. 534, 753-761 (2001).
- Messerli, M. A., Smith, P. J., Lewis, R. C., Robinson, K. R. Chloride fluxes in lily pollen tubes: a critical reevaluation. The Plant journal : for cell and molecular biology. 40, 799-812 (2004).
- Molina, A. J., et al. Neurotransmitter modulation of extracellular H+ fluxes from isolated retinal horizontal cells of the skate. The Journal of physiology. 560, 639-657 (2004).
- Marenzana, M., Shipley, A. M., Squitiero, P., Kunkel, J. G., Rubinacci, A. Bone as an ion exchange organ: evidence for instantaneous cell-dependent calcium efflux from bone not due to resorption. Bone. 37, 545-554 (2005).
- Lew, R. R. Ionic currents and ion fluxes in Neurospora crassa hyphae. Journal of experimental botany. 58, 3475-3481 (2007).
- Vieira, A. C., et al. Ionic components of electric current at rat corneal wounds. PloS one. 6, e17411 (2011).
- Luxardi, G., Reid, B., Maillard, P., Zhao, M. Single cell wound generates electric current circuit and cell membrane potential variations that requires calcium influx. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 6, 662-672 (2014).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. H. , (2007).
- Smith, P. J., Hammar, K., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Trimarchi, J. R. Self-referencing, non-invasive, ion selective electrode for single cell detection of trans-plasma membrane calcium flux. Microscopy research and technique. 46, 398-417 (1999).
- Messerli, M. A., Smith, P. J. Construction theory, and practical considerations for using self-referencing of Ca(2+)-selective microelectrodes for monitoring extracellular Ca(2+) gradients. Methods in cell biology. 99, 91-111 (2010).
- Chambers, J., Hastie, T., Pregibon, D. Ch. 48. Compstat. Momirović, K., Mildner, V. , Physica-Verlag HD. 317-321 (1990).
- Chambers, J. M., Cleveland, W. S., Kleiner, B., Tukey, P. A. Graphical methods for data analysis. , Wadsworth & Brooks/Cole. (1983).
- Burkel, B. M., Benink, H. A., Vaughan, E. M., von Dassow, G., Bement, W. M. A Rho GTPase signal treadmill backs a contractile array. Developmental cell. 23, 384-396 (2012).
- Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current biology : CB. 9, 579-587 (1999).
- Mandato, C. A., Bement, W. M. Contraction and polymerization cooperate to assemble and close actomyosin rings around Xenopus oocyte wounds. The Journal of cell biology. 154, 785-797 (2001).
- Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. The Journal of cell biology. 168, 429-439 (2005).
- Simon, C. M., Vaughan, E. M., Bement, W. M., Edelstein-Keshet, L. Pattern formation of Rho GTPases in single cell wound healing. Molecular biology of the cell. 24, 421-432 (2013).
- Petersen, C. C., Dupont, G. The initiation of a calcium signal in Xenopus oocytes. Cell calcium. 16, 391-403 (1994).
- Horisberger, J. D., Lemas, V., Kraehenbuhl, J. P., Rossier, B. C. Structure-function relationship of Na,K-ATPase. Annual review of physiology. 53, 565-584 (1991).
- Miledi, R. A calcium-dependent transient outward current in Xenopus laevis oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. London, England, , 491-497 (1982).
- Miledi, R., Parker, I. Chloride current induced by injection of calcium into Xenopus oocytes. The Journal of physiology. 357, 173-183 (1984).
- Parker, I., Miledi, R. A calcium-independent chloride current activated by hyperpolarization in Xenopus oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. 233, 191-199 (1988).
- Costa, P. F., Emilio, M. G., Fernandes, P. L., Ferreira, H. G., Ferreira, K. G. Determination of ionic permeability coefficients of the plasma membrane of Xenopus laevis oocytes under voltage clamp. The Journal of physiology. 413, 199-211 (1989).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 385-397 (2012).
- Porterfield, D. M. Measuring metabolism and biophysical flux in the tissue, cellular and sub-cellular domains: recent developments in self-referencing amperometry for physiological sensing. Biosensors. 22, 1186-1196 (2007).
- McLamore, E. S., et al. A self-referencing glutamate biosensor for measuring real time neuronal glutamate flux. Journal of neuroscience methods. 189, 14-22 (2010).
- Yin, M., et al. Highly sensitive and fast responsive fiber-optic modal interferometric pH sensor based on polyelectrolyte complex and polyelectrolyte self-assembled nanocoating. Analytical and bioanalytical chemistry. 399, 3623-3631 (2011).
- Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrode technology for non-invasive real-time measurement of biophysical flux and physiological sensing. The Analyst. 134, 2224-2232 (2009).
- McLamore, E. S., Jaroch, D., Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrodes for measuring spatially resolved, real-time metabolic oxygen flux in plant systems. Planta. 232, 1087-1099 (2010).
- McLamore, E. S., et al. A self referencing platinum nanoparticle decorated enzyme-based microbiosensor for real time measurement of physiological glucose transport. Biosensors & bioelectronics. 26, 2237-2245 (2011).
