Abstract
Celler fra dyr, planter og enkeltceller er omsluttet av en barriere som kalles cellemembran som skiller cytoplasma fra utsiden. Cellelag slik som epitel danner også en barriere som skiller det indre utenfra eller forskjellige avdelinger av flercellede organismer. Et viktig trekk ved disse barrierene er differensial fordeling av ioner over cellemembranen eller cellelagene. To eiendommer tillate denne fordelingen: 1) membraner og epithelia vise selektiv permeabilitet til spesifikke ioner; 2) ioner transporteres gjennom pumpene over cellemembranen og cellelagene. Disse egenskapene spille viktige roller i å opprettholde vev fysiologi og fungere som signaliserte signaler etter skade, under reparasjonen, eller under patologisk tilstand. Den ion-selektive selvreferanse microelectrode tillater målinger av spesifikke flukser av ioner slik som kalsium, kalium eller natrium ved enkeltcelle og vevsnivåer. Den microelectrode inneholder en ionofor cocktail som erselektivt gjennomtrengelig for et bestemt ion. Den indre fyllingsoppløsning inneholder et sett konsentrasjon av det ion av interesse. Det elektriske potensial til mikroelektroden bestemmes av utsiden konsentrasjonen av ionet. Som ione-konsentrasjonen varierer, potensialet i microelectrode forandrer seg som en funksjon av logaritmen av ioneaktivitet. Når den beveges frem og tilbake i nærheten av en kilde eller vask av det ion (dvs. i en konsentrasjonsgradient på grunn ionefluks) mikroelektroden potensialet svinger ved en amplitude som er proporsjonal med ionefluks / gradient. Forsterkeren forsterker microelectrode signalet og utgangssignalet er innspilt på maskinen. Den ionefluks kan da beregnes ved Ficks diffusjonslov ved hjelp av elektrodepotensialet svingning, ekskursjon til mikroelektroden, og andre parametere som for eksempel det spesifikke ion mobilitet. I denne artikkelen beskriver vi i detalj metodikken for å måle ekstracellulære ion flukser bruker ion-selektive selvreferanse microelectrode end presentere noen representative resultater.
Introduction
Alle dyreceller er omgitt av et lipidbilag membran som separerer cytoplasma fra omgivelsene utenfor. Cellen opprettholder et elektrisk membranpotensiale, negative innsiden, ved aktiv transport av ioner 1. Membranen er en potensiell energikilde som er lagret i cellen kan bruke til å drive ulike molekylære enheter i membranen 2. Nevroner og andre hissige celler har store membranpotensialer. Hurtig åpning av natriumkanaler kollapser membranpotensialet (depolarisering) og produserer virkningspotensialet som transporteres langs lengden av neuron 2. Bortsett fra disse raske elektriske forandringer, mange vev og organer generere og opprettholde betydelige langsiktige elektriske potensialer. For eksempel, hud og hornhinnen epitel generere og vedlikeholde trans-epitelceller potensialer og ekstracellulære elektrisk strøm ved retnings pumping av ioner (hovedsakelig natrium og klorid) 3.
telt "> Mens målinger av endogene ekstracellulære elektrisk strøm ved hjelp av den vibrerende sonde 4-6 og målinger av membran eller trans-epitel potensialer ved hjelp av microelectrode systemet 7-10 tillater måling av de elektriske parametre av cellemembraner og epiteliale cellelag, gir de ingen angivelse av de ion-artene som er involvert.Mikroelektroder med selektiv ionofor kan måle spesifikke ion-konsentrasjonen i oppløsningen. Ion-gradienter eller flussmiddel kunne måles med to eller flere elektroder i forskjellige posisjoner. Imidlertid vil den iboende spenningen drift av hver sonde være forskjellig, noe som fører til unøyaktige målinger eller til påvisning av en gradient som ikke var til stede. En enkelt elektrode som brukes i "selvreferer" -modus hvor den beveger seg med lav frekvens mellom to punkter løser dette problemet. Nå er ionefluks kan sees på bakgrunn av en forholdsvis langsom og stabilt signal drift (se figur 3B). Den ion-sensitive målesystemet bruker ion-selektive selvreferanser mikroelektroder å oppdage små ekstracellulære fluks av ioner nær vev eller enkeltceller. Systemet består av en forsterker som behandler signalet fra mikroelektrode, og en mikro-stepper motor og driver for å styre bevegelsen til mikroelektroden. Den ion-selektive mikroelektroden og referanseelektroden som lukker kretsen er koblet til forsterkeren via en heads pre-forsterker (figur 1A). Datamaskinprogrammet bestemmer parametrene til mikroelektroden bevegelse (frekvens, avstand) og registrerer også utgangen fra forsterkeren. Trinnmotoren styrer microelectrode bevegelsen via en tredimensjonal micropositioner. En lavfrekvent vibrasjons ioneselektiv microelectrode ble først utviklet i 1990 for å måle spesifikk kalsiumflukssignal 11. Samt kalsium, kommersielt tilgjengelige ionofor cocktailer er nå tilgjengelig for å gjøre microelectrodes følsom for natrium, klorid, kalium, hydrogen, magnesium, nitrat, ammonium, fluorid, litium eller kvikksølv.
I utgangspunktet, omdanner selvreferanse ioneselektiv microelectrode teknikk aktiviteten til et bestemt ion oppløst i en løsning i et elektrisk potensial, noe som kan måles ved hjelp av et voltmeter. Ionoforen cocktail er en ikke-blandbare væsker (organisk, lipofile) fase med ion-exchange egenskaper. Ionoforen selektivt komplekser (binder) spesifikke ioner reversibelt og overfører dem mellom den vandige oppløsning inneholdt i mikroelektrode (elektrolytt) og den vandige oppløsning hvori mikroelektroden er neddykket (figur 1D). Dette ion overføring fører til en elektrokjemisk likevekt og en variant av det elektriske potensial mellom mikroelektroden og referanseelektroden måles av voltmeteret. Spenningen er proporsjonal med logaritmen av den spesifikke ion aktivitet i henhold til Nernst equation tillater beregning av ione-konsentrasjonen (figur 2A og B).
I dag flere systemer tillater måling av ionefluks ved hjelp av et lignende konsept og prinsipp. For eksempel skanne Ion-selektive elektrode Technique (siet) 12,13 eller microelectrode Ion Flux Estimering (mife) teknikk utviklet av Newman og Shabala 14-16 er kommersielt tilgjengelig og mye brukt av forskersamfunnet for å kunne fastslå bestemt ion belegg skjer på cellemembranen og vev på tvers av en rekke dyr, planter og enkelt levende cellemodeller. Ion-selektive mikroelektroder er blitt brukt til å måle hydrogen, kalium og kalsium-fluks på tvers av planterøttene 17, klorid flussmiddel i rottehjernearteriene 18 og i pollen rør 19, hydrogen fluks i skatenetthinneceller 20, kalsium fluks i mus ben 21, en rekke Ion flukser i soppens hyfer 22 og i rpå hornhinnen 23, og til slutt kalsium flux under enkelt celle sårtilheling 12,24. Se også følgende vurdering for detaljert informasjon om ion-selektive selvreferanser mikroelektroder 25.
Den følgende artikkelen beskriver i detalj hvordan du kan forberede og utføre måling av endogene ekstracellulære ion flukser bruker ion-selektive selvreferanse microelectrode teknikk på celle-nivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ion-selektive selvreferanser microelectrode Forberedelse
- Utarbeidelse av ioneselektiv microelectrode
- Varme trekke tynnveggede kapillærer borsilikat uten filament (1,5 mm ytre diameter, 1,12 mm indre diameter) med en mikroelektrode avtrekker.
Merk: Dette gir tips 3-4 mikrometer i diameter. Mindre spissene har høyere motstand som gjør mikroelektroder mer utsatt for elektronisk støy, og er også forbundet med en langsommere respons til en endring i ionekonsentrasjon. Nyttig informasjon finnes i artikkel publisert av Smith et al. 26. - Silanize elektrodene for å gjengi den indre overflaten hydrofob for å hjelpe retensjon av det lipofile ionofor cocktail. Plasser mikroelektroder i et metallstativ og varme O / N i en ovn ved> 100 ° C for å tørke dem. Stativet er en metallplate med 2 mm diameter hull boret en del av veien gjennom. Plasser elektrodene i hullene spissen oppover med en 250 ml glass begeret over dem.
- I morgen, slå av ovnen og mens iført isolerte hansker, forsiktig fjerne metallstativ med elektroder og beger på plass. Lukk stekeovnsdøren for å beholde varmen.
- Bruk gummi eller nitrilhansker, labfrakk og vernebriller. Med en plast Pasteur pipette, plassere en dråpe av oppløsningen silanisering I på undersiden av hver elektrode (holde begeret på plass, bruke helleleppe for pipette tilgang). Den silanisering Oppløsningen fordampes ved varmeplaten og silanizes innsiden av elektrodene. Bruk en kjemisk avtrekks avtrekk for dette stadiet. Sett stativet / beger / elektroder tilbake i den varme ovnen i noen timer slik at eventuelle gjenværende silanisering løsning å fordampe.
Merk: Av sikkerhetsgrunner må du ikke slå ovnen på igjen. Plasser en etikett på ovnen som indikerer det må ikke slås på, da det kan inneholde skadelige og brannfarlig damp. - Etter avkjøling lagre mikroelektroder i en microelectrode lagring jar insiDE et glass eksikkator med 400 g av tørkemiddel. Mikroelektroder kan lagres således i mange uker.
Merk: En alternativ silanisering metode er beskrevet i Smith et al 26. - Back-fyll mikroelektroden med 50 til 100 mikroliter (en lengde på ca. 1 cm) av en oppløsning inneholdende 100 mM av det ion som skal måles (se tabell 1 og figur 1 B). Bruk en engangs plast Pasteur pipette varmen trekkes i en Bunsen-brenner til en fin filament. Skyll pipetten i dH 2 O etterpå for å hindre blokkering.
Merk: Alternativt kan justere ion konsentrasjonen av fyllings løsning i samsvar med konsentrasjonen av ioner i den eksterne oppløsning 27. - Observere microelectrode under et dissekere mikroskop for å sikre fravær av luftbobler.
- Hvis luftbobler springen microelectrode lett med en finger spiker mens du holder elektroden vertikalt (spissen ned) og / eller skyve boblens ut spissen ved å bruke mottrykk ved hjelp av en sprøyte modifisert med en silikon tube bytter nål.
- Tip-fyll mikroelektroden med 15 til 20 NL (en lengde på 30 til 50 mikrometer) av ione-spesifikke ionophore cocktail (se tabell 1). Plasser en liten dråpe ionofor cocktail på kortsiden av et objektglass. Observer microelectrode spissen under en dissekere mikroskop og flytte den mot objektglass til microelectrode spissen berører ionoforen cocktail for bare et halvt sekund. Tegn ionoforen cocktail inn i microelectrode av kapillær trykk.
Merk: unngå en lang kolonne av ionofor cocktail, da dette øker sondens elektrisk motstand som kan gjøre det mottagelig for elektronisk interferens (støy), og også senker responstid. - Monter microelectrode i en rett microelectrode holder med en gull 1 mm hannkontakt og AgCl (Ag +) ledningen (Figur 1B). </ Li>
- Fest microelectrode holderen til hodet trinnet er montert på en tre-dimensjonal datastyrt elektronisk micropositioner (figur 1A).
- Sett microelectrode spissen i måleløsning egnet for den prøve som skal måles (fysiologisk saltoppløsning, kulturmedium, etc.) for å tillate mikroelektroden for å stabilisere seg i en time eller to, eller til og med over natten.
- Varme trekke tynnveggede kapillærer borsilikat uten filament (1,5 mm ytre diameter, 1,12 mm indre diameter) med en mikroelektrode avtrekker.
- Fremstilling av referanseelektrode
- Referanseelektroder (figur 1C) er de samme som ovenfor kapillærene. Skjær kapillær med en diamant blyant inn i 5 cm lengder og brann-polert i hver ende for 1-2 sek i en Bunsen flamme.
- Fylle disse elektroder med ~ 200 ul av en 3 M løsning av NaCl, CH 3 CO 2 K (kalium-acetat), eller KCl med 2% agarose. Velge den løsningen avhengig av ion som skal måles (referanseelektroden bør ikke inneholde ion blir målt; se tabell 1). Blandagarose og oppløsningen og varme til nesten koking i en mikrobølgeovn. Rør for å oppløse agarose (oppløsningen går klar).
- Fest referanse elektroden til en plastisk Pasteur pipette og trekker den varme oppløsning inn i kapillarrøret.
- Slippe elektroden i kald 3 M NaCl, CH 3 CO 2 K eller KCl-løsning og oppbevar i denne 3 M løsning i forseglede rør før bruk. Kast alle referanseelektroder med luftbobler.
- Monter referanseelektrode i en rett microelectrode holderen (pre-fylt med 3 M løsning) med en AgCl (Ag +) pellet inne og en gull 2 mm hannkontakt (figur 1C) og feste elektroden og holder på en manuell mikro-positioner montert på et magnetisk stativ.
2. Ion-selektive selvreferanser microelectrode Calibration
- Klar kalibrering oppløsninger inneholdende ion av interesse som i referanseløsningen; se tabell 1 (for eksempel dyrkningsmedier, fysiologisk saltoppløsning). Det vil si, må en kalibreringsløsning inneholder en lavere konsentrasjon av ioner enn i måleoppløsning, og en høyere.
- For eksempel bruke saltvann som inneholder en mM K +. Til braketten denne konsentrasjonen, oppløses KCl pulver i deionisert vann til en konsentrasjon på 10, 1 og 0,1 mM i serielle fortynninger. Bruk disse kalibreringsløsninger. Alternativt kan du bruke minst to av disse løsningene.
- Dypp ioneselektiv mikroelektroden og referanseelektroden i hvert kalibreringsløsning og la den spenningsverdi stabilisere seg i 1 til 3 minutter før opptak av tilsvarende spenning ved hjelp av dedikert programvare (se tabell 1).
- Ettersom programvaren lagrer data (forsterker utgang) som en txt-fil, kopiere data inn i et regneark. Plott microelectrode utgang (mV) mot logaritmen avden molare ion-konsentrasjon (figur 2A).
- Påfør en lineær regresjon og beregne Nernst skråning, fange opp og R2 verdi. Godta microelectrode hvis Nernst skråningen er 58 ± 11 mV / tiåret for enverdige ioner og 29 ± 11 mV / tiåret for toverdige ioner (for kationer, er Nernst skråningen positive, for anioner er det negative). I tillegg bør gode mikroelektroder ha en sterkt lineær korrelasjon (R 2> 0.9; figur 2B).
Merk: mV utgang på forsterkeren brukt her gir mV lese med en tidoblet gevinst. Verdier må deles med en faktor på ti. - Bruke lineær regresjon formelen for å omdanne rå mV utgangen til mikroelektroden inn i selve ionekonsentrasjon (figur 2B).
3. Validering av Ion-selektive microelectrode Technique
- Forbereder en kunstig kilde
- Kunstige kildekapillærer er de samme kapillærer somovenfor. Heat trekke kapillær bruker en microelectrode avtrekker som i trinn 1.1.1.
- Tilbakefylling disse kapillærer med 200 ul av en 1 M løsning av NaCl, KCl, CaCl 2 2 H 2 O eller pH 4 buffer. Velge den kunstige kildeoppløsningen avhengig av ion som skal måles (se tabell 1).
Merk: Du kan også trekke elektroder med større tips diameter (~ 20 mikrometer) og tip-fyll med de samme løsningene, men inneholder 0,5-1% agarose (agarose vil hindre enhver bulk flyt av løsning). - Monter kunstig kilde kapillar på en mikromanipulator og dyppe det i løsningen anvendt til å måle fluksen av ionet i prøvene. La den kunstige kilden i løsningen i 30 min til 1 time for å tillate stabilisering av gradienten.
- Validering av ioneselektiv microelectrode
- Dypp ioneselektiv microelectrode omtrent en centimeter fra den kunstige kilden kapillær i løsningen anvendt til målere fluksen av ion på prøvene og lukke kretsen med referanse-elektroden som før. La spenningsverdien stabilisere seg i 1 til 3 minutter før opptak av tilsvarende spenning ved hjelp av dedikert programvare for 1 til 2 min. Denne verdien tilsvarer buffer verdi (i litteraturen også omtalt som referanse, bakgrunn eller blank verdi).
- Flytt ioneselektiv microelectrode til omtrent 5 um fra den kunstige kilden og la den spenningsverdi stabilisere seg i 1 til 3 minutter før opptak av tilsvarende spenning ved hjelp av programvaren for 1 til 2 min.
- Gjenta fremgangsmåten ovenfor ved å plassere den ioneselektive microelectrode ved 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 og 1280 um bort fra den kunstige kilden kapillær.
- Hente ut data som en txt-fil og kopiere verdiene inn i et regneark.
- Beregn ion konsentrasjon som svarer til MV-verdier på samme måte som for kalibreringsverdier. Plott verdi.
Neite: Hvis en ionefluks er til stede, detekterer microelectrode en forskjell i ionekonsentrasjon mellom de to posisjoner (figur 3b). Dersom den kunstige kilden inneholder flere ioner av arten målte enn oppløsningen bør konsentrasjonen være høyere nær kilden enn langt borte, validere evne til ioneselektiv microelectrode å detektere riktig retning av en ionefluks (i dette tilfellet dyseutstrømningen, for en kunstig vask, med lavere spesifikk ionekonsentrasjon enn målemediet, bør det være tilstrømningen).- Beregn ionefluks ved hjelp av Ficks diffusjonslov: J = c μ (dc / dx) der c er den ion-konsentrasjonen i oppløsningen (mol cm -3), μ er mobiliteten ion (mol cm N -1 sek -1) og dc er konsentrasjonen forskjell over avstand dx (cm) (Figur 2C). Ionefluks data er vanligvis presenteres i pmol cm -2 s-1 Eller nmol cm -2 sek -1.
Merknad:.. En alternativ metode for ionefluks beregning beskrevet av Smith et al 26 kan benyttes. Hovedforskjellene inkluderer bruk av diffusjonskoeffisienten i stedet for ion mobilitet og subtraksjon av bakgrunnen ionefluks (også spenning drift eller korreksjonsfaktor) beregnes ut fra måling av ionefluks i saltløsning uten prøve. - Plott gjennomsnittet av de ion fluksene av hvert trinn mot avstanden fra kilden (figur 2D). Beveger seg bort fra kilden, observere en eksponentiell reduksjon av fluksen verdien validere evne til ioneselektiv microelectrode å sanse annen størrelsesorden av ion-flukser.
- Gjør den kunstige validering kilde gang for hvert enkelt ion ment å bli registrert for å validere sine riktig retning og størrelse målinger med et stort signal-til-noise ratio.
Note: ionefluks måling av buffer uten prøvene indikerer bakgrunnsnivået eller støy. Vanligvis viser buffer måling ingen klar svingninger av ion konsentrasjonen fører til svært liten forandring som viser variable retninger.
- Beregn ionefluks ved hjelp av Ficks diffusjonslov: J = c μ (dc / dx) der c er den ion-konsentrasjonen i oppløsningen (mol cm -3), μ er mobiliteten ion (mol cm N -1 sek -1) og dc er konsentrasjonen forskjell over avstand dx (cm) (Figur 2C). Ionefluks data er vanligvis presenteres i pmol cm -2 s-1 Eller nmol cm -2 sek -1.
4. Fremstilling av målekammeret
Merk: Før forsøkene vurdere prøven som skal måles, og hvor prøven skal monteres og immobilisert til mikroelektroden målinger.
- For Xenopus laevis oocytten målinger kuttet en 1 cm kvadrat av et 800 mikrometer nylon mesh (Nitex mesh) og lim den inn i en petriskål av plast (figur 1E).
5. Ion Flux Measurement
- Mål ion konsentrasjonen til stede i bufferen brukes til å utføre målinger på prøven på samme måte som kalibreringsløsningen. X. laevis ubefruktede egg krever Mark modifiserte Ringer (MMR). Dissolve NaCl, KCl, CaCl, MgCl og HEPES til deionisert vann for å oppnå en sluttkonsentrasjon av (mM): 100 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl, 1 MgCl og 5 HEPES. Juster pH-verdien i bufferen til 7,5 med NaOH.
- Plasser prøven i målekammeret og bringe den ion-selektive microelectrode nær prøven (ca. 10 um bort) ved hjelp av micropositioner å definere nær posisjonen til mikroelektroden (figur 3A).
- Start lav frekvens (0,3 Hz) utflukt (100 pm) av microelectrode mellom lukket stilling og en stilling borte fra prøven (fjerntliggende) ved hjelp av dedikert programvare. Sørge for at bevegelsen av mikroelektroden er vinkelrett på overflaten av prøven.
Merk: ekskursjon for microelectrode kan settes på programvaren. Stort ekskursjon øker gradient les slik at en lettere påvisning av små flukser under målingen, mens forlenger sampleintervallet og reduserer tidsmessig oppløsning. Se- Start opptaket ved hjelp av programvaren. Den microelectrode pauser i hver posisjon og den elektriske potensialet i mV registreres på datamaskinen. Utføre målinger i minst 2 min, slik at signalet stabilisering. For korte time-lapse eksperimenter, plate potensielle variasjoner på stillingen av interesse for hele tiden kurset.
- Hente ut data som en txt-fil og kopiere verdiene inn i et regneark.
- Beregn ion konsentrasjon som svarer til MV-verdier på samme måte som for kalibreringsverdier. Plott verdi.
Merk: Hvis en ionefluks er til stede, detekterer microelectrode en forskjell i ionekonsentrasjon mellom de to posisjoner (figur 3b).- Beregn ionefluks hjelp Fick lov av diffusjon som før (trinn 3.3.1).
- Gjenta buffer målingen før måle en ny prøve og gjenta prosedyren av forandring måling og beregning for hver nyprøve.
6. Statistisk analyse og datapresentasjon
- Test de uavhengige effektene av stilling og / eller av tiden på ion flukser under kontroll tilstand ved hjelp av en ANCOVA modell med blandede effekter 28.
Merk: Analyse av kovarians (ANCOVA) er en generell lineær modell som blander vanlig ANOVA og regresjon ved å tillate både kategoriske og kontinuerlige tiltak som skal brukes som uavhengige variabler. I tillegg, i nærvær av korrelerte feil forårsaket av gjentatte målinger pr individuelle og eventuelle nestede effekter, blandes effektmodeller som brukes til å modellere nøyaktig anslag av både faste og tilfeldige effekter. - Beregn parvise sammenligninger ved hjelp Student t-test mellom gruppenivå med Bonferroni korreksjon for multippel testing 28.
- Generere boksplott for å oppsummere ion flux målinger i henhold til posisjon og tid. Inkluder p-verdiene fra den parvise Student t beskrevetovenfor (figur 3D), og indikerer betydning nivåer av p-verdier som følger: *: p <0,05; **: P <0,01; ***: P <0.001 29
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidligere vist at kalsium tilstrømningen vises etter enkelt celle såret 24. Vi ba derfor om andre ion fluks oppstå ved enkelt celle såret. Vi brukte X. laevis eggcelle, en veletablert modell for enkelt celle sårtilheling 30-34 og elektrofysiologisk registrering 24,35-39. Interessant, kalium ioner er mer konsentrert inne X. laevis oocytter (ca. 110 mm) 40 enn i det ekstracellulære oppløsning som anvendes (i MMR 1x: 1 mM), og antyder en utstrømning av kalium på såret. For å bekrefte denne hypotesen, målte vi kalium flux i løpet av X. laevis eggcelle cellemembranen healing bruker ion-selektive selvreferanser microelectrode.
Å såre eggcelle, først trekke en kapillær elektrode med en stor spiss størrelse (~ 50 mikrometer). Fest elektroden til en rett elektrodeholder og montere på en manuell mikro positioner. Sår på oocyte ved å berøre membranen med elektrodespissen 24. Snart etter at såret vi oppdaget en stor utstrømming av kalium (opp til 250 nmol cm -2 sek -1; Figur 3B - D). Som membranen såret leget, dette flux redusert, tilbake til unwounded flux verdier sett i intakt membran (~ 5 nmol cm -2 sek -1) når såret leget (inntil 16 min etter såret; Figur 3B - D). ANCOVA viste en signifikant effekt av tid etter såre på kalium fluks målinger (p <0,001). Post hoc-analyser viste en signifikant økning kalium-utstrømning i 1-2 min (p <0,001) og 5-6 min (p <0,05), men ikke i 15-16 minutter etter at såret når sammenlignet med intakt cellemembran tilstand (figur 3D). Vi har konkludert med at ved enkelt celle såret, vises en utstrømning av kalium på nivået av såret som reduserer DUring løpet av healing.
| Ion | Ionofor cocktail | Elektrolyttløsning (100 mM) | Referanse-oppløsning (3 M) | Kunstig kilde-løsning (1 M) |
| Ca 2+ | Kalsiumionofor Jeg Cocktail A (cat # 21048) | CaCl 2 2 H 2 O | KCl | CaCl 2 2 H 2 O |
| Na + | Sodium ionofor II Cocktail A (cat # 71178) | NaCl | KCl | NaCl |
| Cl - | Klorid ionofor Jeg Cocktail A (cat # 24902) | NaCl | CH2 CO 2 K (kaliumacetat) | NaCl |
| K + | Kalium ionofor Jeg Cocktail A (cat # 60031) KCl | NaCl | KCl | |
| H + | Hydrogen ionofor Jeg Cocktail A (cat # 95291) | pH 7,0 | KCl | pH 4,0 |
Tabell 1:. Eksempler på vanlig brukte ionofor cocktails også vist er hensiktsmessige løsninger for å plassere i mikroelektroder, for den kunstige kilden og muligheten til å kalibrere. Katalognummer er fra Sigma-Aldrich.
Fig. 1: ioneselektiv mikroelektroder (A) Skjematisk representasjon av ion-selektive selvreferanse microelectrode system. (B) Ion-selektive microelectrode. (C) referanseelektrode. (D) Ionebytting mellom den eksterne løsningen og microelhjelp av elektrode via ionoforen. (E) Scheme av målekammeret anvendes til X. laevis eggcelle.
Figur 2: Ion-selektive microelectrodes kalibrering, kunstig kilde- og flux beregnings (A) Kalibrering kurve.. (B) Ligning av kalibreringskurven og beregning av ione-konsentrasjonen. (C) Beregning av ionefluks. (D) ionefluks målt på bestemte avstander fra kunstig kilde (1 M KCl).
Figur 3: Utvikling av kalium fluks ved X. laevis eggcelle såret under healing. (A) Foto og illustrasjon av ekskursjonav det ion-selektive microelectrode måling ionkonsentrasjon på X. laevis eggcelle såret; den stiplede linjen mellom '' a '' og '' v '' representerer dyre vegetal aksen. (B) illustrasjon av variasjonen av kalium-ion-konsentrasjon på X. laevis eggcelle såret under healing. (C) spredning (xy) plott som viser gjennomsnittet og standardfeilen av kalium fluks måling på nivået av såret på forskjellige tidspunkt i løpet av X. laevis eggcelle sårheling. (D) Boxplot viser kalium fluks måling på nivået av såret på forskjellige tidspunkt i løpet av X. laevis eggcelle sårheling (n = 16; p-verdiene angitt som følger: *: p <0,05, ***: p <0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiske trinn for vellykket måling av ekstracellulære ion flukser in vivo er: reduksjon av støy, er den riktige fremstillingen av ion-selektive mikroelektroder og referanseelektrode, og posisjoneringen av prøven og begge elektroder.
For å minimalisere støy, bør registreringssystemet være i en jordet (jordet) Faraday-bur, fortrinnsvis med et metall-toppet (vibrasjonsisolasjon) tabell som også er jordet. I tillegg bør mikroskopet understellet også være jordet. Kilder til elektrisk støy omfatter lyskilden. En fiberoptisk "fan-mindre" lyskilde forårsaker minimal elektrisk støy. Til slutt holder sølvtråd og pellet i microelectrode holdere chlorided også reduserer støy (dip i natrium-hypokloritt blekemiddel og skyll i dH 2 O) sikret tilstedeværelse av luftbobler i det ion-selektive microelectrode eller i referanseelektrode vil resultere i måle svikt somkonduktiviteten til mikroelektroden vil være null eller kompromittert. Derfor er det viktig å kontrollere elektrodene under lupen før de monteres på holderne. Se protokollen for detaljert fremgangsmåte for å fjerne luftbobler. Den korrekte posisjonering av både prøven og mikroelektroder er nødvendig for å sikre pålitelige og reproduserbare resultater. Målingen av ionefluks er avhengig av ekskursjon av mikroelektroden og dens stilling i forhold til prøven. Det er viktig å identifisere nøyaktig det område av interesse som skal bli målt i prøven og plasser microelectrode å ha en vinkelbevegelse fra prøven. Enhver utflukt av mikroelektroder på en måte som ikke er vinkelrett på prøven vil resultere i endrede ion belegg målinger og økt variasjon blant prøver.
Ionofor cocktails dedikert til å måle spesifikke ioner, for eksempel kalium, kan også avføle tilstedeværelse av andre ioner, så som natrium.I det tilfelle at måle oppløsningen inneholder en høy mengde av et konkurrerende ion for ionoforen cocktail, er det viktig å bestemme selektiviteten av ionoforen cocktail ved hjelp av kunstig lys eksperimentet. Her løsningen brukes til kultur X. laevis oocytter (MMR) inneholder en høy konsentrasjon av natrium. Derfor er det viktig å vurdere om kalium ionoforen cocktail anvendes også registrerer natrium. Ved hjelp av kalium-ionoforen cocktail fylte mikroelektrode, kan vi forsøke å måle et natrium fluks ved hjelp av en kunstig kilde som inneholder høy konsentrasjon natrium (1 M NaCl; se tabell 1) og samtidig i samme måleløsning. Den kjemiske gradient favoriserer utstrømningen av natrium, men ideelt sett ikke noe natrium flussmiddel skal bli detektert av kalium-spesifikke ionofor cocktail. Hvis en signifikant forandring måles, bør den eksperimentelle tilstand optimaliseres. For eksempel kan konsentrasjonen av konkurrerende ion senkes ned til et punkt i microelectrode ikke oppfatte det lenger, selv om dette kan påvirke natrium fluks over plasmamembranen som fører til eventuelle forstyrrelser under kalium flux målinger. Ideelt sett, kan en korreksjonsfaktor beregnet fra den kunstige kilden forsøket anvendes på dataene, eller en annen ionoforen cocktail kan testes. Ionefluks målinger ved hjelp av de ion-selektive selvreferanse microelectrode tillate måling av ione flukser som oppstår på celler og vev i vandig oppløsning. Målinger av ion flukser i celler eller vev som normalt er i kontakt med en luftmiljø krever tilstedeværelse av en løsning som ikke er naturlig til stede i miljøet, og som kan endre ionefluks og utveksling som forekommer under normale forhold. Spesiell oppmerksomhet må gjøres for å definere innholdet av en slik løsning og å minimere avviket fra den opprinnelige, fysiologisk miljø. Spekteret av ioner som kan måles ved de ion-selektive selvreferanse microelectrode teknikk avhenger av tilgjengelighet og eksistensen av bestemte ionofor cocktails selektive til ion av interesse.
Ionefluks målinger utført med ione-selektive selvreferansemikroelektrode er gjort i oppløsning, vanligvis nær overflaten av celler eller vev, slik at den ikke-invasiv måling av ekstracellulære ion flukser. Denne metoden tillater ikke måling av ione flukser inne vev, mellom celle og intercellulære mellomrom. Den ion-selektive selvreferanse microelectrode er ikke den eneste metode som tillater måling av ione-flukser in vivo. En alternativ ny fremgangsmåte anvender fluorescerende bioelectricity pressen 41 som muliggjør måling av ion flukser som ikke er mulig ved hjelp av mikroelektroder. Disse fargestoffer tillater målinger av ioner flukser inne vev og celler, og kan oppnå subcellulær lokalisering. Denne teknikken kan skaffe seg romlig informasjon for ionefluks inne vev og celler, men ikke ion exskifte mellom vevet og det ekstracellulære rom. Videre fluorescerende bioelectricity journalister vanligvis genererer semi-kvantitative data. Bruken av mikroelektrode-basert teknologi å måle ion flukser fremdeles er gyldig, og det er nødvendig og gir ytterligere informasjon til bruken av fluorescerende bioelectricity reportere, noe som gjør dem komplementære fremfor konkurrerende teknikker. I tillegg inkluderer interessante siste utviklingen Amperometriske selvreferanser detektorer av oksygen, nitrogenoksid og nevrotransmittere dopamin og glutamat 42,43. Amperometrisk sensing er basert på en kjemisk reaksjon ved sensoren spissen. Ny fiberoptiske mikroelektroder ("optrodes") er blitt utviklet for å måle ikke-invasivt metabolsk oksygenfluks 34,35 og pH 44 med høy selektivitet og følsomhet 45,46. Det er nå også en enzymbaserte nanopartikkel-belagte sonde sensitive til glukose 47.
Vi har sett at the ion-selektive selvreferanse microelectrode gjør målinger av ekstracellulære ion flukser in vivo. Ioner er ikke bare utveksles mellom cellene / vevene og ekstracellulære plass, men også mellom celler og vev i levende organismer. Det er viktig å kombinere denne teknikken med andre, slik som fluorescerende bioelectricity reportere for å verdsette den romlige oppløsningen av de ion-flukser inne vev i tillegg til de faktiske målinger av ion fluksene i nærheten av overflaten. I tillegg ion flukser er en viktig del av bioelektriske tilstand som definerer celler og vev sammen med cellemembranpotensialet, trans-epitel potensialet eller ekstracellulære elektriske strømmer. Det er viktig, i tillegg til måling av ion flukser, for å måle, i kombinasjon, cellemembran og trans-epitel potensial og ekstracellulære elektriske strømmer 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IonAmp | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Headstage pre-amplifier | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| MicroStep Driver | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Manual micropositioner | World Precision Instruments | Model KITE-R | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | Model M10 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Vibration isolation table | Newport Inc. | Model VW-3036-OPT-023040 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces | Newport Inc. | Model 360-90 | Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table |
| Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | none |
| Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | none |
| Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament | World Precision Instruments | TW150-4 | none |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | none |
| Metal rack | Made in-house | none | Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel |
| Oven | QL | Model 10 Lab Oven | none |
| Silanization solution I | Sigma-Aldrich | 85126 | Hazardous, handle as recommended by provider |
| Glass Petri dish; Pyrex | Fisher Scientific | 316060 | none |
| Electrode/micropipette storage jar | World Precision Instruments | E215 | none |
| Glass dessicator | Fisher Scientific | 08-595E | Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight. |
| Plastic Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11597722 | none |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | S97329 | none |
| Microscope slide | Sigma-Aldrich | S8902 | none |
| Straight microelectrode holder | Warner Instruments | QSW-A15P | with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire |
| Straight microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH3S | with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector |
| 6 cm Petri dish | VWR | 60872-306 | none |
| Nitex mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX750 | none |
| Glue; Loctite epoxy | VWR | 500043-451 | Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing |
| Deionized water | Sigma-Aldrich | 99053 | none |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | none |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | none |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | none |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | none |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | none |
| Sodium Hydroxyde | Sigma-Aldrich | S8045 | none |
| Potassium Acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | none |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | none |
References
- Weber, W. M., Liebold, K. M., Clauss, W. Amiloride-sensitive Na+ conductance in native Xenopus oocytes. Biochimica et biophysica acta. 1239, 201-206 (1995).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. Journal of cell science. 122, 4267-4276 (2009).
- Zhao, M. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Seminars in cell & developmental biology. 20, 674-682 (2009).
- Jaffe, L. F., Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. The Journal of cell biology. 63, 614-628 (1974).
- Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nature protocols. 2, 661-669 (2007).
- Reid, B., Zhao, M. Measurement of bioelectric current with a vibrating probe. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Moore, J. W. The patch clamp: single-channel recording. Science. 224, 50-51 (1984).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of visualized experiments. , (2008).
- McCaig, C. D., Robinson, K. R. The ontogeny of the transepidermal potential difference in frog embryos. Developmental biology. 90, 335-339 (1982).
- Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F. Detection of extracellular calcium gradients with a calcium-specific vibrating electrode. The Journal of cell biology. 110, 1565-1573 (1990).
- The use of the vibrating probe technique to study steady extracellular currents during pollen germination and tube growth. Fertilisation in Higher Plants: molecular and cytological aspects. Cai, G., Cresti, M., Moscatelli, A. , Springer-Verlag. 235-252 (1999).
- Kunkel, J. G., Xu, Y., Shipley, A. M., Feijó, J. A. The use of non-invasive ion-selective microelectrode techniques for the study of plant development. Plant Electrophysiology – Theory and Methods. (ed Volkov AG. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 109-137 (2006).
- Ordonez, N. M., Shabala, L., Gehring, C., Shabala, S. Noninvasive microelectrode ion flux estimation technique (MIFE) for the study of the regulation of root membrane transport by cyclic nucleotides. Methods in molecular biology. 1016, 95-106 (2013).
- Tegg, R. S., Melian, L., Wilson, C. R., Shabala, S. Plant cell growth and ion flux responses to the streptomycete phytotoxin thaxtomin A: calcium and hydrogen flux patterns revealed by the non-invasive MIFE technique. Plant & cell physiology. 46, 638-648 (2005).
- Newman, I. A. Ion transport in roots: measurement of fluxes using ion-selective microelectrodes to characterize transporter function. Plant, cell & environment. 24, 1-14 (2001).
- Kochian, L. V., Shaff, J. E., Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F., Lucas, W. J. Use of an extracellular, ion-selective, vibrating microelectrode system for the quantification of K(+), H (+), and Ca (2+) fluxes in maize roots and maize suspension cells. Planta. 188, 601-610 (1992).
- Doughty, J. M., Langton, P. D. Measurement of chloride flux associated with the myogenic response in rat cerebral arteries. The Journal of physiology. 534, 753-761 (2001).
- Messerli, M. A., Smith, P. J., Lewis, R. C., Robinson, K. R. Chloride fluxes in lily pollen tubes: a critical reevaluation. The Plant journal : for cell and molecular biology. 40, 799-812 (2004).
- Molina, A. J., et al. Neurotransmitter modulation of extracellular H+ fluxes from isolated retinal horizontal cells of the skate. The Journal of physiology. 560, 639-657 (2004).
- Marenzana, M., Shipley, A. M., Squitiero, P., Kunkel, J. G., Rubinacci, A. Bone as an ion exchange organ: evidence for instantaneous cell-dependent calcium efflux from bone not due to resorption. Bone. 37, 545-554 (2005).
- Lew, R. R. Ionic currents and ion fluxes in Neurospora crassa hyphae. Journal of experimental botany. 58, 3475-3481 (2007).
- Vieira, A. C., et al. Ionic components of electric current at rat corneal wounds. PloS one. 6, e17411 (2011).
- Luxardi, G., Reid, B., Maillard, P., Zhao, M. Single cell wound generates electric current circuit and cell membrane potential variations that requires calcium influx. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 6, 662-672 (2014).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. H. , (2007).
- Smith, P. J., Hammar, K., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Trimarchi, J. R. Self-referencing, non-invasive, ion selective electrode for single cell detection of trans-plasma membrane calcium flux. Microscopy research and technique. 46, 398-417 (1999).
- Messerli, M. A., Smith, P. J. Construction theory, and practical considerations for using self-referencing of Ca(2+)-selective microelectrodes for monitoring extracellular Ca(2+) gradients. Methods in cell biology. 99, 91-111 (2010).
- Chambers, J., Hastie, T., Pregibon, D. Ch. 48. Compstat. Momirović, K., Mildner, V. , Physica-Verlag HD. 317-321 (1990).
- Chambers, J. M., Cleveland, W. S., Kleiner, B., Tukey, P. A. Graphical methods for data analysis. , Wadsworth & Brooks/Cole. (1983).
- Burkel, B. M., Benink, H. A., Vaughan, E. M., von Dassow, G., Bement, W. M. A Rho GTPase signal treadmill backs a contractile array. Developmental cell. 23, 384-396 (2012).
- Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current biology : CB. 9, 579-587 (1999).
- Mandato, C. A., Bement, W. M. Contraction and polymerization cooperate to assemble and close actomyosin rings around Xenopus oocyte wounds. The Journal of cell biology. 154, 785-797 (2001).
- Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. The Journal of cell biology. 168, 429-439 (2005).
- Simon, C. M., Vaughan, E. M., Bement, W. M., Edelstein-Keshet, L. Pattern formation of Rho GTPases in single cell wound healing. Molecular biology of the cell. 24, 421-432 (2013).
- Petersen, C. C., Dupont, G. The initiation of a calcium signal in Xenopus oocytes. Cell calcium. 16, 391-403 (1994).
- Horisberger, J. D., Lemas, V., Kraehenbuhl, J. P., Rossier, B. C. Structure-function relationship of Na,K-ATPase. Annual review of physiology. 53, 565-584 (1991).
- Miledi, R. A calcium-dependent transient outward current in Xenopus laevis oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. London, England, , 491-497 (1982).
- Miledi, R., Parker, I. Chloride current induced by injection of calcium into Xenopus oocytes. The Journal of physiology. 357, 173-183 (1984).
- Parker, I., Miledi, R. A calcium-independent chloride current activated by hyperpolarization in Xenopus oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. 233, 191-199 (1988).
- Costa, P. F., Emilio, M. G., Fernandes, P. L., Ferreira, H. G., Ferreira, K. G. Determination of ionic permeability coefficients of the plasma membrane of Xenopus laevis oocytes under voltage clamp. The Journal of physiology. 413, 199-211 (1989).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 385-397 (2012).
- Porterfield, D. M. Measuring metabolism and biophysical flux in the tissue, cellular and sub-cellular domains: recent developments in self-referencing amperometry for physiological sensing. Biosensors. 22, 1186-1196 (2007).
- McLamore, E. S., et al. A self-referencing glutamate biosensor for measuring real time neuronal glutamate flux. Journal of neuroscience methods. 189, 14-22 (2010).
- Yin, M., et al. Highly sensitive and fast responsive fiber-optic modal interferometric pH sensor based on polyelectrolyte complex and polyelectrolyte self-assembled nanocoating. Analytical and bioanalytical chemistry. 399, 3623-3631 (2011).
- Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrode technology for non-invasive real-time measurement of biophysical flux and physiological sensing. The Analyst. 134, 2224-2232 (2009).
- McLamore, E. S., Jaroch, D., Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrodes for measuring spatially resolved, real-time metabolic oxygen flux in plant systems. Planta. 232, 1087-1099 (2010).
- McLamore, E. S., et al. A self referencing platinum nanoparticle decorated enzyme-based microbiosensor for real time measurement of physiological glucose transport. Biosensors & bioelectronics. 26, 2237-2245 (2011).
