Abstract
Клетки животных, растений и отдельных клеток заключены в барьере называемой клеточной мембраны, которая отделяет цитоплазму извне. Слои клеток, таких как эпителий и формируют барьер, который отделяет внутреннюю снаружи или различных отсеках многоклеточных организмов. Ключевой особенностью этих барьеров дифференциальное распределение ионов через клеточные мембраны или слоев клеток. Два свойства позволяют этого распределения: 1) мембраны и эпителия отображения избирательную проницаемость для ионов конкретных; 2) ионы транспортируются через насосы через клеточные мембраны и клеточных слоев. Эти свойства играют решающую роль в поддержании тканей физиологии и выступать в качестве реплики сигнализации после повреждения, во время ремонта или при патологическом состоянии. Ионоселективный автореферентное микроэлектрода позволяет измерять конкретных потоков ионов, таких как кальций, калий или натрий в отдельных уровнях клеток и тканей. Микроэлектрод содержит ионофор коктейль, который являетсяселективно проницаемой для конкретного иона. Внутреннее решение наполнения содержит набор концентрацию иона интереса. Электрический потенциал микроэлектрода определяется внешним концентрации иона. Как концентрация ионов изменяется, потенциал микроэлектрода изменяется в зависимости от логарифма активности ионов. При перемещении вперед и назад, рядом с источником или стоком иона (т.е. в градиента концентрации из-за потока ионов) микроэлектрод потенциал колеблется с амплитудой, пропорциональной потока ионов / градиента. Усилитель усиливает сигнал микроэлектрода, а выход записывается на компьютере. Поток ионов может быть рассчитана по закону диффузии Фика с использованием электродного потенциала колебание, экскурсии из микроэлектрода, а также других параметров, таких как конкретное подвижности ионов. В этой статье мы подробно описать методологию для измерения потоков ионов внеклеточного помощью ионно-селективный автореферентных микроэлектродного апD Приведем некоторые репрезентативные результаты.
Introduction
Все животные клетки окружены липидный бислой мембраны, которая отделяет цитоплазму от внешней среды. Клетка сохраняет электрический мембранный потенциал, негативно внутри, активным транспортом ионов 1. Мембранный потенциал источник скрытой энергии, которое клетка может использовать для работы различные молекулярные устройства в мембране 2. Нейроны и другие возбудимые клетки имеют большие мембранных потенциалов. Быстрое открытие натриевых каналов падает мембранный потенциал (деполяризации) и производит потенциал действия, который транспортируется по всей длине нейрона 2. Помимо этих быстрых электрических изменений, многие ткани и органы генерировать и поддерживать значительные долгосрочные электрических потенциалов. Например, кожа и эпителии роговицы генерировать и поддерживать транс-эпителиальные потенциалы и внеклеточные электрические токи, направленным накачки ионов (в основном натрия и хлорида) 3.
палатка "> В то время как измерения эндогенного внеклеточного электрического тока с помощью вибрирующего зонда 4-6 и измерения мембранных или транс-эпителиальных потенциалов с помощью системы микроэлектродного 7-10 позволяют измерение электрических параметров клеточных мембран и эпителиальных клеточных слоев, они дают нет указание вида ионов, участвующих.Микроэлектроды с селективным ионофора можно измерить конкретный концентрации ионов в растворе. Ионные градиенты или поток может быть измерена с двумя или более электродами в различных положениях. Тем не менее, внутренняя напряжение дрейфа каждого зонда будет отличаться, в результате чего точность измерений или даже обнаружение градиентом, который не присутствовал. Один электрод используется в режиме "автореферентных", когда он движется на низкой частоте между двумя точками решает эту проблему. Теперь поток ионов можно увидеть на фоне относительно медленного и стабильного сигнала дрейфа (рис 3B). Измерительная система ионно-чувствительный использует ион-селективные автореферентных микроэлектродов для обнаружения малых внеклеточные потоки ионов, близких к ткани или отдельные клетки. Система состоит из усилителя, который обрабатывает сигнал от микроэлектрода и микро шаговый двигатель и водителю контролировать движение микроэлектрода. Ионоселективный микроэлектрода и электрод сравнения, что замкнуть цепь подключены к усилителю через headstage предварительного усилителя (фиг.1А). Компьютерное программное обеспечение определяет параметры движения микроэлектродов (частота, расстояние), а также записывает выход усилителя. Шаговый двигатель управляет движением микроэлектрода через трехмерного микроподвижки. Низкая частота вибрационный ион-селективный микроэлектрод была впервые разработана в 1990 году для измерения потока конкретной кальция 11. А также кальций, коммерчески доступные ионофорные коктейли теперь доступны, чтобы сделать MICRoelectrodes чувствительны к натрия, хлорид, калия, магния, водорода, нитрат, аммоний, фтористый литий, или ртуть.
В принципе, автореферентное ионно-селективной микроэлектрода преобразует активность конкретного иона растворенного в растворе в электрический потенциал, который может быть измерен с помощью вольтметра. Ионофор коктейль не смешивается жидкость (органические, липофильный) фаза с ионообменных свойств. Ионофор избирательно связывается комплексов () конкретных ионов обратимо и передает их между водного раствора, содержащегося в микроэлектродов (электролит) и водного раствора, в котором микроэлектрода погружен (фиг 1D). Это перенос ионов приводит к электрохимической равновесия и изменение электрического потенциала между микроэлектрода и электродом измеряется с помощью вольтметра. Напряжение пропорционально логарифму активности ионов конкретного согласно Нернста еquation позволяет рассчитывать концентрацию ионов (рис 2А и В).
В настоящее время, несколько систем позволяют измерять потока ионов с помощью подобную концепцию или принцип. Например, сканирование Ион-селективный электрод Техника (Siet) 12,13 или (MIFE) метод Микроэлектродные потока ионов Оценка развивается Ньюманом и Shabala 14-16 коммерчески доступны и широко используется в научном сообществе с целью определения конкретного ион флюсы происходящих на клеточной мембране и ткани в различных животных, растений и моделей отдельных живой клетки. Ионоселективные микроэлектродов были использованы для измерения водорода, калия и кальция поток через корни растений 17, поток хлорида в церебральных артерий крысы 18 и в пыльцевых трубок 19, поток водорода в коньках клеток сетчатки 20, поток кальция в кости мыши 21, различные ионов потоки в гиф гриба 22 и в Rна роговице 23 и, наконец, потока кальция во время одной раны клеток исцеления 12,24. Смотрите также следующую обзор для детальной информации о ионоселективных автореферентными микроэлектродов 25.
Следующая статья подробно описывает, как подготовить и выполнить измерения эндогенных внеклеточных потоков ионов с использованием ионно-селективный автореферентных технику микроэлектродного на одном уровне клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ион-селективный автореферентных Микроэлектродные Подготовка
- Приготовление ион-селективного микроэлектрода
- Тепло тянуть тонкостенных боросиликатного капилляров без нити (1,5 мм наружный диаметр, мм 1.12 Внутренний диаметр) с использованием микроэлектрода съемник.
Примечание: Это дает подсказки 3-4 мкм в диаметре. Меньшие иглы имеют более высокое сопротивление, что делает микроэлектродов более восприимчивы к электронным шумом и также связан с более медленной реакции на изменение концентрации ионов. Полезную информацию можно найти в статье, опубликованной Smith и соавт. 26. - Silanize электроды оказывать внутренней поверхности гидрофобной, чтобы помочь сохранению липофильного коктейль ионофором. Поместите микроэлектродов в металлической стойки и тепловой O / N в печи при> 100 ° C, чтобы высушить их. Стойка металлическая пластина с отверстиями диаметром 2 мм пробурено часть пути через. Поместите электроды в отверстия кончика вверх с 250 мл гдевушка стакан над ними.
- Утром, выключите духовку и при ношении изолирующие перчатки, аккуратно удалите металлическую стойку с электродами и стакан на место. Закройте дверцу, чтобы сохранить тепло.
- Носите латексные или нитриловые перчатки, халат и защитные очки. С пластиковой пипетки Пастера, поместить каплю раствора силанизация I в основании каждого электрода (держать стакан в месте, использование разливочного губу для доступа пипетки). Решение силанизация испаряется в горячей плите и silanizes внутри электродов. Используйте химический вытяжной вытяжку для этого этапа. Поместите стойки / стакан / электроды назад в горячей духовке в течение нескольких часов, чтобы позволить любые оставшиеся силанизация раствор испаряется.
Примечание: По соображениям безопасности, не включайте духовку обратно. Поставьте метку на печи, указывающий он не должен быть включен, поскольку это может содержать вредные и легковоспламеняющиеся пары. - После охлаждения, хранения микроэлектродов в памяти микроэлектрод банку Insiде стеклянную эксикатор с 400 г осушителя. Микроэлектроды можно хранить таким образом, в течение многих недель.
Примечание: Альтернативный метод силанизация описано в Smith и соавт 26. - Назад заполнения микроэлектрода с 50 до 100 мкл (длиной около 1 см) в растворе, содержащем 100 мМ иона должны быть измерены (таблица 1 и рис 1b). Используйте одноразовые пластиковые пипетки Пастера тепло вытащил в горелку к тонкой нити. Промойте пипетку в дН 2 O позже, чтобы предотвратить засорение.
Примечание: В качестве альтернативы, регулировать концентрацию ионов в растворе засыпки, чтобы соответствовать концентрации иона во внешнем растворе 27. - Соблюдайте микроэлектрод под микроскопом рассекает, чтобы обеспечить отсутствие пузырьков воздуха.
- Если имеются пузырьки кран микроэлектрод слегка ногтем, удерживая электрод вертикально (чаевые вниз) и / или нажать пузырьS из кончика путем применения обратного давления с помощью шприца, модифицированного силиконовой трубки Замена иглы.
- Подсказка заполнения микроэлектрода с 15 до 20 нл (длиной 30-50 мкм) ион-специфических ионофора коктейль (таблица 1). Поставьте маленькую капельку ионофора коктейль на короткой стороне предметное стекло. Соблюдайте кончик микроэлектрода при вскрытии микроскопом и переместить его к предметное стекло, пока наконечник микроэлектрод не коснется ионофор коктейль только около половины сек. Нарисуйте ионофор коктейль в микроэлектродом счет капиллярного давления.
Примечание: Избегайте длинная колонна ионофора коктейль, поскольку это увеличивает электрическое сопротивление зонда, который может сделать его восприимчивым электронных помех (шумов), а также замедляет время отклика. - Установите микроэлектрод в прямой держатель микроэлектродов с золотой 1 мм разъемом мужского и AgCl (Ag +) провод (рис 1B). </ LI>
- Установите держатель микроэлектрода в стадии головки, установленной на трехмерной компьютерным управлением электронного микроподвижки (фиг.1А).
- Поместите кончик микроэлектрода в измеряемого раствора подходящим для измеряемого образца (физиологический солевой раствор, культуральную среду и т.д.), чтобы позволить микроэлектрода для стабилизации в течение часа или два, или даже в течение ночи.
- Тепло тянуть тонкостенных боросиликатного капилляров без нити (1,5 мм наружный диаметр, мм 1.12 Внутренний диаметр) с использованием микроэлектрода съемник.
- Подготовка контрольного электрода
- Электроды (рис 1c) такие же, как указано выше капилляров. Разрежьте капиллярную с алмазной карандашом на 5 см длины и огневой полировкой на каждом конце для 1-2 сек в пламени Бунзена.
- Заполните эти электроды с ~ 200 мкл 3 М раствора NaCl, СН 3 СО 2 К (ацетат калия) или KCl 2% агарозы. Выбрать решение в зависимости от иона должна быть измерена (электрод не должен содержать ион измеряемого; таблица 1). Смешиватьагарозы и решение и тепло почти кипения в микроволновой печи. Движение, чтобы растворить агарозы (решение выходит ясно).
- Прикрепите электрод в пластиковом пипетки Пастера и сделать горячий раствор в капилляре.
- Оставьте электрод в холодную 3 М NaCl, CH 3 CO 2 K или раствора хлорида калия и в магазине в этом 3 М раствора в закрытых трубах до использования. Откажитесь от любых электродов сравнения с воздушными пузырьками.
- Установить электрод в держатель прямой микроэлектродов (предварительно заполнены 3 М раствора) с AgCl (Ag +) гранул внутри и золото 2 мм штырьковый разъем (рис 1c) и прикрепить электрод и держатель на ручной микро-позиционером установленный на магнитной подставке.
2. Ион-селективный автореферентных Микроэлектродные калибровки
- Подготовка калибровочные растворы, содержащие ион интерес как в эталонного раствора; Таблица 1 (например, культуры средств массовой информации, физиологический раствор). То есть, один калибровочный раствор должен содержать более низкую концентрацию иона, чем в измерительном растворе, и один выше.
- Например, можно использовать физиологический раствор, содержащий 1 мМ K +. К кронштейну эту концентрацию, растворить порошок KCl в деионизованной воде до концентрации 10, 1 и 0,1 мМ в серийных разведений. Используйте эти калибровочные растворы. В качестве альтернативы, использовать как минимум два из этих решений.
- Опустить ион-селективный микроэлектрода и электрод сравнения в каждого калибровочного раствора и пусть значение напряжения стабилизации в течение от 1 до 3 мин перед записью соответствующего напряжения с помощью специального программного обеспечения (таблица 1).
- Как программа сохраняет данные (выход усилителя), как текстовый файл, скопировать данные в файл электронной таблицы. Участок вывода микроэлектродного (мВ) от логарифмамолярная концентрация иона (фиг.2А).
- Применить линейную регрессию и вычислить Нернста наклона, перехват и R 2 значения. Примите микроэлектрод если наклон Нернста 58 ± 11 мВ / декада для одновалентных ионов и 29 ± 11 мВ / декада для ионов двухвалентных (для катионов, наклон Нернста положительный, для анионов отрицательно). Кроме того, хорошие микроэлектродов должны иметь сильную линейную корреляцию (R 2> 0,9; рис 2B).
Примечание: мВ выход усилителя, используемого здесь дает мВ чтение с десятикратного увеличения. Значения должны быть разделены в десять раз. - Используйте линейный регрессионный формулу для преобразования сырья мВ выход микроэлектродом в фактической концентрации ионов (рис 2B).
3. Проверка ионоселективной Микроэлектродные техники
- Подготовка искусственный источник
- Искусственные капилляры источник те же капилляры каквыше. Тепло тянуть капилляр, используя съемник микроэлектрода, как в шаге 1.1.1.
- Засыпьте эти капилляры 200 мкл 1 М раствора NaCl, KCl, CaCl 2 2Н 2 O или рН буферных 4. Выбор искусственного исходный раствор в зависимости от иона должна быть измерена (таблица 1).
Примечание: В качестве альтернативы, тянуть электроды с большим диаметром наконечника (~ 20 мкм) и наконечником заполнить с теми же решений, но содержащий 0,5-1% агарозы (агарозы предотвратит объемного потока раствора). - Установите искусственного источника капилляр на микроманипулятора и погрузить его в растворе, используемом для измерения потока ионов в пробах. Оставьте искусственный источник в раствор в течение 30 мин до 1 часа, чтобы дать стабилизацию градиента.
- Подтверждение ион-селективного микроэлектрода
- Опустить ион-селективный микроэлектрода около одного сантиметра от искусственного источника капилляра в растворе, используемом для measuRe потока ионов на образцах и закрыть контур с электродом, как и раньше. Пусть величина напряжения стабилизации в течение от 1 до 3 мин перед записью соответствующего напряжения с помощью специального программного обеспечения в течение 1 2 мин. Это значение соответствует значению буфера (в литературе также называют в качестве эталонного, фон или пустое значение).
- Перемещение ион-селективный микроэлектрода до примерно 5 мкм от искусственного источника, и пусть значение напряжения стабилизации в течение от 1 до 3 мин перед записью соответствующего напряжения с помощью программного обеспечения для 1 до 2 мин.
- Повторите вышеописанную процедуру, помещая ионоселективных микроэлектрода в 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 и 1280 мкм от искусственного источника капилляра.
- Извлечение данных как текстовый файл и скопируйте значения в файле электронной таблицы.
- Вычислить концентрацию ионов, соответствующих значениям мВ таким же образом, как и для калибровочных значений. Участок значение.
НетTe: Если поток ионов присутствует, микроэлектрода обнаруживает разницу в концентрации ионов между двумя положениями (Фиг.3В). Если искусственный источник содержит больше ионов вида измеренных, чем решение, концентрация должна быть выше близко к источнику, чем далеко, проверки способности ионоселективной микроэлектродом правильно определить направление потока ионов в (в данном случае Отток; для искусственного раковиной, с низкой удельной концентрации ионов, чем измеряемой среды, он должен быть приток).- Рассчитать поток ионов, используя закон Фика диффузии: J = с μ (DC / дх), где с-концентрация ионов в растворе (моль см -3), μ является подвижность ионов (моль см -1 N сек -1) и постоянного тока разница концентрация на расстоянии дх (см) (рис 2С). Данные потока ионов, как правило, представлены в пмоль см -2 с-1 Или -2 нмоль см сек -1.
Примечание:.. Альтернативный метод расчета потока ионов, описанной Смитом и др 26 может быть использован. Основные различия включают в себя использование коэффициента диффузии вместо подвижность ионов и вычитание фона потока ионов (также напряжения на дрейф или поправочный коэффициент), рассчитанной из измерений потока ионов в солевом растворе без образца. - Участок среднее ионных потоков каждого шага против расстоянии от источника (рис 2D). Отойдя от источника, наблюдать экспоненциальное падение стоимости потока данных, подтверждающих способность ион-селективного микроэлектродом чувствовать разной величины ионных потоков.
- Сделайте проверку искусственного источника один раз для каждого конкретного иона, предназначенной для записи, чтобы проверить ее правильные измерения направления и величины с большой сигнал-пУаз отношение.
Примечание: Измерение потока ионов буфера без образцов показывает уровень фона или шума. Как правило, измерения буфера не показывает четкую колебания концентрации ионов, ведущей к очень малым потоком, который отображает переменных направлений.
- Рассчитать поток ионов, используя закон Фика диффузии: J = с μ (DC / дх), где с-концентрация ионов в растворе (моль см -3), μ является подвижность ионов (моль см -1 N сек -1) и постоянного тока разница концентрация на расстоянии дх (см) (рис 2С). Данные потока ионов, как правило, представлены в пмоль см -2 с-1 Или -2 нмоль см сек -1.
4. Подготовка измерительной камере
Примечание: Перед экспериментами, рассмотрим образец для измерения и как образец должен быть установлен и иммобилизованных для измерения микроэлектродов.
- Для Xenopus Laevis измерения ооцитов вырезать 1 см площади 800 мкм нейлон сетки (сетки NITEX) и приклейте ее в пластиковый Петри (рис 1E).
5. Поток Измерение Ион
- Измерение концентрации ионов, присутствующих в буфер, используемый для выполнения измерения на образце таким же образом, как для калибровочного раствора. Х. Laevis ооциты требуют Марка Modified Рингер (MMR). Dissolve NaCl, KCl, CaCl, MgCl и HEPES в деионизированной воде до конечной концентрации (мм): 100 NaCl, KCl 2, 2 CaCl, MgCl и 1 5 HEPES. Доводят рН буфера до 7,5 с использованием NaOH.
- Поместите образец в измерительную камеру и довести ион-селективный микроэлектрода близко к образцу (примерно 10 мкм) с применением в микроподвижки чтобы определить закрытое положение микроэлектрода (фиг.3А).
- Начало низкой частоты (0,3 Гц) экскурсии (100 мкм) микроэлектрода между закрытом положении и в положении от образца (отдаленного) с использованием специального программного обеспечения. Убедитесь, что движение микроэлектрода перпендикулярно поверхности образца.
Примечание: экскурсия по микроэлектродом может быть установлен на программное обеспечение. Большая экскурсия увеличивает градиент прочитать позволяет легче обнаружить мелких потоков во время измерения время удлиняет интервал дискретизации и уменьшает временное разрешение. Увидеть- Начните запись с помощью программного обеспечения. Микроэлектрода паузу в каждом положении и электрический потенциал в мВ записывается на компьютере. Получение измерения, по меньшей мере 2 мин, позволяя стабилизации сигнала. Для коротких покадровой экспериментов, запись потенциальных изменений в положении интерес в течение всего времени, конечно.
- Извлечение данных как текстовый файл и скопируйте значения в файле электронной таблицы.
- Вычислить концентрацию ионов, соответствующих значениям мВ таким же образом, как и для калибровочных значений. Участок значение.
Примечание: Если поток ионов присутствует, микроэлектрода обнаруживает разницу в концентрации ионов между двумя положениями (Фиг.3В).- Рассчитать поток ионов, используя закон Фика диффузии, как и раньше (шаг 3.3.1).
- Повторите измерение буфера перед измерением новый образец и повторить процедуру измерения потока и расчета для каждого новогообразец.
6. Статистический анализ и представления данных
- Проверьте независимые эффекты положения и / или времени на ионных потоков при условии управления использованием ANCOVA модели со смешанными эффектами 28.
Примечание: Анализ ковариации (ANCOVA) является общей линейной модели, которая смешивает регулярное ANOVA и регрессии, позволяя одновременно категорные и непрерывные меры, которые будут использованы в качестве независимых переменных. Кроме того, в присутствии коррелированных ошибок, вызванных повторными измерениями в отдельных и возможных вложенных эффектов, смешанные эффекты модели используются, чтобы моделировать точные оценки фиксированных и случайных эффектов. - Рассчитать парных сравнений с использованием Стьюдента Испытайте между уровнями группы с коррекцией Бонферрони для многократного тестирования 28.
- Создание присущи рефлективный, вербальный, чтобы обобщить измерения потока ионов в соответствии с положением и времени. Включить р значения из попарно Стьюдента, описанноговыше (рис 3D) и указать уровни значимости р значений следующим образом: *: р <0,05; **: Р <0,01; ***: Р <0,001 29
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ранее мы уже показали, что приток кальция появляется после одной клетки ранив 24. Поэтому мы попросили, происходят ли другие потоки ионов на одной ранения клеток. Мы использовали X. Laevis яйцеклетки, устоявшуюся модель одной клетки заживления ран 30-34 и электрофизиологические записи 24,35-39. Интересно, что ионы калия являются более концентрированными внутри X. Laevis ооциты (около 110 мм), чем в 40 внеклеточной раствора, используемого (в MMR 1x: 1 мм) предлагая отток калия После ранения. Для того чтобы подтвердить эту гипотезу, мы измерили поток калия в ходе X. Laevis ооцитов клеточную мембрану исцеление с помощью ион-селективного автореферентных микроэлектрод.
Ранить яйцеклетки, вытяните капиллярную электрод с большим размером наконечника (~ 50 мкм). Прикрепите электрод прямой держатель электрода и установите на ручной микро-позиционером. Ранить oocyте, коснувшись мембраны с кончиком 24 электрода. Вскоре после ранения мы обнаружили большое отток калия (до 250 нмоль см -2 с -1; Рисунок 3B - D). Как мембраны рана зажила, этот поток уменьшается, возвращаясь к единой раны значений потока видели в неповрежденной мембраны (~ 5 нмоль см -2 с -1), когда рана зажила (до 16 мин после ранения; Рисунок 3B - D). ANCOVA выявлено значительное влияние времени после ранения на измерениях потока калия (р <0,001). Постфактум анализ показал, значительно увеличилось отток калия на 1-2 мин (р <0,001) и на 5-6 мин (р <0,05), но не 15-16 мин после ранения, по сравнению с интактной состоянии клеточной мембраны (рис 3D). Мы пришли к выводу, что при однократном ранения клеток, истечение калия появляется на уровне раны, которые уменьшить дикольцо курс исцеления.
| Ион | Ионофорные коктейль | Раствор электролита (100 мМ) | Эталонный раствор (3 М) | Решение Искусственный источник (1 М) |
| Са 2+ | Кальций ионофорные я коктейль (кошка # 21048) | CaCl 2 2H 2 O | KCl | CaCl 2 2H 2 O |
| Na +, | Натрий ионофорные II коктейль (кошка # 71178) | NaCl | KCl | NaCl |
| Cl - | Хлорид ионофорные я коктейль (кошка # 24902) | NaCl | СН 2 СО 2 К (калия ацетат) | NaCl |
| К + | Калий ионофорные я коктейль (кошка # 60031) KCl | NaCl | KCl | |
| Н + | Водород ионофорные я коктейль (кошка # 95291) | рН 7,0 | KCl | рН 4,0 |
Таблица 1:. Примеры обычно используемых ионофорные коктейлей Также показаны соответствующие решения разместить в микроэлектродов, для искусственного источника и выполнять калибровку. Каталожные номера от Sigma-Aldrich.
Рисунок 1:. Ионоселективные микроэлектродов (А) Схематическое представление ион-селективного автореферентных системы микроэлектродов. (B), Ион-селективный микроэлектрод. (С) электрода сравнения. (D) Ионный обмен между внешним раствором и microelectrode через ионофора. (Е) Схема измерения камерой для X. Laevis яйцеклетки.
Рисунок 2: Ион-селективные микроэлектродов калибровки, искусственный источник и расчета потока () Калибровочная кривая.. (Б) Уравнение кривой калибровки и расчета концентрации ионов. (С) Расчет потока ионов. (D) Ион поток измеряется в определенных расстояниях от искусственного источника (1 М KCl).
Рисунок 3: Эволюция потока калия в X. Laevis ооцитов рану во время заживления. () Фотография и иллюстрация экскурсииионно-селективного микроэлектрода измерения концентрации ионов в X. Laevis ооцитов рану; пунктирная линия между '' '' и '' V '' представляет собой животное-вегетативной оси. (Б) Иллюстрация изменения концентрации ионов калия в X. Laevis ооцитов рану во время заживления. (С) Разброс (XY) график, показывающий среднее и стандартную ошибку измерений калия поток на уровне раны в разное время в течение X. Laevis ооцитов заживление ран. (D) Boxplot показывающий измерение потока калия на уровне раны в разное время в течение X. Laevis ооцитов заживления ран (N = 16; р значения, указанные в следующем: *: р <0,05; ***: р <0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее важные шаги для успешного измерения внеклеточного потоков ионов в естественных условиях являются: снижение шума, правильно выдумка ион-селективные микроэлектродов и электродом сравнения, и позиционирование образца и обоих электродов.
Для того чтобы минимизировать шум, система записи должна быть в заземленную (заземленной) клетки Фарадея предпочтительно с (виброизоляции) металлический стол с верхом, который также заземлена. Кроме того, шасси микроскопа должна быть также заземлена. Источники электрического шума включают в себя источник света. Волоконно-оптические 'фан-меньше "источник света вызывает минимальное электрического шума. Наконец, сохраняя серебряной проволоки и осадок в микроэлектродом держатели хлорированном также минимизирует шум (падение в хлорной гипохлорита натрия и промыть в дН 2 O) .В наличии пузырьков воздуха в ион-селективного микроэлектродом или в электрод сравнения приведет измерения отказ впроводимость микроэлектродом будет ноль или скомпрометирован. Таким образом, важно, чтобы убедиться, электроды под микроскопом до монтажа их на владельцев. См протокол для детальной процедуры для удаления пузырьков воздуха. Правильное позиционирование как образец и микроэлектродов требуются для того, чтобы обеспечить надежные и воспроизводимые результаты. Измерение потока ионов зависит от экскурсии микроэлектрода и его положение по отношению к образцу. Важно, чтобы точно определить область интереса, которые будут измеренную на образце и положение микроэлектрода иметь перпендикулярное движение от образца. Любая экскурсия микроэлектродов таким образом, что не перпендикулярно к образцу приведет измененной ионных потоков измерений и повышенной изменчивости среди образцов.
Ионофора коктейли выделенные для измерения конкретных ионов, например калий, также может обнаруживать присутствие других ионов, таких как натрий.В случае, измерительный раствор содержит большое количество конкурирующего иона для ионофора коктейль, важно, чтобы определить селективность ионофора коктейль с помощью эксперимента искусственного источника. Здесь раствор, используемый для культуры X. Laevis ооциты (MMR) содержит высокую концентрацию натрия. Таким образом, важно, чтобы оценить чувствует ли коктейль ионофор калия используется также натрий. При использовании ионофор калия коктейль заполненный микроэлектрода, можно попытаться измерить поток натрия, используя искусственный источник, который содержит высокую концентрацию натрия (1 М NaCl; таблица 1) сохраняя тот же измерительный решение. Химический градиент способствует оттоку натрия, но в идеале не поток натрия не должно быть обнаружено ионофора коктейль калия от конкретных условий. Если значительный поток измеряется, экспериментальное условие должно быть оптимизировано. Например, концентрации конкурирующего иона может быть снижена до точки, мicroelectrode не чувствует его больше, в то время как это может повлиять на поток натрия через мембрану плазмы, ведущей к потенциальной помехи во время измерений потока калия. В идеале, корректирующий коэффициент вычисляются из эксперимента искусственного источника может быть применен к данным, или другой ионофор коктейль может быть проверена. Поток ионов измерения с помощью ион-селективного автореферентных микроэлектрод позволяют измерение потоков ионов происходит в клетках и тканях в водном растворе. Измерения ионных потоков в клетки или ткани, которые обычно в контакте с воздушной среде требует присутствия в растворе, который не естественным образом присутствуют в окружающей их среде и которые могут изменять поток ионов и обмен, который происходит при нормальных условиях. Особое внимание должно быть сделано, чтобы определить содержание такого решения и минимизировать отклонения от оригинала, физиологической среде. Спектр ионов, которые могут быть измерены с помощью ион-селективных автореферентными microelectrode техника зависит от наличия и существования конкретных ионофорные коктейлей селективных к иону интересов.
Измерения потока ионов, выполненные с ионоселективной автореферентных микроэлектродом сделали в растворе, как правило, вблизи поверхности клеток или тканей, что позволяет неинвазивным измерения внеклеточной потоков ионов. Этот метод не позволяет измерять ионных потоков внутри тканей, между клеткой и межклеточного пространства. Ионоселективный автореферентное микроэлектрод не единственный метод, который позволяет измерять ионных потоков в естественных условиях. Альтернативный новый метод использует люминесцентные Биоэлектричество журналистам 41, который позволяет измерять ионных потоков, которые не возможно с помощью микроэлектродов. Эти красители позволяют измерения ионов потоков внутри тканей и клеток и может достичь внутриклеточную локализацию. Эта методика может приобрести пространственную информацию потока ионов внутри тканей и клеток, но не ионного эксПереключение между тканью и внеклеточном пространстве. Кроме того, люминесцентные Биоэлектричество журналисты обычно генерируют полу-количественные данные. Использование микроэлектрода на основе технологии для измерения ионные потоки остается в силе, и необходимо и приносит дополнительную информацию с использованием флуоресцентных Биоэлектричество репортеров, что делает их взаимодополняющие, а не конкурирующие технологии. Кроме того, интересные современные разработки включают в амперометрические автореферентных детекторы кислорода, оксида азота и нейромедиаторов дофамина и глутамата 42,43. Амперометрическое зондирования основан на химической реакции на кончике датчика. Новые волоконно-оптические микроэлектродов ("optrodes") были разработаны для измерения неинвазивного поток кислорода метаболическим 34,35 и рН 44 с высокой селективностью и чувствительностью 45,46. Существует в настоящее время также на основе ферментов наночастиц с покрытием зонда чувствительный к глюкозе 47.
Мы видели, что йе Ионоселективный автореферентное микроэлектрод позволяет проводить измерения потоков внеклеточных ионов в естественных условиях. Ионы не только обмениваются клеток / тканей и внеклеточном пространстве, но и между клеток и тканей в живых организмах. Важно сочетать эту технику с другими, например, люминесцентных Биоэлектричество журналистами для того, чтобы оценить пространственное разрешение ионных потоков внутри тканей, в дополнение к фактическим измерениям ионных потоков вблизи ее поверхности. Кроме того, ионные потоки представляют собой важную часть биоэлектрической государства, определяющим клеток и тканей вместе с клеточной мембраны потенциала, транс-эпителии потенциала или внеклеточного электрических токов. Это важно, в дополнение к измерению ионных потоков, для измерения, в комбинации, клеточной мембраны и транс-эпителиев потенциала, а также внеклеточных электрических токов 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IonAmp | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Headstage pre-amplifier | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| MicroStep Driver | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Manual micropositioner | World Precision Instruments | Model KITE-R | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | Model M10 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Vibration isolation table | Newport Inc. | Model VW-3036-OPT-023040 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces | Newport Inc. | Model 360-90 | Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table |
| Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | none |
| Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | none |
| Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament | World Precision Instruments | TW150-4 | none |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | none |
| Metal rack | Made in-house | none | Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel |
| Oven | QL | Model 10 Lab Oven | none |
| Silanization solution I | Sigma-Aldrich | 85126 | Hazardous, handle as recommended by provider |
| Glass Petri dish; Pyrex | Fisher Scientific | 316060 | none |
| Electrode/micropipette storage jar | World Precision Instruments | E215 | none |
| Glass dessicator | Fisher Scientific | 08-595E | Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight. |
| Plastic Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11597722 | none |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | S97329 | none |
| Microscope slide | Sigma-Aldrich | S8902 | none |
| Straight microelectrode holder | Warner Instruments | QSW-A15P | with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire |
| Straight microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH3S | with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector |
| 6 cm Petri dish | VWR | 60872-306 | none |
| Nitex mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX750 | none |
| Glue; Loctite epoxy | VWR | 500043-451 | Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing |
| Deionized water | Sigma-Aldrich | 99053 | none |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | none |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | none |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | none |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | none |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | none |
| Sodium Hydroxyde | Sigma-Aldrich | S8045 | none |
| Potassium Acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | none |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | none |
References
- Weber, W. M., Liebold, K. M., Clauss, W. Amiloride-sensitive Na+ conductance in native Xenopus oocytes. Biochimica et biophysica acta. 1239, 201-206 (1995).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. Journal of cell science. 122, 4267-4276 (2009).
- Zhao, M. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Seminars in cell & developmental biology. 20, 674-682 (2009).
- Jaffe, L. F., Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. The Journal of cell biology. 63, 614-628 (1974).
- Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nature protocols. 2, 661-669 (2007).
- Reid, B., Zhao, M. Measurement of bioelectric current with a vibrating probe. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Moore, J. W. The patch clamp: single-channel recording. Science. 224, 50-51 (1984).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of visualized experiments. , (2008).
- McCaig, C. D., Robinson, K. R. The ontogeny of the transepidermal potential difference in frog embryos. Developmental biology. 90, 335-339 (1982).
- Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F. Detection of extracellular calcium gradients with a calcium-specific vibrating electrode. The Journal of cell biology. 110, 1565-1573 (1990).
- The use of the vibrating probe technique to study steady extracellular currents during pollen germination and tube growth. Fertilisation in Higher Plants: molecular and cytological aspects. Cai, G., Cresti, M., Moscatelli, A. , Springer-Verlag. 235-252 (1999).
- Kunkel, J. G., Xu, Y., Shipley, A. M., Feijó, J. A. The use of non-invasive ion-selective microelectrode techniques for the study of plant development. Plant Electrophysiology – Theory and Methods. (ed Volkov AG. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 109-137 (2006).
- Ordonez, N. M., Shabala, L., Gehring, C., Shabala, S. Noninvasive microelectrode ion flux estimation technique (MIFE) for the study of the regulation of root membrane transport by cyclic nucleotides. Methods in molecular biology. 1016, 95-106 (2013).
- Tegg, R. S., Melian, L., Wilson, C. R., Shabala, S. Plant cell growth and ion flux responses to the streptomycete phytotoxin thaxtomin A: calcium and hydrogen flux patterns revealed by the non-invasive MIFE technique. Plant & cell physiology. 46, 638-648 (2005).
- Newman, I. A. Ion transport in roots: measurement of fluxes using ion-selective microelectrodes to characterize transporter function. Plant, cell & environment. 24, 1-14 (2001).
- Kochian, L. V., Shaff, J. E., Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F., Lucas, W. J. Use of an extracellular, ion-selective, vibrating microelectrode system for the quantification of K(+), H (+), and Ca (2+) fluxes in maize roots and maize suspension cells. Planta. 188, 601-610 (1992).
- Doughty, J. M., Langton, P. D. Measurement of chloride flux associated with the myogenic response in rat cerebral arteries. The Journal of physiology. 534, 753-761 (2001).
- Messerli, M. A., Smith, P. J., Lewis, R. C., Robinson, K. R. Chloride fluxes in lily pollen tubes: a critical reevaluation. The Plant journal : for cell and molecular biology. 40, 799-812 (2004).
- Molina, A. J., et al. Neurotransmitter modulation of extracellular H+ fluxes from isolated retinal horizontal cells of the skate. The Journal of physiology. 560, 639-657 (2004).
- Marenzana, M., Shipley, A. M., Squitiero, P., Kunkel, J. G., Rubinacci, A. Bone as an ion exchange organ: evidence for instantaneous cell-dependent calcium efflux from bone not due to resorption. Bone. 37, 545-554 (2005).
- Lew, R. R. Ionic currents and ion fluxes in Neurospora crassa hyphae. Journal of experimental botany. 58, 3475-3481 (2007).
- Vieira, A. C., et al. Ionic components of electric current at rat corneal wounds. PloS one. 6, e17411 (2011).
- Luxardi, G., Reid, B., Maillard, P., Zhao, M. Single cell wound generates electric current circuit and cell membrane potential variations that requires calcium influx. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 6, 662-672 (2014).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. H. , (2007).
- Smith, P. J., Hammar, K., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Trimarchi, J. R. Self-referencing, non-invasive, ion selective electrode for single cell detection of trans-plasma membrane calcium flux. Microscopy research and technique. 46, 398-417 (1999).
- Messerli, M. A., Smith, P. J. Construction theory, and practical considerations for using self-referencing of Ca(2+)-selective microelectrodes for monitoring extracellular Ca(2+) gradients. Methods in cell biology. 99, 91-111 (2010).
- Chambers, J., Hastie, T., Pregibon, D. Ch. 48. Compstat. Momirović, K., Mildner, V. , Physica-Verlag HD. 317-321 (1990).
- Chambers, J. M., Cleveland, W. S., Kleiner, B., Tukey, P. A. Graphical methods for data analysis. , Wadsworth & Brooks/Cole. (1983).
- Burkel, B. M., Benink, H. A., Vaughan, E. M., von Dassow, G., Bement, W. M. A Rho GTPase signal treadmill backs a contractile array. Developmental cell. 23, 384-396 (2012).
- Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current biology : CB. 9, 579-587 (1999).
- Mandato, C. A., Bement, W. M. Contraction and polymerization cooperate to assemble and close actomyosin rings around Xenopus oocyte wounds. The Journal of cell biology. 154, 785-797 (2001).
- Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. The Journal of cell biology. 168, 429-439 (2005).
- Simon, C. M., Vaughan, E. M., Bement, W. M., Edelstein-Keshet, L. Pattern formation of Rho GTPases in single cell wound healing. Molecular biology of the cell. 24, 421-432 (2013).
- Petersen, C. C., Dupont, G. The initiation of a calcium signal in Xenopus oocytes. Cell calcium. 16, 391-403 (1994).
- Horisberger, J. D., Lemas, V., Kraehenbuhl, J. P., Rossier, B. C. Structure-function relationship of Na,K-ATPase. Annual review of physiology. 53, 565-584 (1991).
- Miledi, R. A calcium-dependent transient outward current in Xenopus laevis oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. London, England, , 491-497 (1982).
- Miledi, R., Parker, I. Chloride current induced by injection of calcium into Xenopus oocytes. The Journal of physiology. 357, 173-183 (1984).
- Parker, I., Miledi, R. A calcium-independent chloride current activated by hyperpolarization in Xenopus oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. 233, 191-199 (1988).
- Costa, P. F., Emilio, M. G., Fernandes, P. L., Ferreira, H. G., Ferreira, K. G. Determination of ionic permeability coefficients of the plasma membrane of Xenopus laevis oocytes under voltage clamp. The Journal of physiology. 413, 199-211 (1989).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 385-397 (2012).
- Porterfield, D. M. Measuring metabolism and biophysical flux in the tissue, cellular and sub-cellular domains: recent developments in self-referencing amperometry for physiological sensing. Biosensors. 22, 1186-1196 (2007).
- McLamore, E. S., et al. A self-referencing glutamate biosensor for measuring real time neuronal glutamate flux. Journal of neuroscience methods. 189, 14-22 (2010).
- Yin, M., et al. Highly sensitive and fast responsive fiber-optic modal interferometric pH sensor based on polyelectrolyte complex and polyelectrolyte self-assembled nanocoating. Analytical and bioanalytical chemistry. 399, 3623-3631 (2011).
- Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrode technology for non-invasive real-time measurement of biophysical flux and physiological sensing. The Analyst. 134, 2224-2232 (2009).
- McLamore, E. S., Jaroch, D., Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrodes for measuring spatially resolved, real-time metabolic oxygen flux in plant systems. Planta. 232, 1087-1099 (2010).
- McLamore, E. S., et al. A self referencing platinum nanoparticle decorated enzyme-based microbiosensor for real time measurement of physiological glucose transport. Biosensors & bioelectronics. 26, 2237-2245 (2011).
