Abstract
Las células de animales, plantas y células individuales están encerradas por una barrera llamada la membrana celular que separa el citoplasma desde el exterior. Capas de células tales como epitelios también forman una barrera que separa el interior del exterior o diferentes compartimentos de organismos multicelulares. Una característica clave de estas barreras es la distribución diferencial de iones a través de membranas celulares o capas de células. Dos propiedades permiten esta distribución: 1) membranas y epitelios presentan permeabilidad selectiva a iones específicos; 2) iones son transportados a través de bombas a través de las membranas celulares y capas de células. Estas propiedades juegan un papel crucial en el mantenimiento de la fisiología del tejido y actúan como una señal de señales después de los daños, durante la reparación, o bajo condición patológica. La referencia a sí misma microelectrodo selectiva de iones permite mediciones de flujos específicos de iones tales como calcio, potasio o sodio en los niveles de células y tejidos individuales. El microelectrodo contiene un cóctel ionóforo que espermeable selectivamente a un ion específico. La solución de relleno interna contiene una concentración conjunto de los iones de interés. El potencial eléctrico de la microelectrodo se determina por la concentración fuera del ión. Como la concentración de iones varía, el potencial de la microelectrodo cambia como una función del logaritmo de la actividad de los iones. Cuando se mueve hacia atrás y adelante cerca de una fuente o sumidero del ion (es decir, en un gradiente de concentración debido a flujo de iones) el potencial microelectrodo fluctúa a una amplitud proporcional al flujo de iones / gradiente. El amplificador amplifica la señal de microelectrodos y la salida se registra en el ordenador. El flujo de iones se puede calcular entonces por la ley de difusión de Fick usando la fluctuación electrodo de potencial, la excursión de microelectrodo, y otros parámetros tales como la movilidad de iones específico. En este trabajo se describe en detalle la metodología para medir los flujos de iones extracelulares utilizando la autorreferencia microelectrodo un ion-selectivod presentar algunos resultados representativos.
Introduction
Todas las células animales están rodeadas por una membrana de bicapa lipídica que separa el citoplasma del ambiente exterior. La célula mantiene un potencial de membrana eléctrica, negativa en el interior, por el transporte activo de iones 1. El potencial de membrana es una fuente de energía almacenada que la célula puede utilizar para operar diversos dispositivos moleculares en la membrana 2. Las neuronas y otras células excitables tienen grandes potenciales de membrana. Apertura rápida de los canales de sodio se colapsa el potencial de membrana (despolarización) y produce el potencial de acción que es transportado a lo largo de la longitud de la neurona 2. Aparte de estos rápidos cambios eléctricos, muchos tejidos y órganos generan y mantienen los potenciales eléctricos significativos a largo plazo. Por ejemplo, la piel y el epitelio corneal generar y mantener los potenciales de trans-epiteliales y corrientes eléctricas extracelulares por bombeo direccional de iones (principalmente sodio y cloruro) 3.
tienda de campaña "> Mientras que las mediciones de corriente eléctrica extracelular endógena usando la sonda vibrante 4-6 y mediciones de la membrana o trans-epiteliales potenciales utilizando el sistema de microelectrodo 7-10 permitir la medición de los parámetros eléctricos de las membranas celulares y capas de células epiteliales, no dan indicación de las especies de iones implicados.Microelectrodos con ionóforo selectivo pueden medir la concentración de iones específicos en solución. Gradientes de iones o de flujo podrían ser medidos con dos o más electrodos en diferentes posiciones. Sin embargo, la variación de la tensión intrínseca de cada sonda sería diferente, provocando mediciones inexactas o incluso la detección de un gradiente de que no estaba presente. Un único electrodo utilizado en el modo de "auto-referenciación" por la cual se mueve a baja frecuencia entre dos puntos resuelve este problema. Ahora el flujo de iones puede ser visto en el contexto de una deriva de señal relativamente lento y estable (véase la Figura 3B). El sistema de medición sensible a los iones utiliza microelectrodos de autorreferencia selectivos de iones para detectar pequeños flujos extracelulares de iones cerca de los tejidos o células individuales. El sistema consta de un amplificador que procesa la señal desde el microelectrodo y un motor paso a paso y micro controlador para controlar el movimiento de la microelectrodo. El microelectrodo selectiva de iones y el electrodo de referencia que cerrar el circuito están conectados al amplificador a través de un cabezal de la platina pre-amplificador (Figura 1A). Software de ordenador determina los parámetros del movimiento microelectrodo (frecuencia, distancia) y también registra la salida del amplificador. El motor paso a paso controla el movimiento a través de un microelectrodo microposicionador tridimensional. Una baja frecuencia de vibración de microelectrodos selectivo de iones fue desarrollado por primera vez en 1990 para medir el flujo de calcio específico 11. Así como el calcio, cócteles ionóforos comercialmente accesibles ahora están disponibles para hacer microelectrodes sensible al sodio, cloruro, potasio, hidrógeno, magnesio, nitrato, amonio, fluoruro, litio o mercurio.
Básicamente, la técnica de microelectrodo selectiva de iones de autorreferencia convierte la actividad de un ion específico disuelto en una solución en un potencial eléctrico, que puede ser medida por un voltímetro. El cóctel de ionóforo es un líquido inmiscible fase (orgánica, lipófilo) con propiedades de intercambio iónico. El ionóforo complejos selectivamente (se une) iones específicos reversible y los transfiere entre la solución acuosa contenida en el microelectrodo (electrolito) y la solución acuosa en la que se sumerge el microelectrodo (Figura 1D). Esta transferencia de iones conduce a un equilibrio electroquímico y una variación del potencial eléctrico entre el microelectrodo y el electrodo de referencia se mide por el voltímetro. El voltaje es proporcional al logaritmo de la actividad del ión específico de acuerdo con la Nernst equation permitiendo el cálculo de la concentración de iones (Figura 2A y B).
En la actualidad, varios sistemas permiten la medición del flujo de iones usando un concepto o principio similar. Por ejemplo, la técnica de electrodo de exploración de ion selectivo (SIET) 12,13 o la técnica de microelectrodos Ion Flux Estimation (MIFE) desarrollado por Newman y Shabala 14-16 están comercialmente disponibles y ampliamente utilizados por la comunidad de investigación con el fin de determinar ion específica fundentes que ocurre en la membrana celular y el tejido a través de una variedad de modelos de células vivas individuales animal, vegetal y. Microelectrodos selectivos de iones se han utilizado para medir hidrógeno, potasio y flujo de calcio a través de raíces de la planta 17, cloruro de flujo en las arterias cerebrales de rata 18 y 19 en los tubos de polen, flujo de hidrógeno en células de la retina del patín 20, el flujo de calcio en el hueso del ratón 21, vario ion flujos de hifas fúngicas 22 y en ren la córnea 23, y finalmente el flujo de calcio en las células sola herida de curación 12,24. Ver también la siguiente revisión para obtener información detallada sobre autorreferencia microelectrodos selectivos de iones 25.
El siguiente artículo describe con detalle cómo preparar y llevar a cabo la medición de los flujos de iones extracelulares endógenos mediante la técnica de microelectrodos autorreferencia selectivo de iones a nivel de células individuales.
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Protocol
1. Ion selectivo autorreferencia Preparación microelectrodos
- Preparación de microelectrodos selectivo de iones
- Heat tire delgadas capilares de borosilicato de paredes sin filamento (1,5 mm de diámetro exterior, 1,12 mm de diámetro interior) con un extractor de microelectrodos.
Nota: Esto le da consejos de 3-4 m de diámetro. Consejos más pequeñas tienen mayor resistencia que hace microelectrodos más susceptibles al ruido electrónico y también está asociado con una respuesta más lenta a un cambio en la concentración de iones. Información útil se puede encontrar en el documento publicado por Smith et al. 26. - Silanizar los electrodos para hacer que la superficie interior hidrófobo para ayudar a la retención del cóctel ionóforo lipófilo. Colocar los microelectrodos en un bastidor de metal y el calor O / N en un horno a> 100 ° C para secarlos. El bastidor es una placa de metal con agujeros de diámetro 2 mm perforado parte del camino a través. Coloque los electrodos en los agujeros inclinar hacia arriba con una 250 ml gvaso de precipitados lass sobre ellos.
- Por la mañana, apague el horno y con guantes aislados, retire con cuidado la rejilla de metal con los electrodos y vaso de precipitados en el lugar. Cierre la puerta del horno para retener el calor.
- Use guantes de látex o nitrilo, bata de laboratorio y protección para los ojos. Con un plástico pipeta Pasteur, colocar una gota de solución de silanización I en la base de cada electrodo (mantener el vaso en su lugar, el uso del pico vertedor para acceder pipeta). La solución de silanización se vaporiza por la placa caliente y silanizes el interior de los electrodos. Use una campana de extracción de extracción química para esta etapa. Coloque la parrilla / vaso / electrodos de nuevo en el horno caliente durante un par de horas para permitir que cualquier solución silanización restante se evapore.
Nota: Por razones de seguridad, no encienda el horno de nuevo. Coloque una etiqueta en el horno que indica que no debe estar encendido, ya que puede contener vapores nocivos e inflamables. - Después de enfriar, almacenar los microelectrodos en un frasco de almacenamiento insi microelectrodoDe a desecador de vidrio con 400 g de desecante. Los microelectrodos pueden ser almacenados por lo tanto durante muchas semanas.
Nota: Un método alternativo silanización se describe en Smith et al 26. - Volver a llenar el microelectrodo con 50 a 100 l (una longitud de aproximadamente 1 cm) de una solución que contiene 100 mM de ion a medir (ver Tabla 1 y la Figura 1B). Use un Pasteur de plástico térmico pipeta desechable tirado en un mechero Bunsen a una multa de filamento. Enjuague la pipeta en dH 2 O después para evitar el bloqueo.
Nota: Como alternativa, ajustar la concentración de iones de la solución de relleno para que coincida con la concentración de iones en la solución externa 27. - Observar el microelectrodo bajo un microscopio de disección para asegurar la ausencia de burbujas de aire.
- Si las burbujas están presentes toque el microelectrodo ligeramente con la uña del dedo mientras se mantiene el electrodo verticalmente (la punta hacia abajo) y / o empujar la burbujas la punta aplicando contrapresión usando una jeringa modificada con un tubo de silicona de cambiar la aguja.
- Tip-llenar el microelectrodo con 15 a 20 nl (una longitud de 30-50 micras) de cóctel ionóforo específico de iones (véase la Tabla 1). Coloque una pequeña gota de cóctel ionóforo en el borde corto de un portaobjetos de microscopio. Observe la punta de microelectrodos bajo un microscopio de disección y moverlo hacia el portaobjetos de microscopio hasta que la punta de microelectrodos toca el cóctel ionóforo sólo alrededor de la mitad de un segundo. Dibuje el cóctel ionóforo en el microelectrodo por la presión capilar.
Nota: evite una larga columna de cóctel ionóforo ya que esto aumenta la resistencia eléctrica de la sonda que puede hacer que sea susceptible a la interferencia electrónica (ruido) y también ralentiza el tiempo de respuesta. - Monte el microelectrodo en un soporte de microelectrodos recta con un conector macho de 1 mm de oro y AgCl (Ag +) cable (Figura 1B). </ Li>
- Coloque el soporte de microelectrodos a la etapa de la cabeza montado en un microposicionador electrónico controlado por ordenador en tres dimensiones (Figura 1).
- Coloque la punta microelectrodo en la medición de solución adecuada para la muestra a medir (solución salina fisiológica, medio de cultivo, etc.) para permitir el microelectrodo se estabilice durante una hora o dos, o incluso durante la noche.
- Heat tire delgadas capilares de borosilicato de paredes sin filamento (1,5 mm de diámetro exterior, 1,12 mm de diámetro interior) con un extractor de microelectrodos.
- Preparación del electrodo de referencia
- Los electrodos de referencia (Figura 1C) son los mismos capilares como anteriormente. Cortar el capilar con un lápiz de diamante en 5 cm de longitud y pulido al fuego en cada extremo de 1.2 seg en una llama de Bunsen.
- Llenar estos electrodos con ~ 200 l de una solución de NaCl 3 M, CH 3 CO 2 K (acetato de potasio) o KCl con 2% de agarosa. Elige la solución en función del ion que se desea medir (el electrodo de referencia no debe contener el ion que se está midiendo; véase la Tabla 1). Mezclarla agarosa y la solución y el calor a casi hirviendo en un microondas. Agitar para disolver la agarosa (la solución pasa claro).
- Conecte el electrodo de referencia a una pipeta Pasteur de plástico y extraer la solución caliente en el capilar.
- La caída de la electrodo en frío M NaCl 3, CH 3 CO 2 K o solución de KCl y almacenar en esta solución 3 M en tubos sellados antes de su uso. Deseche todos los electrodos de referencia con burbujas de aire.
- Monte el electrodo de referencia en un soporte de microelectrodos recta con un AgCl (Ag +) de pellets (con solución 3 M llenas pre) en el interior y un oro 2 mm conector macho (Figura 1C) y conecte el electrodo y el soporte en un micro-posicionador manual de montado en un soporte magnético.
2. Ion selectivo autorreferencia microelectrodos Calibración
- Preparación de las soluciones de calibración que contienen el ion de interés como en la solución de referencia; véase la Tabla 1 (por ejemplo, medios de cultivo, solución salina fisiológica). Es decir, una solución de calibración debe contener una menor concentración de iones que en la solución de medición, y uno más alto.
- Por ejemplo, usar una solución salina que contiene 1 mM de K +. Para esta concentración entre paréntesis, disolver polvo de KCl en agua desionizada a una concentración de 10, 1 y 0,1 mM en diluciones seriadas. Utilice estas soluciones de calibración. Alternativamente, utilizar al menos dos de estas soluciones.
- Sumergir el microelectrodo selectiva de iones y el electrodo de referencia en cada solución de calibración y dejar que el valor de la tensión se estabilice durante 1 a 3 min antes de grabar el voltaje correspondiente usando el software dedicado (véase la Tabla 1).
- A medida que el software guarda los datos (salida del amplificador) como un archivo txt, copie los datos en un archivo de hoja de cálculo. Trazar la salida microelectrodo (mV) contra el logaritmo dela concentración de iones molar (Figura 2A).
- Aplicar una regresión lineal y calcular la pendiente de Nernst, interceptar y R 2 valor. Acepte el microelectrodo si la pendiente de Nernst es de 58 ± 11 mV / década para iones monovalentes y 29 ± 11 mV / década para iones divalentes (por cationes, la pendiente de Nernst es positivo, por aniones es negativo). Además, las buenas microelectrodos deberían tener una fuerte correlación lineal (R 2> 0,9; Figura 2B).
Nota: La salida de mV del amplificador utilizado aquí da lectura mV con una ganancia de diez veces. Los valores tienen que ser dividido por un factor de diez. - Utilice la fórmula de regresión lineal para convertir la salida mV en bruto de la microelectrodo en la concentración de iones real (Figura 2B).
3. Validación de la técnica de microelectrodos de ion selectivo
- Preparación de una fuente artificial
- Capilares de origen artificiales son los mismos capilares comoarriba. Heat tire el capilar usando un extractor de microelectrodo como en el paso 1.1.1.
- Rellene estos capilares con 200 l de una solución de NaCl, KCl 1 M, CaCl 2 2 H 2 O o tampón pH 4. Elija la solución fuente artificial en función del ion que se desea medir (véase la Tabla 1).
Nota: Como alternativa, tire de electrodos con mayor diámetro de la punta (~ 20 m) y la punta de relleno con las mismas soluciones, pero que contiene 0,5 a 1% de agarosa (agarosa evitará cualquier flujo mayor de solución). - Montar el capilar fuente artificial en un micromanipulador y sumergirlo en la solución utilizada para medir el flujo de los iones en las muestras. Deja la fuente artificial en la solución durante 30 min a 1 h para permitir la estabilización del gradiente.
- Validación de la microelectrodo selectivo de iones
- Sumerja el microelectrodo selectivo de iones alrededor de un centímetro de distancia de la fuente artificial capilar en la solución utilizada para Measure el flujo de iones en las muestras y cerrar el circuito con el electrodo de referencia como antes. Que el valor de la tensión se estabilice durante 1 a 3 min antes de grabar el voltaje correspondiente usando el software dedicado para 1 a 2 min. Este valor corresponde al valor del buffer (en la literatura también se refirió como referencia, el fondo o valor en blanco).
- Mueva el microelectrodo selectiva de iones a aproximadamente 5 micras de la fuente artificial y dejar que el valor de la tensión se estabilice durante 1 a 3 min antes de grabar el voltaje correspondiente utilizando el software durante 1 a 2 min.
- Repetir el procedimiento anterior colocando el microelectrodo selectivo de iones en 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 y 1280 m de distancia de la fuente capilar artificial.
- Extraer los datos como un archivo txt y copiar los valores en un archivo de hoja de cálculo.
- Calcular la concentración de iones correspondiente a los valores mV en la misma forma que para los valores de calibración. Trazar el valor.
Note: Si un flujo de iones está presente, el microelectrodo detecta una diferencia en la concentración de iones entre las dos posiciones (Figura 3B). Si la fuente artificial contiene más iones de la especie medidos de la solución, la concentración debe ser más alta cerca de la fuente de lejos, la validación de la capacidad de la microelectrodo selectiva de iones para detectar correctamente la dirección de un flujo de iones (en este caso eflujo; para un fregadero artificial, con la concentración de iones específica más baja que la medición de medio, debe ser afluencia).- Calcular el flujo de iones usando la ley de difusión de Fick: J = c μ (dc / dx) donde c es la concentración de iones en la solución (mol cm -3), μ es la movilidad de iones (mol cm N -1 s -1) , y DC es la diferencia de concentración a través de la distancia dx (cm) (Figura 2C). Datos de flujo de iones se presentan habitualmente en pmol cm -2 s-1 O -2 nmol cm seg -1.
Nota:.. Un método alternativo de cálculo de flujo de iones descrito por Smith et al 26 se puede utilizar. Principales diferencias incluyen el uso del coeficiente de difusión en lugar de la movilidad de iones y la resta del flujo de iones de fondo (también variación de la tensión o factor de corrección) calculada a partir de la medición del flujo de iones en solución salina sin muestra. - Trazar la media de los flujos de iones de cada paso en contra de la distancia de la fuente (Figura 2D). Alejándose de la fuente, observar una disminución exponencial del valor de flujo de la validación de la capacidad de la microelectrodo selectiva de iones para detectar diferente magnitud de los flujos de iones.
- Realice la validación fuente artificial una vez para cada ion específico destinado a ser grabada con el fin de validar sus mediciones de dirección y magnitud correctas con una gran relación señal-nrelación oise.
Nota: la medición de flujo de iones del tampón sin muestras indica el nivel o el ruido de fondo. Por lo general, la medición de amortiguación no muestra fluctuaciones clara de la concentración de iones conduce a muy pequeña de flujo que muestra las direcciones variables.
- Calcular el flujo de iones usando la ley de difusión de Fick: J = c μ (dc / dx) donde c es la concentración de iones en la solución (mol cm -3), μ es la movilidad de iones (mol cm N -1 s -1) , y DC es la diferencia de concentración a través de la distancia dx (cm) (Figura 2C). Datos de flujo de iones se presentan habitualmente en pmol cm -2 s-1 O -2 nmol cm seg -1.
4. Preparación de medición Cámara
Nota: Antes de los experimentos, considere la muestra a medir y cómo la muestra se va a montar y se inmoviliza para mediciones de microelectrodos.
- Para Xenopus laevis mediciones ovocitos cortar un cuadrado de 1 cm de una malla de nylon de 800 micras (malla Nitex) y péguelo en una placa Petri de plástico (Figura 1E).
5. Ion Flux Medición
- Medir la concentración de iones presente en el tampón usado para realizar las mediciones sobre la muestra de la misma manera que para la solución de calibración. X. ovocitos laevis requieren Ringer Modificado de Mark (MMR). Dissolve NaCl, KCl, CaCl, MgCl $ y HEPES en agua desionizada para alcanzar una concentración final de (mM): NaCl 100, KCl 2, CaCl 2, 1 de MgCl y 5 HEPES. Ajuste el pH del tampón a 7,5 utilizando NaOH.
- Coloque la muestra en la cámara de medición y llevar el microelectrodo selectiva de iones cerca de la muestra (aproximadamente 10 m de distancia) utilizando el microposicionador para definir la posición de cierre de la microelectrodo (Figura 3A).
- Iniciar la excursión de baja frecuencia (0,3 Hz) (100 m) de la microelectrodo entre la posición de cierre y una posición alejada de la muestra (distante) utilizando el software dedicado. Asegúrese de que el movimiento del microelectrodo es perpendicular a la superficie de la muestra.
Nota: La excursión del microelectrodo se puede establecer en el software. Gran excursión aumenta el gradiente de leer lo que permite una detección más fácil de pequeños flujos durante la medición, mientras que alarga el intervalo de muestreo y disminuye la resolución temporal. Ver- Inicie la grabación usando el software. El micro se detiene en cada posición y el potencial eléctrico en mV se registra en el equipo. Obtener mediciones durante al menos 2 min, lo que permite la estabilización de la señal. Para los experimentos de lapso de tiempo cortos, las variaciones posibles de registro en la posición de interés para todo el curso del tiempo.
- Extraer los datos como un archivo txt y copiar los valores en un archivo de hoja de cálculo.
- Calcular la concentración de iones correspondiente a los valores mV en la misma forma que para los valores de calibración. Trazar el valor.
Nota: Si un flujo de iones está presente, el microelectrodo detecta una diferencia en la concentración de iones entre las dos posiciones (Figura 3B).- Calcular el flujo de iones usando la ley de Fick de la difusión como antes (etapa 3.3.1).
- Repita la medición búfer antes de medir una nueva muestra y repita el procedimiento de medición de flujo y el cálculo para cada nuevomuestra.
6. Análisis Estadístico y Data Presentación
- Pon a prueba los efectos independientes de la posición y / o parte del tiempo en los flujos de iones bajo la condición de control utilizando un modelo ANCOVA con efectos mixtos 28.
Nota: análisis de covarianza (ANCOVA) es un modelo lineal general que mezcla ANOVA regular y regresión permitiendo medidas tanto categóricas y continuas para ser utilizados como variables independientes. Además, en presencia de errores correlacionados inducidas por medidas repetidas por efectos anidados individuales y eventuales, se utilizan modelos de efectos mixtos para modelar estimaciones precisas de ambos efectos fijos y aleatorios. - Calcula las comparaciones por pares utilizando la t de Student-test entre los niveles de grupo con la corrección de Bonferroni para múltiples pruebas 28.
- Generar diagramas de caja para resumir las mediciones de flujo de iones de acuerdo a la posición y el tiempo. Incluir los valores de p de la t de Student por pares descritaanteriormente (Figura 3D) e indican que los niveles de significación de los valores de p de la siguiente manera: *: p <0,05; **: P <0,01; ***: P <0,001 29
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Representative Results
Hemos demostrado anteriormente que la entrada de calcio aparece después de una sola célula hiriendo a 24. Por lo tanto, preguntamos si otros flujos de iones se producen en una sola herida celular. Utilizamos la X. laevis ovocito, un modelo bien establecido para celular herida única curación 30-34 y registro electrofisiológico 24,35-39. Curiosamente, los iones de potasio son más concentrada dentro de X. laevis (aproximadamente 110 mm) 40 que en la solución extracelular utilizado (en MMR 1x: 1 mM) lo que sugiere un flujo de salida de potasio sobre la herida. Con el fin de confirmar que hipótesis, que mide el flujo de potasio durante el curso de X. laevis celular del ovocito sanación membrana utilizando la autorreferencia microelectrodo selectivo de iones.
Para las heridas del ovocito, primero tire un electrodo capilar con un tamaño de la punta grande (~ 50 m). Conecte el electrodo a un porta electrodo recto y montar en un micro-posicionador manual. Heridas del oocyte al tocar la membrana con la punta del electrodo 24. Poco después de la herida se detectó un gran flujo de salida de potasio (hasta 250 nmol cm -2 seg -1; Figura 3B - D). Como la herida sanó membrana, este flujo disminuye, volviendo a valores no heridos de flujo visto en la membrana intacta (~ 5 nmol cm -2 seg -1) cuando la herida cicatrizada (hasta 16 min después de la herida; Figura 3B - D). ANCOVA reveló un efecto significativo de tiempo después de la herida en las mediciones de flujo de potasio (p <0,001). Post hoc análisis reveló significativamente mayor flujo de salida de potasio a 1-2 min (p <0,001) y en el 5-6 min (p <0,05), pero No en 15-16 minutos después de la herida en comparación con la condición membrana celular intacta (Figura 3D). Llegamos a la conclusión que al único heridas celular, un flujo de salida de potasio aparece a nivel de la herida que disminuyen dutocar el transcurso de la cicatrización.
| Ion | Cóctel ionóforo | Solución electrolítica (100 mM) | Solución de referencia (3 M) | Solución de código Artificial (1 M) |
| Ca 2+ | Calcio Ionóforo me Cóctel (cat # 21048) | CaCl 2 2H 2 O | KCl | CaCl 2 2H 2 O |
| Na + | Sodio Ionóforo II Cocktail A (cat # 71178) | NaCl | KCl | NaCl |
| Cl - | Cloruro Ionóforo me Cóctel (cat # 24902) | NaCl | CH 2 CO 2 K (potasio Acetato) | NaCl |
| K + | Potasio Ionóforo me Cóctel (cat # 60031) KCl | NaCl | KCl | |
| H + | Hidrógeno Ionóforo me Cóctel (cat # 95291) | pH 7,0 | KCl | pH 4,0 |
Tabla 1:. Ejemplos de cócteles ionóforos de uso común también se muestra son las soluciones adecuadas para colocar en los microelectrodos, para la fuente artificial y para llevar a cabo la calibración. Los números de catálogo son de Sigma-Aldrich.
Figura 1:. Microelectrodos selectivos de iones (A) Representación esquemática del sistema de microelectrodo de autorreferencia selectiva de iones. Microelectrodo (B) de ion selectivo. (C) electrodo de referencia. (D) El intercambio de iones entre la solución externa y la microelectrode a través de la ionóforo. (E) Esquema de la cámara de medición utilizado para X. laevis ovocito.
Figura 2: microelectrodos selectivos de iones de calibración, de origen artificial y cálculo de flujo (A) Curva de calibración.. (B) La ecuación de la curva de calibración y el cálculo de la concentración de iones. (C) Cálculo del flujo de iones. Flujo (D) Ion medido a distancias específicas de la fuente artificial (1 M KCl).
Figura 3: Evolución del flujo de potasio a X. laevis ovocito herida durante la curación. (A) Fotografía e ilustración de la excursióndel microelectrodo selectiva de iones medir la concentración de iones en X. laevis ovocito herida; la línea de puntos entre el '' a '' y '' V '' representa el eje animal-vegetal. (B) Ilustración de la variación de la concentración de ión potasio en X. laevis ovocito herida durante la curación. (C) Scatter (xy) gráfica que muestra la media y el error estándar de medición de flujo de potasio a nivel de la herida en el tiempo diferentes durante X. laevis ovocito curación de la herida. (D) Diagrama de caja que muestra la medición de flujo de potasio a nivel de la herida en el tiempo diferentes durante X. laevis ovocito heridas curativas (n = 16; p valores indicados de la siguiente manera: *: p <0,05; *** p <0,001).
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Discussion
Los pasos más críticos para la medición exitosa de los flujos de iones extracelulares in vivo son: la reducción del ruido, la fabricación correcta de los microelectrodos y referencia selectivos de iones del electrodo, y el posicionamiento de la muestra y ambos electrodos.
Con el fin de minimizar el ruido, el sistema de grabación debe estar en una puesta a tierra (puesta a tierra) jaula de Faraday preferiblemente con una mesa (aislamiento de vibraciones) de metal-rematada que también está conectado a tierra. Además, el chasis microscopio también debe estar conectado a tierra. Las fuentes de ruido eléctrico incluyen la fuente de luz. Una fuente de luz 'sin ventilador' de fibra óptica hace que el ruido eléctrico mínimo. Por último, mantener el hilo de plata y de pellets en el microelectrodo titulares clorada también minimiza el ruido (por inmersión en hipoclorito de sodio lejía y enjuague en dH 2 O) .La presencia de burbujas de aire en el microelectrodo selectivo de iones o en el electrodo de referencia dará lugar a la medida el fracaso como elconductividad de la microelectrodo será nula o comprometida. Por lo tanto, es crucial para verificar los electrodos bajo el microscopio antes de su montaje en los soportes. Ver el protocolo de procedimiento detallado para eliminar las burbujas de aire. El posicionamiento correcto tanto de la muestra y los microelectrodos se requiere con el fin de asegurar resultados fiables y reproducibles. La medición del flujo de iones depende de la excursión de la microelectrodo y su posición relativa a la muestra. Es importante identificar con precisión el área de interés, que se mide en la muestra y coloque el microelectrodo de tener un movimiento perpendicular de la muestra. Cualquier excursión de los microelectrodos de una manera que no es perpendicular a la muestra resultará en ion alterada flujos de mediciones y aumento de la variabilidad entre las muestras.
Cócteles ionóforo dedicados para medir iones específicos, por ejemplo de potasio, también pueden sentir la presencia de otros iones, tales como sodio.En el caso de que la solución de medición contiene una alta cantidad de un ion de competir por el ionóforo de cóctel, es importante para determinar la selectividad de la cóctel ionóforo utilizando el experimento fuente artificial. En este caso, la solución utilizada para la cultura X. ovocitos laevis (MMR) contiene una alta concentración de sodio. Por lo tanto, es importante evaluar si el cóctel ionóforo de potasio utilizado también detecta sodio. Al utilizar el microelectrodo cóctel ionóforo de potasio lleno, podemos tratar de medir un flujo de sodio utilizando una fuente artificial que contiene una alta concentración de sodio (1 M NaCl; véase la Tabla 1) manteniendo la misma solución de medición. El gradiente químico favorece el flujo de salida de sodio, pero idealmente hay flujo de sodio debe ser detectado por el cóctel ionóforo específico-potasio. Si se mide un flujo significativo, la condición experimental debe ser optimizado. Por ejemplo, la concentración del ion competir podría reducirse hasta el punto de la microelectrode no detecta más, si bien esto puede afectar el flujo de sodio a través de la membrana plasmática que lleva a posibles interferencias durante las mediciones de flujo de potasio. Idealmente, un factor de corrección calculado a partir del experimento fuente artificial puede ser aplicada a los datos, u otro cóctel ionóforo se puede probar. Flujo de iones mediciones utilizando el microelectrodo de autorreferencia selectivos de iones permiten la medición de los flujos de iones se producen en las células y tejidos en solución acuosa. Las mediciones de los flujos de iones en células o tejidos que normalmente están en contacto con un entorno de aire requiere la presencia de una solución que no está naturalmente presente en su entorno y que pueden alterar el flujo de iones y el intercambio que se produce bajo condiciones normales. Atención específica se tiene que hacer para definir el contenido de dicha solución y reducir al mínimo la desviación del entorno original, fisiológica. El espectro de iones que puede ser medido por las microele de autorreferencia selectivos de ionesctrode técnica depende de la disponibilidad y de la existencia de cócteles ionóforos específicos selectivos para el ión de interés.
Ion mediciones de flujo realizadas con la referencia a sí misma microelectrodo selectiva de iones se realiza en solución, por lo general cerca de la superficie de células o tejidos, permitiendo la medición no invasiva de los flujos de iones extracelulares. Este método no permite la medición de los flujos de iones dentro de los tejidos, entre la célula y el espacio intercelular. La autorreferencia microelectrodo selectivo de iones no es el único método que permite la medición de los flujos de iones en vivo. Un nuevo método alternativo utiliza reporteros bioelectricidad fluorescentes 41 que permite la medición de los flujos de iones que no son posibles utilizando microelectrodos. Estos colorantes permiten mediciones de iones flujos dentro de las células y tejidos, y pueden conseguir la localización subcelular. Esta técnica se puede adquirir información espacial del flujo de iones dentro de las células y tejidos, pero ex no iónicocambiar entre el tejido y el espacio extracelular. Por otra parte, los periodistas bioelectricidad fluorescentes suelen generar datos semi-cuantitativos. El uso de la tecnología basada en microelectrodos para medir los flujos de iones sigue siendo válida y necesaria y aporta información adicional para el uso de los reporteros fluorescentes bioelectricidad, haciéndolos complementarios y no técnicas en competencia. Además, interesantes desarrollos recientes incluyen detectores de autorreferencia amperométricos de oxígeno, óxido nítrico y los neurotransmisores dopamina y el glutamato 42,43. Detección amperométrica se basa en una reacción química en la punta del sensor. Microelectrodos nuevas de fibra óptica ("optrodes") se han desarrollado para medir de forma no invasiva el flujo de oxígeno metabólico 34,35 y pH 44 con alta selectividad y sensibilidad 45,46. Ahora hay también una sonda recubierta con nanopartículas a base de enzimas sensibles a la glucosa 47.
Hemos visto que ªe autorreferencia microelectrodo selectivo de iones permite realizar mediciones de flujos de iones extracelulares in vivo. Los iones no sólo se intercambian entre las células / tejidos y espacio extracelular, sino también entre las células y los tejidos dentro de los organismos vivos. Es importante combinar esta técnica con otros, tales como reporteros bioelectricidad fluorescentes con el fin de apreciar la resolución espacial de los flujos de iones dentro de los tejidos además de las medidas reales de los flujos de iones cerca de su superficie. Además, los flujos de iones representan una parte importante del estado bioeléctrica que define células y tejidos junto con el potencial de membrana celular, el potencial de trans-epitelios o corrientes eléctricas extracelulares. Es importante, además de la medición de los flujos de iones, para medir, en combinación, membrana celular y el potencial trans-epitelios así como corrientes eléctricas extracelulares 24.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IonAmp | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Headstage pre-amplifier | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| MicroStep Driver | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Manual micropositioner | World Precision Instruments | Model KITE-R | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | Model M10 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Vibration isolation table | Newport Inc. | Model VW-3036-OPT-023040 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces | Newport Inc. | Model 360-90 | Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table |
| Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | none |
| Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | none |
| Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament | World Precision Instruments | TW150-4 | none |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | none |
| Metal rack | Made in-house | none | Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel |
| Oven | QL | Model 10 Lab Oven | none |
| Silanization solution I | Sigma-Aldrich | 85126 | Hazardous, handle as recommended by provider |
| Glass Petri dish; Pyrex | Fisher Scientific | 316060 | none |
| Electrode/micropipette storage jar | World Precision Instruments | E215 | none |
| Glass dessicator | Fisher Scientific | 08-595E | Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight. |
| Plastic Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11597722 | none |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | S97329 | none |
| Microscope slide | Sigma-Aldrich | S8902 | none |
| Straight microelectrode holder | Warner Instruments | QSW-A15P | with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire |
| Straight microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH3S | with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector |
| 6 cm Petri dish | VWR | 60872-306 | none |
| Nitex mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX750 | none |
| Glue; Loctite epoxy | VWR | 500043-451 | Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing |
| Deionized water | Sigma-Aldrich | 99053 | none |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | none |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | none |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | none |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | none |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | none |
| Sodium Hydroxyde | Sigma-Aldrich | S8045 | none |
| Potassium Acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | none |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | none |
References
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