Abstract
Den akvatiske patogen, Streptococcus iniae, er ansvarlig for mere end 100 millioner dollars i årlige tab for akvakulturerhvervet og er i stand til at forårsage systemisk sygdom i både fisk og mennesker. En bedre forståelse af S. iniae sygdom patogenese kræver en passende model system. Den genetiske sporbarhed og optisk transparens af de tidlige udviklingsstadier af zebrafisk muliggør generering og ikke-invasiv billeddannelse af transgene linjer med fluorescerende mærkede immunceller. Det adaptive immunsystem er ikke fuldt funktionelt før adskillige uger efter befrugtning, men zebrafisk larver har et konserveret hvirveldyr medfødte immunsystem med både neutrofiler og makrofager. Således frembringelsen af en larve infektion model tillader studiet af specifikke bidrag medfødte immunitet kontrollere S. iniae infektion.
Webstedet for mikroinjektion vil afgøre, om en infektion ersystemisk eller oprindeligt lokaliseret. Her præsenterer vi vores protokoller for otisk vesikel injektion af zebrafisk alderen 2-3 dage efter befrugtningen og vores teknikker til fluorescerende konfokal billeddannelse af infektion. En lokaliseret infektion site giver observation af første mikrobe invasion, rekruttering af værtsceller og formidling af infektion. Vores resultater ved hjælp af zebrafisk larver model S. iniae infektion indikerer, at zebrafisk kan anvendes til at undersøge de forskellige bidrag værten neutrofiler og makrofager i lokaliserede bakterieinfektioner. Desuden beskriver vi, hvordan photolabeling af immunceller kan bruges til at spore individuel værtscelle skæbne under infektion.
Introduction
Streptococcus iniae er en stor akvatisk patogen, der er i stand til at forårsage systemisk sygdom i både fisk og mennesker 1. Mens S. iniae er ansvarlig for store tab i akvakulturerhvervet, er det også en potentiel zoonotisk patogen, der kan forårsage sygdom hos immunkompromitterede menneskelige værter med kliniske patologier ligner dem, der forårsages af andre streptokok humane patogener. På grund af sine ligheder med humane patogener, er det vigtigt at studere S. iniae sygdom patogenese i forbindelse med en naturlig vært. En voksen zebrafisk model af S. iniae infektion afslørede robust infiltration af værten leukocytter til det lokaliserede sted for infektion samt en hurtig tid til vært død, en tid for kort involvere det adaptive immunsystem 7. For at få en grundig se på svar på S. medfødte immunforsvar iniae infektion in vivo, er det nødvendigt at anvende en model, som er mere modtagelig for non-invasiv direkte billedvisning.
Larve zebrafisk har en række fordele, der gør det til et mere attraktivt hvirveldyr model til at studere vært-patogen interaktioner. Zebrafisk er relativt billige og nemme at bruge og vedligeholde i forhold til pattedyr modeller. Adaptive immunitet er ikke funktionelt modne indtil 4-6 uger efter befrugtningen, men larver har en højt konserveret hvirveldyr medfødte immunsystem med komplement, Toll-lignende receptorer, cytokiner og neutrofiler og makrofager med antimikrobielle egenskaber, herunder fagocytose og respiratorisk burst 2-6, 8-11. Derudover genetiske medgørlighed og optisk transparens af embryonale og larvestadier udvikling tillader generering af stabile transgene linjer med fluorescensmærkede immunceller gør det muligt at undersøge værtspatogene interaktioner i realtid in vivo. Frembringelsen af disse transgene linjer ved hjælp af en photoconvertible protein, såsom Dendra2 muliggør sporing af individuelle værtscelle oprindelse og skæbne i løbet af infektion 12.
Ved udvikling af en zebrafisk larver infektion model, vil det valgte sted for mikroinjektion afgøre, om en infektion er oprindeligt lokaliseret eller systemisk. Systemiske blod infektioner i halevenen eller Duct af Cuvier er mest almindeligt anvendte til at studere mikrobielle patogener i zebrafisk og er nyttige til at studere samspillet mellem vært og mikrobielle celler, cytokinresponser, og forskelle i virulens mellem patogene stammer. For langsommere voksende mikroorganismer, kan tidlig injektion i blommesækken af et embryon på 16-1,000 cellestadiet anvendes til at frembringe en systemisk infektion 13,14, med den optimale udviklingsstadiet for mikroinjektion af en langsomt voksende mikroorganisme fundet at være mellem den 16-128 cellestadiet 15. Men blommesækken injektioner af mange mikrober på senere stadier af vært udvikling tendens til at være dødelig til than vært på grund af den næringsrige miljø for mikrobe og manglende infiltrerende leukocytter 16-18.
En lokaliseret infektion normalt resulterer i rettet vandring af leukocytter i retning af infektionsstedet, der let kan kvantificeres med non-invasiv billeddannelse. Denne type infektion kan tillade dissektion af de mekanismer, der formidler leukocytmigration samt undersøgelse af forskellige vandrende og fagocytiske kapacitet af forskellige leukocytpopulationer. Lokaliserede infektioner er også nyttige i forbindelse med behandlingen forskelle i virulens mellem bakteriestammer samt studere mikrobe invasion mekanismer siden fysiske barrierer vært skal krydses for en lokaliseret infektion bliver systemisk. Zebrafisk typisk rejses ved temperaturer på 25-31 ° C 19, men de kan også holdes ved temperaturer så høje som 34-35 ° C til undersøgelser af invasiv visse humane patogener med strenge temperaturkravfor virulens 20, 21.
Mange forskellige steder er blevet anvendt til at generere en indledningsvis lokaliseret bakteriel infektion, herunder baghjerne ventrikel 22, dorsale hale muskel 18 perikardiehulrummet 23 og otisk vesikel (øre) 5, 16, 24. Det har imidlertid vist sig, at injektion af bakterier i halen muskel kan forårsage vævsskade og inflammation uafhængig af de bakterier, der kan forvrænge resultaterne, når de undersøger leukocyt reaktion 13. Selv mindre skade er forbundet med injektion i baghjerne og selv om det er i første omgang uden leukocytter hos unge embryoner, baghjerne ventrikel støt får mere immunceller over tid, da mikroglia tage ophold. Baghjerne ventrikel er også en mere vanskelig placering af billedet. Den otisk vesikel er et lukket hulrum uden direkte adgang til vaskulaturen 25, 26. Det er normalt uden leukocytes, men leukocytter kan rekrutteres til otisk vesikel som reaktion på inflammatoriske stimuli, såsom infektion. Det er også et foretrukket sted for mikroinjektion af bakterier i zebrafisk alderen 2-3 dage efter befrugtning (DPF) på grund af den lethed, billedbehandling og visualisering af injektionen. Derfor valgte vi otisk vesikel som vores hjemmeside af lokaliseret bakteriel infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voksne og embryonale zebrafisk blev opretholdt i overensstemmelse med University of Wisconsin-Madison Research Animal Resources Center.
1. Forberedelse Mikroinjektion Needles
- Forbered tynd væg glaskapillar kanyler (1,0 OD / 0,75 ID) ved hjælp af en mikropipette aftrækker enhed med følgende indstillinger: lufttryk 200, varme 502, træk 90, hastighed 80, tid 70, sendetid i starten af pull 5, sendetid i slutningen af pull 5.
- Med fin pincet brække spidsen af trukket nålen, så at spidsen åbning har en diameter på ca. 10 um.
2. Forberedelse Larval Injection Dishes
- Skyl en gel kam med bane bredde på ca. 4-5 mm i sterilt vand og lad det tørre.
- Forbered en 1,5-2% høj smelte agaroseopløsning i E3 medium 19 og mikrobølgeovn, indtil opløsningen er klar. Når afkølet, hæld nogle af agarose i en petriskål (100 x 15 mm) og hvirvel,tilsætte lige nok agarose til helt at dække bunden af skålen.
- Når agarose er størknet, anbringes skyllet og tørret gel kam på toppen, så at den ikke-kæmmede ende blot hviler på toppen af petriskålen og kæmmet ende rører agarose. Kontroller, at kammen er så vandret som muligt, hvilket skaber en 30 ° vinkel i forhold til bunden agarose lag.
- Hæld en yderligere lille mængde agarose ved grænsefladen mellem kammen og nederste agarose lag, således at den friske agarose lag dækker brøndene i kammen. Lad det køle helt af, før du fjerner kam. Ved hjælp af en pipette spids, fjern eventuelle overhængende stykker agarose fra brøndene.
- Hæld E3 medium på toppen af formen og butikken injektion ved 4 ° C.
- Før hver brug, erstatte med frisk medium og varm injektion ramper ved 28,5 ° C i mindst en time før injektion.
- Umiddelbart før injektioner erstatte E3 på injektion rampe medE3-medium indeholdende 200 ug / ml ethyl-3-aminobenzoat (tricaine).
3. Forberedelse S. iniae Inoculum
- Forbered og autoklaveres Todd Hewitt bouillon medium suppleret med 0,2% gærekstrakt og 2% proteosepepton (THY + P): 30 g / L Todd Hewitt, 2 g / L gærekstrakt, 20 g / L proteosepepton. For agarplader, tilsættes 14 g / L agar.
- Forbered bakteriekulturer natten før infektioner med pipettering en 100 ul prøve af frossen bakteriel lager i 10 ml THY + P bouillon i en forseglet 15 ml rør. Inkuber natten over uden omrøring ved 37 ° C. Efter 14-16 timers vækst, brug overnatskulturen enten at lagre fryseanlæg eller forberede til brug i injektioner.
- Lagre fryseanlæg ved at placere 1 ml af natten over kultur i 500 pi 80% glycerol i en 1,7 ml centrifugerør. For at undgå frysning-optøningscykler, gør 100 pi engangs alikvoter fra denne blanding og opbevares ved -80 ° C.
- For S. iniae anvendes infections fortyndes natten over kultur 1: 100 til et samlet volumen på 10 ml kultur ved tilsætning af 0,1 ml af natten over kultur til 9,9 ml THY + P bouillon. Vokse ved 37 ° C uden omrøring i ca. 4-5 timer. Overvåg den optiske densitet (OD) ved 600 nm ved hjælp af en NanoDrop spektrofotometer og høste bakterierne i midten af logaritmisk fase, hvor OD600 nm når ,250-,500. En OD600 nm på 0,250 svarer til ca. 10 8 kolonidannende enheder (CFU) / ml.
- Pellet 1 ml af bakteriekulturen i en 1,7 ml centrifugerør ved 1500 xg i 5 min. Resuspender i 1 ml frisk PBS og gentag. Mål OD600 nm af bakterierne i PBS, der pellet og resuspender i PBS opnå den ønskede koncentration.
- Til hjælp i visualiseringen af mikroinjektion tilføjer phenolrødt til bakterielle suspensioner før injektion til en slutkoncentration på 0,1%.
- For forsøg med injektion af varmedræbte bakterier, varme bakterier i PBS ved 95 ° C i 30 minutter.Bekræft, at varme-drab proces reduceret antallet af levedygtige bakterier til påviselige niveauer ved udpladning en injektion volumen (ca. 1 nl) på fast THY + P agarplader og inkubering natten over ved 37 ° C.
4. Mærkning S. INIA e med en CellTracker rødt fluorescerende farvestof
- For at mærke levende bakterieceller, forberede en stamopløsning af en CellTracker fluorescerende farvestof eller tilsvarende. Som farvestof anvendes kommer i 20 x 50 ug portioner af pulver og skal resuspenderes i DMSO tilsættes 7,3 pi DMSO til røret til opnåelse af en 10 mM stamopløsning koncentration.
- Test en række farvestofkoncentrationer (fx 0,5-25 uM) på bakterierne at bestemme den laveste optimale koncentration som farver cellerne. Hurtigt delende celler og længere forsøg kan kræve en højere koncentration af farvestof.
- Pellet 1,0 ml bakteriekultur i en 1,7 ml rør ved centrifugering som beskrevet ovenfor (afsnit 3). Pellet resuspenderes i 1i ml frisk PBS og tilsæt passende mængde farvestof til bakteriekulturen.
- Inkuber uden omrøring ved 37 ° C i 30 minutter. Spin ned bakterier og resuspender i 1 ml forvarmet THY + P bouillon og inkuberes uden omrøring i yderligere 30 minutter ved 37 ° C.
- Spin ned bakterierne og vask to gange i PBS, før måling af OD600 nm og fortynde bakterierne for mikroinjektion som beskrevet ovenfor (afsnit 3). Vi typisk injicere ca. 100 CFU i 1 nl injektion volumen for vores studier af leukocytrekruttering og fagocytose.
5. Fremstilling af zebrafisk Larver for Infektioner
- Opsætning ynglepar natten før og indsamle embryoner som beskrevet af Rosen et al. 27 Inkuber embryoner i E3 medium ved 28,5 ° C, indtil klar til at inficere.
- For zebrafisk, der vil blive afbildet, hindre udviklingen af pigment (melanin) ved tilsætning af N-phenylthiourinstof (PTU) tilE3 medium ved 24 timer efter befrugtning (HPF) til en slutkoncentration på 0,2 nM.
- Til infektioner, der involverer embryoer alderen 2 dpf, dechorionate embryoner manuelt med et par fine pincet. Alternativt dechorionate embryoner ved at fjerne E3 og udskiftning med pronase (2 mg / ml) i ca. 5 min, eller indtil forsigtig pipettering bryder embryoner ud af chorion. De fleste larver skulle have udklækket naturligt ved 3 dpf.
- Bedøver zebrafisk flere minutter før infektion ved at placere dechorionated larver i E3-medium indeholdende 200 ug / ml tricaine.
6. Otic Vesikel Injektion af S. iniae i Three Day Old Larver
- Tænd for mikroinjektor og indstil tidsintervallet til "millisekund". Åbn ventilen på kuldioxid tanken for at lade gas i linjen. Trykket i mikroinjektor læses ca. 20 PSI. Juster trykket i mikroinjektor enhed ved uret drejning af den sorte riflede knap for INCRlettet trykket eller mod uret drejning for nedsat tryk.
- Vortex forberedt S. iniae kultur i phenolrødt og PBS og bruge en microloader tip til at indlæse 2-3 pi af kulturen i en løftes kapillær kanyle.
- Monter indlæst nål på en mikromanipulator forbundet med en magnetisk stativ og anbring det under et stereomikroskop, så nålen er ca. 45-65 ° vinkel i forhold til bunden af mikroskopet.
- Tryk på fodpedalen for mikroinjektor at dispensere en dråbe af inoculum på spidsen af nålen. Mål diameteren af dråben med skalaen bar i okulær linse mikroskop.
- Alternativt estimerer diameter drop ved at injicere et volumen i en dråbe af mineralsk olie på en objektglas med en skala bar. Diameteren af dråben skal være ca. 0,10 mm, hvilket er ca. 1 nl volumen.
- Juster dråbe størrelse ved at justere varigheden indstillingenden mikroinjektor eller ved afklipning mere af nålespidsen med fine pincetter. Bemærk, at injektionen tid skal være mellem 20-35 ms at undgå at forårsage for meget vævsskade.
- Ved hjælp af en plast overførselspipette, overførsel 12 bedøvet larver i hver brønd i sprøjtestøbeformen.
- Brug en glasstav, hår sløjfe eller plastik tip til forsigtigt placere larver, så hovederne pegede mod bagsiden af mikroskopet og blommesække er imod den venstre side af brønden. Peg venstre øre af larve op mod loftet.
- Ser gennem okulær linse stereomikroskopet Brug knapperne på mikromanipulator at line op den fyldte nål med otisk vesikel så både er i samme synsfelt. Pierce det ydre epitel lag af otisk vesikel med nålespidsen, så nålen tip er lige inde i vesikel.
- Tryk på fodpedalen for at injicere 1 nl af den ønskede dosis af S. iniae. Sørg for at bruge enlav nok tryk for ikke at sprænge hulrummet. Hvis injektionen lykkes, otisk vesikel, men ikke det omgivende væv, bør fylde med phenolrødt inokulum (Figur 1 Ai). Fjern omgående enhver mis-injiceret fisk fra injektionspladen.
- Trække forsigtigt nålen ud af larve og flytte injektionen pladen med hånden, så at den næste larve er i betragtning. Gør dette under 5X forstørrelse.
Bemærk: tilbagetrækning af nålen kan resultere i aflejring af nogle bakterier uden for otisk vesikel, som kan forvrænge overlevelse og leukocytrekruttering resultater. For at undgå dette, anbefales det at injicere fluorescerende farvestof-mærkede bakterier og visuelt scanne injiceret larver under et fluorescensmikroskop for at fjerne eventuelle larver hvor dette er sket. En korrekt injiceret larve er vist i (figur 1 Bi). - For at sikre injektionsvolumen / inoculum forbliver den samme i løbet af eksperimentet, indsprøjte en dråbe af de bakterielle suspension i et 1,7 ml centrifugerør indeholdende 100 pi sterilt PBS efter hver 48 th embryo. Plade 100 pi på THY + P agarplader ved 37 ° C natten over for at bestemme CFU i injektionsvolumen.
- Når hele gruppe af 12 larver på injektionen rampen er blevet injiceret, omhyggeligt bruge en plastic overførselspipetten at fjerne larverne fra brøndene og placere dem i en ny petriskål (35 x 10 mm 2). Fjern tricaine løsning og erstatte med ca. 2 ml frisk E3 medium at give larverne at komme sig.
- Pipetter injiceret larver i enkelte brønde i en plade med 96 brønde og inkuber ved 28,5 ° C. Overvåg larver over tid for at overleve i disse plader eller fjerne senere for billedbehandling eller CFU tæller.
7. Sudan Black Farvning af neutrofiler
Bemærk: Følgende trin kan udføres ved stuetemperatur i en lille petriskål (35 x 10 mm 2) på en orbitalryster medmindre otherwise angivet. For hvert trin mængden af reagens, der anvendes, er ca. 2 ml pr skål, ved hjælp af lige nok væske til helt at dække larverne.
- For fiksering af inficeret larver, bruge et glas Pasteur pipette til at fjerne E3 medium og erstatte med en iskold 4% paraformaldehyd i PBS-opløsning. Sted umiddelbart fisken ved 4 ° C for at aflive. Fix natten over ved 4 ° C.
- Vask 3 gange i PBS i 5 minutter hver.
- Stain med Sudan Black (0,18% lager fortyndet 1: 5 i 70% ethanol, 0,1% phenol) i 30 minutter til 5 timer. Brug et stereomikroskop at kontrollere, om neutrofile granulat har taget op pletten.
- Udføre en række af 5 minutters vaske startende med en enkelt vask i 70% ethanol efterfulgt af en enkelt vask af en 1: 1-forhold mellem 70% ethanol og PBS, efterfulgt af en endelig vask i PBS.
- Rehydrér i PBS plus 0,1% Tween (PBT).
- Hvis du vil rydde pigment fra larverne, vask i 1% kaliumhydroxid / 1% hydrogenperoxid i ca. 6-10 min. Overvåg prøven closely og efter ca. 5 min, kontrollere larver under et stereomikroskop for at se, hvor meget af pigmentet er blokerede. Hvis opløsningen er tilbage på for længe, vil de blommesække svulme og brast.
- Vask 3 gange i 5 minutter hver i PBS.
- Opbevar prøverne i enten PBS eller PBT ved 4 ° C i op til 1 uge indtil klar til billede og tælle.
- Til billede Sudan Black-farvede larver, overføres fisken i PBT og derefter ind 80% glycerol og placere på et enkelt hulrum depression dias. Position fast larver under et stereomikroskop ved hjælp af en pipette spids. Billedet ved hjælp af en farve digitalt kamera på et stereomikroskop (Figur 1 Aii-IV).
8. Tælling af levedygtige bakterier fra inficerede Larver
- Aflive larver på de ønskede tidspunkter efter infektion i en iskold 200-300 mg / L opløsning af tricaine i E3-medium.
- Pipet aflivet larver i 1,7 ml centrifugerør. Fjern tricaine løsning og erstatte med 100 ul 0,2%Triton X-100 i PBS (PBSTx).
- Homogeniseres larver ved at passere op og ned 10 gange gennem en 27 G nål.
- Forbered seriefortyndinger af homogenater i sterilt PBS. For eksempel, hvis det infektiøse dosis er 100 CFU, pipette 100 pi af homogenatet i 900 pi sterilt PBS. Ved hjælp af en ny pipettespids, overføre 100 pi af den fortyndede homogenat i 900 pi sterilt PBS.
- Plate 100 pi af fortyndingerne på Columbia CNA agar til selektiv isolering af grampositive bakterier, og inkuberes ved 37 ° C i 48 timer. Dette medium giver større udvalg end THY + P agarplader, hvilket vil understøtte væksten af både gram-negative og gram-positive bakterier.
- På plader med færre end 500 individuelle kolonier, tælle antallet af kolonier og gange med fortyndingsfaktoren for at bestemme antallet af CFU.
9. Fiksering af larver for Imaging
- Fix larver i en iskold 4% paraformaldehyd i PBS-opløsning som debeskrevet i afsnit 7.
- Ved stuetemperatur, vaskes 3 gange i 5 minutter hver i PBS før billeddannelse.
10. Forberedelse af larver til Live Imaging
- Der fremstilles en 1,5% lav-smeltepunkt agarose opløsning i E3 ved opvarmning i mikrobølgeovn, indtil opløsningen er klar.
- Placer agaroseopløsning i en 55 ° C vandbad for at lade det cool, men ikke hærde.
- Tilføj tricaine til agarose til en slutkoncentration på 0,016%.
- Ved hjælp af en plastik overførsel pipette, sted 4-5 bedøvet larver i et glas bund fad på scenen af et stereomikroskop.
- Fjern tricaine og agarose løsning fra 55 ° C vandbad og lad den køle ved stuetemperatur i 1-2 min. Mens agarose afkøling fjerne så meget væske fra bedøvede larver som muligt.
- Hæld den afkølede agarose i skålen indtil omkring halvdelen af overfladen er dækket. Swirl fadet at sprede agarose. Bemærk, at hvis agaroseer for varmt, vil det dræbe larverne. Også, hvis der tilsættes for meget agarose i skålen, kan objektivlinsen af mikroskopet ramte bunden af skålen, når der fokuseres gennem agarose.
- Ved hjælp af en overførsel pipette, afhente larverne, der har flød til siderne af skålen og pipetteres dem tilbage ind til centrum.
- Under stereomikroskop, forsigtigt placere larver som ønsket med et hår sløjfe, en lang pipettespids eller en glasstav. For billeddannelse af otiske vesikel, placere larver så venstre otisk vesikel er fladt mod bunden af skålen.
- Lad agarose køligt i ca. 10 min, før du flytter skålen. Larverne kan skifte positioner, hvis agarose er ikke fast. Forsigtigt pipetteres nogle tricaine og E3 opløsning til toppen af agarose lag for at holde den fugtig.
11. Konfokal Imaging af infektion
- Placer glasbund skål med larver på scenen af et omvendt mikroskop med en FV-1000 laser scanning confocal system.
- Sæt pinhole til 200-300 um og ved hjælp af en numerisk blænde 0,75 / 20X objektiv, sæt z-stakke med 3-6 um skiver.
- Anvende kontinuerlig linieskanning at justere lasereffekt og detektor forstærkning for hver kanal.
- Brug af sekventiel line scanning for hver fluorescens kanal (f.eks 488 og 543 nm) og kontrast differential interferens (DIC), foretage en tidsforskydning film af den venstre otisk vesikel hver 3 min til 2-6 timer at observere ansættelsen og fagocytose af neutrofiler og makrofager. Ved længere tidsforløb, placere et låg på petriskålen for at forhindre fordampning og udtørring af agarose.
- Acquire stillbilleder af fast (figur 1B), eller lever (figur 2) larver på 20X eller 40X forstørrelse.
12. fotoomdannelse af Dendra2-mærkede leukocytter på Otic Vesikel
Bemærk: Dendra2 kan photoconverted fra grøn til rød fluorescensved at fokusere en 405 nm laser (50-70% lasereffekt bør være tilstrækkeligt) på regionen af interesse (ROI) i 1 min. Nedenfor er trin-for-trin-protokollen anvendes til FV-1000 laser scanning konfokal systemet:
- Visualiser prøven ved hjælp af en z-stak scanning med 488 nm og 543 nm lasere. Brug kontinuerlig linje scanning til at justere laser magt og detektor gevinst. Kontroller, at der ikke er nogen uheld photoconverted rød fluorescens.
- På "Image Acquisition Control" vinduet under "Stimulus Setting" vælge "Brug Scanner" værktøj og vælg "main". Vælg 405 nm laser og sæt den til 70% effekt. Brug cirklen mulighed, definerer ROI i otisk vesikel.
- Under "Stimulus Start Setting" vælge "Aktivering i serien" med en præaktivering på 1 ramme og en aktivering på cirka 60.000 ms. På "Acquisition Setting" vinduet under "Time Scan overskriften", vælge 2 iintervaller på 00:01:00 (en for præ- og en for post fotoomdannelse).
Bemærk: Når tidsforskydningen serien scanningen er fuldført, skal Dendra2 have været photoconverted til sin røde fluorescerende tilstand. - Scan prøven ved en z-stak ved hjælp af 488 nm og 543 nm lasere til at visualisere photoconverted rød fluorescens samt enhver resterende grøn fluorescens (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroinjektion af S. iniae til otisk vesikel (figur 1 og figur 2) resulterer i en indledningsvis lokaliseret vært respons. Når det injiceres korrekt, bør bakterierne kun ses i otisk vesikel og ikke i det omgivende væv eller blod. Dette kan visualiseres under mikroinjektion anvendelse af phenol rødt farvestof (figur 1A). Alternativt, hvis mærkede bakterier injiceres, en hurtig scanning af inficerede larver straks efter injektion kan bekræfte bakterierne er kun i den otisk vesikel og ikke det omgivende væv (figur 1B). Selv en dosis så lidt som 10 CFU vildtype S. iniae er i stand til at etablere en dødelig infektion inden for 24-48 timer efter infektion (HPI) injektion af 1000 CFU af en avirulent stamme, CPSA, ikke resulterer i dødelig infektion, og at stammen synes i stand til at formere sig i værten 24. Således er denne lokaliseret infektion model er i stand til differentiate mellem bakteriestammer af ændret virulens.
Mikroinjektion steder oprindeligt lokaliseret infektion er anvendelige til at studere leukocyt-kemotaxi. Leukocytrekruttering kan ved kvantificeres ved enten Sudan Black-farvning af neutrofile granula (figur 1A) eller formaldehyd fiksering af fluorescerende transgene linier (figur 1b). For at visualisere rekruttering og fagocytiske kapacitet immunceller, vi brugte transgene linjer, der udtrykker grønt fluorescerende protein Dendra2 specifikt i makrofager Tg (MPEG1: dendra2) 24 eller neutrofiler Tg (MPX: dendra2) 12. Da S. iniae injiceres i otisk vesikel 3 dpf larver er både neutrofiler og makrofager hurtigt rekrutteret inden for de første 2 hpi (figur 1). Men når udføres korrekt, mikroinjektion af PBS til otisk vesikel ikke resulterer i den samme robuste rekruttering af værten leukocytter (
Figur 2: fagocytose af S. iniae af fagocytter i otisk vesikel Transgen MPX:. dendra2 (A) eller MPEG1: dendra2 (B) larve inficeret med rød-mærket S. iniae (afbildet i magenta) og afbildet ved 60 min efter infektion ved hjælp af en laser scanning konfokalt mikroskop. Scale bar, 30 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3: fotoomdannelse af makrofager ved otisk vesikel 5 hpi med S. iniae. makrofager (afbildet i grøn) ved otisk vesikel, der er udpeget af cirklen (A) blev photoconverted (B) under anvendelse af en 405 nm laser på et konfokalt mikroskop og spores over tid. Af 24 HPI, photoconverted makrofager (afbildet i magenta) er migreret så langt som stammen / caudale hæmatopoietisk væv (C); skala bar, 50 um. Højere forstørrelser af boxed regioner i C er vist i (i) og (ii), Målestokken 30 um; pile peger på photoconkonverterede makrofager. Photoconverted celler forekommer hvide på grund af den fusionerede 543 nm rød fluorescens og eventuelt resterende 488 nm grøn fluorescens. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Infektionen fremgangsmåden anvendt her er nyttig til undersøgelse af værtens immunrespons på en indledningsvis lokaliseret infektion i 2-3 DPF embryoner og larver. Fokus af en inflammatorisk stimulus, såsom infektion, i et lukket hulrum, såsom otisk vesikel muliggør studiet af neutrofile og makrofag kemotaxi og fagocytose. En advarsel injicere bakterier i otisk vesikel er, at evnen af neutrofiler til effektivt fagocytere bakterier i væskefyldte hulrum kan være afhængig af den særlige mikrobe. Selv Escherichia coli og Bacillus subtilis ikke er let fagocyteres af neutrofiler i otisk vesikel 28, har vi fundet, at neutrofiler kan fagocytere både Pseudomonas aeruginosa og S. iniae i denne placering 16, 24. Lokaliseret infektion er også nyttig, når man studerer invasivitet af forskellige patogener. For at forårsage en systemisk infektion følgende Injection ind i en lukket hulrum som f.eks otisk vesikel skal mikrobe kunne krydse fysiske barrierer værten. Alternativt kan forskellige patogener afhængige værtsceller til transport og udbredelse fra den oprindelige sted for infektion. Dette gør lokaliserede injektioner er anvendelige til sammenligning af stammer af ændret virulens.
Under mikroinjektion, for at undgå bakterier afregning og tilstopning af nålen ændre nåle enten efter hver tilstand eller efter omkring 50 larver. Dette vil bidrage til at sikre suspension i nålen er mere ensartet. Hvis bundfældning af bakterier i nålen synes at være et problem, en blanding af PBS, 2% PVP40 og 10% glycerol kan hjælpe med at holde en homogen suspension. For at sikre, at hver larve bliver injiceret med omtrent samme antal bakterier, kontrollere CFU tællinger ved homogenisering en larve umiddelbart efter injektion og udpladning homogenatet på CNA agar. CNA agar vil selektere for væksten af dyrkbare grampositive bakterier, ikke kunS. iniae, men det vil give en idé om, hvordan konsekvent doser af injektion er mellem hver enkelt larve. Med et mål inokulum på 100 CFU pr larve, der typisk mellem 75-150 kolonier på en CNA plade. Antallet af ikke-S. iniae gram-positive kolonier, der vokser på en CNA plade er sandsynligvis meget lavt, da de fleste PBS injiceret fisk resulterer sædvanligvis mellem 0-20 kolonier. På senere tidspunkter i løbet af infektion, er det ikke ualmindeligt, at der er variation på op til en halv log i kolonitællinger mellem larver inficeret med den samme infektionsdosis. Dette kunne repræsentere små forskelle mellem de enkelte larve i deres evne til at kontrollere infektionen eller kan afspejle forskelle i mængden af dyrkbare grampositive bakterier i larver eller E3-medium.
Mens injektion i otisk vesikel, er det vigtigt ikke at injicere for store eller med for højt tryk, da dette kan medføre, at hulrummet til at briste. Injektionsvolumener shoULD holdes på ca. 1 nl. Hvis nålen er for stor, kan mikroinjektion forårsage skader på det omgivende væv, hvilket kan påvirke rekrutteringen af værten leukocytter til stedet for infektion eller kan tillade bakterier at sive ud af otiske vesikel. Det er også vigtigt at bekræfte injektion i den korrekte plads. Hvis nålen er indsat for dybt, kan det stikke gennem otisk vesikel eller det kan ramme blodkar flyder omkring otisk vesikel. Dette kan føre til aflejring af bakterier i blodet eller uden vesiklen, hvilket kan ændre værtsresponser.
Det er også muligt, at når nålen ekstraheres, nogle bakterier kan utilsigtet deponeres uden otisk vesikel som vist ved Colucci-Guyon et al. 28, men vi finder dette kun være tilfældet i mindre end 5% af injektionerne. Forsøger at injicere ind i centrum af den otisk vesikel kan man måske undgå denne situation. I et vellykket infektion skal otiske vesikel fylde wed phenol rødt farvestof, men farvestoffet bør ikke sive ud i det omgivende væv. Enhver mis-injicerede larver skal straks kasseres. Injektion mærkede bakterier er en nyttig måde at bekræfte en vellykket injektion (figur 1B). En af ulemperne ved at anvende en CellTracker farvestof er, at dette farvestof bliver fortyndet som bakterierne dele, til sidst forhindrer bakterierne i at blive visualiseret under fluorescens. Vi valgte en rød farve, fordi vi brugte grøn-mærket neutrofil og makrofag transgene linjer for de fleste af vores undersøgelser.
Dendra2 er en photoconvertible protein fra octocoral Dendronephthya sp. som kan photoconverted fra en grøn til en rød fluorescerende stat med en 405 nm laser 29. Denne fotoomdannelse er en non-invasiv måde at markere celler og spore deres skæbne i løbet af infektion. Leukocytter rekrutteret til stedet for infektion kan photoconverted og følges over tid for at overvåge deres dissemination hele værtsvæv (figur 3). Alternativt kunne leukocytter være photoconverted før infektion og overvåges efter mikroinjektion at bestemme oprindelsen af celler rekrutteret til stedet for infektion. Mærkning bakterier og immunceller muliggør studiet af leukocyt-patogen vekselvirkninger in vivo, herunder rekruttering og fagocytose (figur 1B og figur 2). Skelne røde mærket S. iniae fra den røde fluorescens af en photoconverted leukocyt er vanskelig, så en anden fluorescerende CellTracker farvestof kunne anvendes. Dette ville være særligt nyttigt at afgøre, hvilken af de photoconverted immunceller, der forlader otisk vesikel indeholder S. iniae.
Fremtidige anvendelser af otisk vesikel infektion metode kunne omfatte at måle hastigheden og retningsbestemmelse hvorved neutrofiler og makrofager flytter som svar på forskellige infektioner. Infektionen Kinetics kan også undersøgt for at se, hvilke celletyper er de første til at ankomme til et sted for infektion, og som celletyper er mest robust rekrutteret ud over hvor cellerne stammer, eller hvor de formidler 30. Ud over at studere rekruttering til en indledningsvis lokaliseret infektion, kan denne infektion model anvendes til at studere funktionen af værtens immunsystem komponenter under indledende infektion. Antisense morpholino oligonukleotider, som er målrettet mod specifikke RNA'er kan anvendes til at vælte ekspression af værtsimmunsystemer komponenter, herunder toll-lignende receptorer, cytokinreceptorer og leukocytter og CRISPR-Cas eller talen teknologi kan anvendes til at skabe genetiske mutanter. Genekspression hjælp RNAseq eller qPCR kan også anvendes til at karakterisere ekspressionen af visse værtsgener som reaktion på infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke lab medlemmer for zebrafisk pleje og vedligeholdelse. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health, National Research Service Award A155397 til EA Harvie og NIH R01GM074827 til Anna Huttenlocher.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml Eppendorfs | MidSci | AVSS1700 | |
| 14 ml Falcon tube | BD Falcon | 352059 | |
| 27 G x ½ in. needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 96-well Plate | Corning Incorporated | 3596 | |
| Agar | BD Biosciences | 214030 | |
| CellTracker Red | Molecular Probes, Invitrogen | C34552 | |
| CNA agar | Dot Scientific, Inc | 7126A | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-7m | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Ethanol 200 proof | MDS | 2292 | |
| Fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gel comb | VWR | 27372-482 | 4.2 mm width, 1.5 mm thick |
| Glass bottom dishes | Custom made by drilling a 16 - 18 mm hole in the center of a 35 mm tissue culture dish bottom and placing a 22 mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light. | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| High melt agarose | Denville Scientific, Inc. | CA3510-6 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | with FV-1000 system | |
| Low melt agarose | Fisher | BP165-25 | |
| Magnetic stand | Tritech (Narishige) | GJ-1 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipet tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | Tritech (Narishige) | M-152 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Nanodrop spectrophotmeter | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 100 x 15 mm |
| Phenol | Sigma Aldrich | P-4557 | |
| Phenol Red | Ricca Chemoical Company | 572516 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Potassium hydroxide | Sigma Aldrich | P-6310 | |
| Pronase | Roche | 165921 | |
| Protease peptone | Fluka Biochemika | 29185 | |
| Small cell culture dish | Corning Incorporated | 430165 | 35 x 10 mm |
| Sudan Black | Sigma Aldrich | S2380 | |
| Thin wall glass capillary injection needles | World Precision Instruments, Inc. | TW100-3 | |
| Todd Hewitt | Sigma Aldrich/Fluka Analytical | T1438 | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | Argent Chemical Laboratory/Finquel | C-FINQ-UE-100G | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast extract | Fluka Biochemika | 92144 |
References
- Agnew, W., Barnes, A. C. Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination. Vet. Microbiol. 122 (1-2), 1-15 (2007).
- Danilova, N., Steiner, L. A. B cells develop in the zebrafish pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13711-13716 (2002).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Willett, C. E., Cortes, A., Zuasti, A., Zapata, A. Early Hematopoiesis and Developing Lymphoid Organs in the Zebrafish. Dev. Dyn. 214, 323-336 (1999).
- Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
- Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development(Cambridge, England). 126 (17), 3735-3745 (1999).
- Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. G. Streptococcus-Zebrafish Model of Bacterial Pathogenesis. Infect. Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).
- Jault, C., Pichon, L., Chluba, J. Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in Danio rerio. Mol. Immunol. 40 (11), 759-771 (2004).
- Meijer, A. H., et al. Expression analysis of the Toll-like receptor and TIR domain adaptor families of zebrafish. Mol. immunol. 40 (11), 773-783 (2004).
- Seeger, A., Mayer, W. E., Klein, J. A Complement Factor B-Like cDNA clone from the Zebrafish (Brachydanio rerio). Mol. immunol. 33, 511-520 (1996).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J. Immunol. Methods. 292 (1-2), 119-129 (2004).
- Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J. Leukoc. Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. , 1-9 (2012).
- Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS ONE. 6 (2), e16779 (2011).
- Veneman, W. J., Marín-Juez, R., et al. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury. Cell. Microbiol. , (2012).
- Sar, A. M., et al. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell. Microbiol. 5 (9), 601-611 (2003).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S Inhibits Neutrophil Recruitment during the Early Stages of Streptococcus pyogenes Infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. New York, NY. (2002).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (9), 139-151 (2006).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 5 (12), e1000697 (2009).
- Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae. Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).
- Haddon, C., Lewis, J. Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
- Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -Y., Phillips, B. Development of the zebrafish inner ear. Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
- Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
- Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).
