Abstract
L'agente patogeno acquatica, Streptococcus iniae, è responsabile di oltre 100 milioni di dollari di perdite annuali per il settore dell'acquacoltura ed è in grado di causare la malattia sistemica sia di pesce e gli esseri umani. Una migliore comprensione del S. malattia iniae patogenesi richiede un sistema di modello appropriato. La trattabilità genetica e la trasparenza ottica delle prime fasi di sviluppo di zebrafish permettono la generazione e non invasiva di imaging di linee transgeniche con fluorescente contrassegnati cellule immunitarie. Il sistema immunitario adattativo, non è pienamente funzionale fino a qualche settimane dopo la fecondazione, ma larve di pesce zebra hanno un sistema immunitario innato vertebrati conservati sia con neutrofili e macrofagi. Così, la generazione di un modello di infezione larvale consente lo studio del contributo specifico di immunità innata nel controllo S. infezione iniae.
Il sito di microiniezione determinerà se l'infezione èsistemica o inizialmente localizzato. Qui, vi presentiamo i nostri protocolli di iniezione vescicola otica di zebrafish età 2-3 giorni dopo la fecondazione e le nostre tecniche per l'imaging confocale a fluorescenza di infezione. Un sito di infezione localizzata permette l'osservazione di invasione microbo iniziale, reclutamento di cellule ospiti e la diffusione di infezioni. I nostri risultati utilizzando il modello larvale zebrafish di S. infezione iniae indicano che zebrafish può essere utilizzato per esaminare i contributi diversi di neutrofili e macrofagi ospitanti in infezioni batteriche localizzate. Inoltre, viene descritto come photolabeling di cellule immunitarie possono essere utilizzati per monitorare il destino della cellula ospite individuale nel corso di infezione.
Introduction
Streptococcus iniae è un importante agente patogeno acquatica che è in grado di causare una malattia sistemica, sia di pesce e gli esseri umani 1. Mentre S. iniae è responsabile per le grandi perdite nel settore dell'acquacoltura, è anche un potenziale patogeno zoonotico, in grado di causare malattie in ospiti umani immunocompromessi con patologie cliniche simili a quelli causati da altri agenti patogeni umani streptococco. Date le sue somiglianze con agenti patogeni umani, è importante studiare S. malattia iniae patogenesi nel contesto di un ospite naturale. Un modello zebrafish adulto di S. infezione iniae rivelato robusto infiltrazione di leucociti host al sito di infezione localizzata nonché un rapido time per ospitare la morte, un tempo troppo breve per coinvolge il sistema immunitario adattativo 7. Al fine di ottenere uno sguardo approfondito nella risposta immunitaria innata di S. iniae infezione in vivo, è necessario utilizzare un modello che è più suscettibile di non-invasive immagini dal vivo.
Il pesce zebra larvale ha una serie di vantaggi che lo rendono un modello vertebrato sempre più interessante per lo studio delle interazioni ospite-patogeno. Zebrafish sono relativamente economico e facile da usare e mantenere rispetto ai modelli di mammifero. Immunità adattativa non è funzionalmente maturo fino 4-6 settimane dopo la fecondazione, ma larve hanno un sistema immunitario innato vertebrati altamente conservata con complemento, recettori Toll-like, citochine e dei neutrofili e macrofagi con capacità antimicrobiche tra cui la fagocitosi e burst respiratorio 2-6, 8-11. Inoltre, la trattabilità genetica e trasparenza ottica delle fasi embrionali e larvali di sviluppo consentono la generazione di linee transgeniche stabili con cellule immunitarie fluorescente rendendo possibile esaminare interazioni ospite-patogeno in tempo reale in vivo. La generazione di queste linee transgeniche utilizzando una proteina fotoconvertibile come Dendra2 consente il tracciamento di origine della cellula ospite individuale e destino nel corso di infezione 12.
Nello sviluppo di un modello di infezione larvale zebrafish, il sito scelto di microiniezione determinerà se l'infezione è localizzata inizialmente o sistemica. Infezioni del sangue sistemiche nella vena caudale o condotto di Cuvier sono più comunemente utilizzati per studiare patogeni microbici in zebrafish e sono utili per lo studio delle interazioni tra ospite e cellule microbiche, risposte citochine, e le differenze nella virulenza tra i ceppi patogeni. Per la crescita di microorganismi lenti, iniezione presto nel sacco vitellino di un embrione allo stadio 16-1,000 cella può essere utilizzato per generare una infezione sistemica 13,14, con lo stadio di sviluppo ottimale per microiniezione di un microrganismo a crescita lenta trovato essere tra la fase di 16-128 cellule 15. Tuttavia, tuorlo iniezioni sac di molti microbi nelle fasi successive di sviluppo accoglienza tendono ad essere letale per tegli ospitare dovuto l'ambiente ricco di sostanze nutritive per il microbo e la mancanza di infiltrazione leucociti 16-18.
Una infezione localizzata di solito si traduce nella migrazione dei leucociti diretto verso il sito di infezione che possono essere facilmente quantificata con imaging non invasivo. Questo tipo di infezione può permettere per la dissezione dei meccanismi che mediano la migrazione dei leucociti, nonché le ricerche delle diverse capacità migratorie e fagocitosi delle diverse popolazioni di leucociti. Infezioni localizzate sono utili anche quando si esaminano le differenze di virulenza tra ceppi batterici oltre a studiare i meccanismi di invasione dal microbo barriere host fisici devono essere attraversate per una infezione localizzata di diventare sistemica. Zebrafish sono tipicamente sollevato a temperature di 25-31 ° C 19, ma possono anche essere mantenuto a temperature di 34-35 ° C per studi di invasività di alcuni agenti patogeni umani con requisiti di temperatura severiper la virulenza 20, 21.
Molti siti differenti sono stati utilizzati per generare un'infezione batterica inizialmente localizzata compresa ventricolo hindbrain 22, dorsale coda muscolare 18, pericardio cavità 23, e vescicole otica (orecchio) 5, 16, 24. Tuttavia, si è trovato che l'iniezione di batteri nel muscolo coda può causare danni ai tessuti e infiammazione indipendente dei batteri, che possono alterare i risultati in cui si esamina risposta leucocitaria 13. Anche se meno danno è associato iniezione nel romboencefalo e anche se inizialmente privo di leucociti nei giovani embrioni, il ventricolo hindbrain guadagna costantemente più cellule immunitarie nel tempo microglia prendono la residenza. Il ventricolo rombencefalo è anche una posizione più difficile da immagine. La vescicola otica è una cavità chiusa senza accesso diretto alla vascolarizzazione 25, 26. Normalmente è privo di leukocytes, ma leucociti possono essere reclutati per vescicola otica in risposta a stimoli infiammatori come l'infezione. E 'anche un sito preferito per microiniezione di batteri in zebrafish età 2-3 giorni dopo la fecondazione (dpf) a causa della facilità di imaging e la visualizzazione di iniezione. Pertanto, abbiamo scelto la vescicola otica come il nostro sito di infezione batterica localizzata.
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Protocol
Adulto che embrionale zebrafish sono stati mantenuti in conformità con la University of Wisconsin-Madison Research Resources Animal Center.
1. Preparazione microiniezione Needles
- Preparare parete sottile aghi da iniezione capillare di vetro (1,0 OD / 0.75 ID) utilizzando un dispositivo micropipetta estrattore con le seguenti impostazioni: pressione dell'aria 200, 502 calore, tirare 90, velocità 80, ora 70, tempo di aria all'inizio del tiro 5, tempo di aria alla fine del tiro 5.
- Usando pinzette sottili, rompere la punta dell'ago tirato in modo che l'apertura punta ha un diametro di circa 10 micron.
2. Preparare piatti iniezione larvali
- Risciacquare un pettine gel con larghezza della corsia di circa 4-5 mm in acqua sterile e lasciare asciugare.
- Preparare una soluzione di agarosio alta fusione 1,5-2% in E3 medio 19 e forno a microonde fino a quando la soluzione è limpida. Una volta raffreddato, versare alcuni dei agarosio in una capsula Petri (100 x 15 mm) e turbine,aggiungendo abbastanza agarosio per coprire completamente il fondo del piatto.
- Una volta che lo strato di agarosio si è solidificato, posizionare il pettine gel sciacquato e asciugato sopra in modo che l'estremità non pettinato è solo riposo sulla parte superiore della piastra di Petri e l'estremità pettinato tocca l'agarosio. Assicurarsi che il pettine è più orizzontale possibile, creando un angolo di 30 ° rispetto allo strato inferiore agarosio.
- Versare una piccola quantità supplementare di agarosio all'interfaccia tra il pettine e lo strato di agarosio basso in modo che lo strato fresco agarosio copre i pozzetti del pettine. Lasciare raffreddare completamente prima di rimuovere il pettine. Usando un puntale, rimuovere eventuali pezzi sovrastanti agarosio dai pozzi.
- Versare E3 medio sulla parte superiore dello stampo di iniezione e conservare a 4 ° C.
- Prima di ogni utilizzo, sostituire con medi e iniezione caldo freschi rampe a 28,5 ° C per almeno un'ora prima dell'iniezione.
- Immediatamente prima iniezioni, sostituire la E3 sulla rampa di iniezione conE3 mezzo contenente 200 mg / ml di etile 3 amminobenzoato (tricaine).
3. Preparare S. iniae inoculo
- Preparare e autoclave Todd Hewitt brodo supplementato con 0,2% di estratto di lievito e 2% peptone proteoso (THY + P): 30 g / L Todd Hewitt, 2 g / L di estratto di lievito, 20 g / L proteoso peptone. Per piastre di agar, aggiungere 14 g / L di agar.
- Preparare colture batteriche la notte prima di infezioni da pipettando un'aliquota di 100 ml di ghiacciato stock batterica in 10 ml di THY + P brodo in un tubo sigillato 15 ml. Incubare per una notte senza agitazione a 37 ° C. Dopo 14-16 ore di crescita, usare la cultura durante la notte o per fare le scorte freezer o preparare per l'uso in iniezioni.
- Effettuare scorte congelatore ponendo 1 ml di coltura durante la notte in 500 ml di 80% glicerolo in una provetta 1,7 ml centrifuga. Per evitare cicli di gelo-disgelo, fare 100 microlitri un uso aliquote da questo mix e conservare a -80 ° C.
- Per S. iniae utilizzato in infections, diluire la cultura durante la notte 1: 100 per un volume totale di 10 ml cultura aggiungendo 0,1 ml di cultura durante la notte per 9,9 ml di THY + P brodo. Coltivare a 37 ° C senza agitazione per circa 4-5 ore. Monitorare la densità ottica (OD) a 600 nm utilizzando uno spettrofotometro Nanodrop e raccogliere i batteri in fase logaritmica metà quando la OD600 nm raggiunge ,250-,500. Un OD600 nm di 0,250 corrisponde a circa 10 8 unità formanti colonie (CFU) / ml.
- Pellet 1 ml della coltura batterica in una provetta 1,7 ml centrifugare a 1500 xg per 5 min. Risospendere in 1 ml di PBS fresco e ripetere. Misurare la nm OD600 dei batteri in PBS, pellet, e risospendere in PBS per ottenere la concentrazione desiderata.
- Per facilitare la visualizzazione di microiniezione, aggiungere rosso per le sospensioni batteriche fenolo prima dell'iniezione per una concentrazione finale di 0,1%.
- Per esperimenti di iniezione di batteri uccisi col calore, riscaldare i batteri in PBS a 95 ° C per 30 min.Verificare che il processo di abbattimento del calore ridotto il numero di batteri vitali a livelli non rilevabili da una placcatura volume di iniezione (circa 1 nl) sul THY solido + P piastre di agar e incubazione per una notte a 37 ° C.
4. Etichettatura S. INIA e con un CellTracker Red Fluorescent Dye
- Per etichettare viventi cellule batteriche, preparare una soluzione madre di un colorante fluorescente CellTracker o equivalente. Poiché il colorante usato viene in 20 x 50 ug aliquote di polvere e deve essere risospeso in DMSO, aggiungere 7,3 microlitri DMSO al tubo per ottenere una concentrazione di 10 mM magazzino.
- Testare un intervallo di concentrazioni di colorante (ad esempio, 0,5-25 um) sui batteri per determinare la concentrazione minima ottimale che colora le cellule. Cellule in rapida divisione e gli esperimenti più lunghi possono richiedere una maggiore concentrazione di colorante.
- Pellet 1,0 ml di coltura batterica in una provetta 1,7 ml per centrifugazione come descritto in precedenza (sezione 3). Risospendere il pellet in 1ml PBS fresco e aggiungere il giusto volume di colorante per coltura batterica.
- Incubare senza agitazione a 37 ° C per 30 min. Centrifugare i batteri e risospendere in 1 ml di pre-riscaldato THY + P brodo e incubare senza agitazione per ulteriori 30 min a 37 ° C.
- Spin giù i batteri e lavare due volte in PBS prima di misurare la OD600 nm e diluendo i batteri per microiniezione come sopra (sezione 3). Noi di solito iniettare circa 100 CFU in 1 volume di iniezione nl per i nostri studi di reclutamento dei leucociti e fagocitosi.
5. Preparazione di Zebrafish larve per infezioni
- Impostare coppie nidificanti la sera prima e raccogliere gli embrioni come descritto da Rosen et al. 27 Incubare gli embrioni in E3 medio a 28,5 ° C fino al momento di infettare.
- Per zebrafish che verrà ripreso, prevenire lo sviluppo di pigmento (melanizzazione) aggiungendo N-feniltiourea (PTU) allaE3 media a 24 ore dopo la fecondazione (HPF) per una concentrazione finale di 0,2 nM.
- Per le infezioni che coinvolgono embrioni di età compresa tra 2 dpf, embrioni dechorionate manualmente con un paio di pinzette sottili. In alternativa, gli embrioni dechorionate rimuovendo E3 e sostituzione con pronasi (2 mg / ml) per circa 5 minuti o fino delicata pipettaggio rompe embrioni di corion. La maggior parte delle larve dovrebbero sono nati naturalmente da 3 dpf.
- Anestetizzare zebrafish alcuni minuti prima infezione mettendo larve dechorionated in E3 mezzo contenente 200 mg / ml tricaine.
6. Otic Vesicle Iniezione di S. iniae in tre giorni di età Larve
- Accendere il microinjector e impostare il periodo di "millisecondo". Aprire la valvola sul serbatoio anidride carbonica per consentire il gas nella linea. La pressione del microinjector dovrebbe leggere di circa 20 PSI. Regolare la pressione nell'unità microinjector dalla rotazione in senso orario della manopola zigrinata nero per aumallentato la pressione o in senso antiorario girando per diminuzione della pressione.
- Vortex la S. preparata cultura iniae in rosso fenolo e PBS e utilizzare una punta microloader per caricare 2-3 microlitri della cultura in un ago per iniezione capillare tirato.
- Montare l'ago caricato su un micromanipolatore collegata ad un supporto magnetico e posizionarlo sotto uno stereomicroscopio modo che l'ago è a un angolo di circa 45-65 ° rispetto alla base del microscopio.
- Premere il pedale del microinjector per erogare una goccia dell'inoculo sulla punta dell'ago. Misurare il diametro della goccia con la barra di scala nella lente oculare del microscopio.
- In alternativa, stimare il diametro della goccia iniettando un volume in una goccia di olio minerale su un vetrino per microscopio con una barra di scala. Il diametro della goccia dovrebbe essere 0,10 mm, che è a circa 1 volume nl.
- Regolare la dimensione goccia regolando l'impostazione della duratamicroinjector o tagliando più della punta dell'ago con le pinzette sottili. Si noti che il tempo di iniezione deve essere compresa tra 20 - 35 msec per evitare di causare danni ai tessuti troppo.
- Usando una pipetta di plastica, di trasferimento 12 anestetizzati larve in ciascun pozzetto di stampo di iniezione.
- Utilizzare una bacchetta di vetro, anello capelli, o punta di plastica per posizionare delicatamente le larve in modo che le teste sono puntati verso il retro del microscopio e dei sacchi di tuorlo sono contro il lato sinistro del pozzo. Puntare l'orecchio sinistro della larva verso il soffitto.
- Guardando attraverso la lente oculare dello stereomicroscopio, utilizzare le manopole sul micromanipolatore per allineare l'ago caricato con la vescicola otica in modo che entrambi sono nello stesso campo visivo. Pierce lo strato epiteliale esterna della vescicola otica con la punta dell'ago in modo che la punta dell'ago è appena all'interno della vescicola.
- Premere il pedale per iniettare 1 nl della dose desiderata di S. iniae. Assicurarsi di utilizzare unpressione sufficientemente bassa in modo da non rompere la cavità. Se l'iniezione è successo, la vescicola otica, ma non il tessuto circostante, devono riempire con il fenolo inoculo rosso (Figura 1 Ai). Rimuovere immediatamente qualsiasi pesce mis-iniettata dalla piastra di iniezione.
- Rientrare con cautela l'ago della larva e spostare la piastra di iniezione a mano in modo che la prossima larva è in vista. Fate questo in 5X ingrandimento.
Nota: retrazione dell'ago può comportare la deposizione di alcuni batteri fuori della vescicola otica, che possono inclinare sopravvivenza e il reclutamento dei leucociti risultati. Per evitare questo, si raccomanda di iniettare batteri colorante fluorescente marcato e visivamente scansione larve iniettato sotto un microscopio a fluorescenza per rimuovere qualsiasi delle larve in cui si è verificato questo. Una larva iniettato corretto è mostrato in (figura 1 Bi). - Per assicurare il volume di iniezione / inoculo rimane la stessa nel corso dell'esperimento, iniettare una goccia di s battericheuspension in una provetta da 1,7 ml centrifuga contenente 100 ml di PBS sterile dopo ogni 48 ° embrione. Piatto 100 microlitri su piastre THY + P agar a 37 ° C durante la notte per determinare il CFU nel volume di iniezione.
- Quando l'intero gruppo di 12 larve sulla rampa di iniezione è stato iniettato, attenzione una pipetta di plastica trasferimento per rimuovere le larve dai pozzetti e metterli in una nuova piastra di Petri (35 x 10 mm 2). Rimuovere la soluzione tricaine e sostituirlo con circa 2 ml di terreno fresco E3 per consentire le larve di recuperare.
- Dispensare iniettato larve in singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti e incubare a 28,5 ° C. Monitorare le larve nel tempo per la sopravvivenza in queste placche o rimuovere successivamente per immagini o CFU conteggi.
7. Nero Sudan colorazione dei neutrofili
Nota: Le seguenti operazioni possono essere eseguite a temperatura ambiente in una piccola scatola di Petri (35 x 10 mm 2) su un agitatore orbitale a meno otherwise dichiarato. Per ogni fase, la quantità di reagente utilizzato è di circa 2 ml per piastra, con sufficiente liquido per coprire completamente i larve.
- Per il fissaggio delle larve infetto, utilizzare una pipetta Pasteur di vetro per rimuovere E3 medie e sostituirlo con 4% paraformaldeide ghiacciata in soluzione PBS. Porre immediatamente il pesce a 4 ° C di eutanasia. Fissare notte a 4 ° C.
- Lavare 3 volte in PBS per 5 minuti ciascuno.
- Macchia con Sudan nero (0,18% stock diluito 1: 5 in 70% di etanolo, 0,1% fenolo) per 30 minuti a 5 ore. Utilizzare uno stereomicroscopio per verificare se i granuli neutrofili hanno raccolto la macchia.
- Eseguire una serie di 5 min lavaggi a partire da una singola lavaggio in 70% di etanolo seguito da un singolo lavaggio di un rapporto 1: 1 di etanolo al 70% e PBS, seguito da un lavaggio finale in PBS.
- Reidratare in PBS più 0,1% tween (PBT).
- Per cancellare il pigmento dalla larve, lavare in 1% di idrossido di potassio / 1% di perossido di idrogeno per circa 6-10 min. Monitorare il Closel campioney e dopo circa 5 minuti, controlla le larve allo stereomicroscopio per vedere quanto del pigmento ha eliminato. Se la soluzione viene lasciata troppo a lungo, i sacchi di tuorlo si gonfiano e scoppiano.
- Lavare 3 volte per 5 minuti ciascuno in PBS.
- Conservare i campioni in PBS o PBT a 4 ° C per un massimo di 1 settimana fino al momento di immagine e contare.
- Per immagini Sudan tinto nero larve, trasferire il pesce in PBT e poi in 80% glicerolo e mettere su una singola diapositiva depressione cavità. Posizione fissa larve allo stereomicroscopio utilizzando un puntale. Immagine utilizzando una fotocamera digitale a colori su uno stereomicroscopio (Figura 1 Aii-iv).
8. enumerazione di batteri vitali da Infected Larve
- Euthanize larve nei momenti desiderati dopo l'infezione in una soluzione / L ghiacciata 200-300 mg di tricaine in E3 medio.
- Dispensare eutanasia larve in 1,7 ml provette. Rimuovere la soluzione tricaine e sostituirlo con 100 ml di 0,2%Triton X-100 in PBS (PBSTx).
- Omogeneizzare larve passando su e giù per 10 volte attraverso un ago 27 G.
- Preparare diluizioni seriali di omogenati in PBS sterile. Ad esempio, se la dose infettiva è 100 CFU, pipetta 100 ml di omogenato in 900 microlitri di PBS sterile. Utilizzando un nuovo puntale, trasferire 100 ml di omogenato diluito in 900 microlitri PBS sterile.
- Piatto 100 ml di diluizioni su Columbia CNA agar per isolamento selettivo di batteri gram-positivi, e incubare a 37 ° C per 48 ore. Questo mezzo fornirà una maggiore selezione rispetto alle piastre di agar THY + P, che favoriscono la crescita di entrambi i batteri gram-negativi e gram-positivi.
- Sulle piastre con meno di 500 colonie individuali, contare il numero di colonie e moltiplicare per il fattore di diluizione per determinare il numero di CFU.
9. Fissazione di larve for Imaging
- Fissare larve in un 4% paraformaldeide ghiacciata in soluzione PBS come dedescritto nella sezione 7.
- A temperatura ambiente, lavate 3 volte per 5 minuti ciascuno in PBS prima di imaging.
10. Preparazione di larve per Live Imaging
- Preparare una soluzione di agarosio a basso punto di fusione 1,5% in E3 per riscaldamento nel forno a microonde fino a quando la soluzione è limpida.
- Mettere soluzione di agarosio in un bagno di 55 ° C Acque per farlo raffreddare, ma si indurisce.
- Aggiungere tricaine al agarosio ad una concentrazione finale di 0,016%.
- Usando una pipetta di trasferimento in plastica, posizionare 4-5 larve anestetizzato in un piatto fondo di vetro sul palco di uno stereomicroscopio.
- Rimuovere la tricaine e soluzione di agarosio dal bagnomaria 55 ° C e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente per 1-2 min. Mentre l'agarosio si raffredda, rimuovere quanto più liquido dalla larve anestetizzato possibile.
- Versare il raffreddata agarosio nel piatto fino a circa metà della superficie è coperta. Agitare il piatto per diffondere l'agarosio. Si noti che se l'agarosioè troppo caldo, sarà uccidere le larve. Inoltre, se troppo agarosio viene aggiunto al piatto, la lente obiettivo del microscopio può colpire il fondo del piatto quando la messa a fuoco tramite l'agarosio.
- Usando una pipetta di trasferimento, raccogliere le larve che hanno galleggiato ai lati del piatto e seminare di nuovo al centro.
- Sotto lo stereomicroscopio, posizionare delicatamente le larve a piacere con un ciclo di capelli, un lungo puntale o una bacchetta di vetro. Per l'imaging della vescicola otica, posizionare le larve in modo che la vescicola otica sinistra è piatto contro il fondo del piatto.
- Lasciare raffreddare agarosio per circa 10 minuti prima di spostare il piatto. Le larve può spostare le posizioni se il agarosio non è solido. Pipettare delicatamente alcuni tricaine soluzione E3 all'inizio dello strato di agarosio per mantenerlo umido.
11. confocale Imaging di infezione
- Posizionare il piatto fondo di vetro con larve sul palco di un microscopio invertito con una scansione laser confoca FV-1000sistema l.
- Impostare il foro stenopeico di 200-300 micron e con una apertura numerica 0,75 / 20X lente dell'obiettivo, fissato z-stack con 3-6 micron fette.
- Utilizzare scansione linea continua per regolare la potenza del laser e rivelatore guadagno per ciascun canale.
- Utilizzando la scansione linea sequenziale per ogni canale di fluorescenza (ad esempio, 488 e 543 nm) e il contrasto di interferenza differenziale (DIC), condurre un film lasso di tempo della vescicola otic sinistra ogni 3 min per 2-6 ore a osservare il reclutamento iniziale e fagocitosi da parte dei neutrofili e macrofagi. Per i corsi di tempo più lungo, collocare un coperchio sul piatto Petri per evitare l'evaporazione e l'essiccazione del agarosio.
- Acquisire immagini fisse di fissa (Figura 1B) o dal vivo (Figura 2) larve a 20X o 40X di ingrandimento.
12. Fotoconversione di Dendra2 marcato leucociti al Otic Vesicle
Nota: Dendra2 può essere photoconverted da verde a fluorescenza rossafocalizzando un 405 nm laser (potenza del laser 50-70% dovrebbe essere sufficiente) sulla regione di interesse (ROI) per 1 min. Sotto è il protocollo passo-passo utilizzati per il sistema di scansione laser confocale FV-1000:
- Visualizza il campione utilizzando una scansione z-stack con il 488 nm e 543 nm laser. Utilizzare scansione linea continua per regolare la potenza del laser e del rivelatore guadagno. Verificare che non vi è alcuna fluorescenza rossa accidentalmente photoconverted.
- Nella finestra "Acquisizione di immagini di controllo", sotto "Stimulus Setting" selezionare lo strumento "Use Scanner" e scegliere "principale". Selezionare il laser 405 nm e impostarlo al 70% di potenza. Utilizzando l'opzione cerchio, definire il ROI in vescicola otica.
- Sotto "Stimulus Avvio Impostazione" selezionare "Attivazione in serie" con un preattivazione di 1 fotogramma e un tempo di attivazione di 60.000 msec. Nella finestra "Acquisition Setting" sotto la "Scan Tempo voce", scegliere 2 inintervalli di 0:01:00 (uno per pre e uno per fotoconversione post).
Nota: Dopo la scansione di serie lasso di tempo è completo, il Dendra2 avrebbe dovuto essere photoconverted al suo stato rosso fluorescente. - Scansione campione da z-stack utilizzando 488 nm e 543 nm laser visualizzare la fluorescenza rossa photoconverted nonché alcuna fluorescenza verde rimanente (Figura 3).
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Representative Results
Microiniezione di S. iniae nella vescicola otica (Figura 1 e Figura 2) si traduce in una risposta dell'ospite inizialmente localizzata. Quando iniettato correttamente, i batteri dovrebbero essere viste soltanto vescicola otica e non nel tessuto circostante o sangue. Questo può essere visualizzato durante microiniezione utilizzando colorante rosso fenolo (Figura 1A). In alternativa, se i batteri etichettati vengono iniettate, una rapida scansione delle larve infetti inviare immediatamente l'iniezione in grado di confermare i batteri sono solo nella vescicola otica e non il tessuto circostante (Figura 1B). Anche se una dose non più di 10 CFU selvaggio tipo S. iniae è in grado di stabilire una infezione letale entro 24-48 ore dopo l'infezione (HPI), iniezione di 1.000 UFC di un ceppo avirulent, CPSA, non comporta l'infezione letale e che sforzo non sembra in grado di proliferare in accoglienza 24. Pertanto, questo modello di infezione localizzata può differentiate tra i ceppi batterici di virulenza alterata.
Siti di microiniezione di infezione localizzata inizialmente sono utili per studiare chemiotassi dei leucociti. Il reclutamento dei leucociti può venire quantificato da uno nero Sudan colorazione di granuli neutrofili (Figura 1A) o la formaldeide la fissazione di linee transgeniche fluorescenti (Figura 1B). Per visualizzare il reclutamento e le capacità di fagocitosi delle cellule immunitarie, abbiamo utilizzato linee transgeniche che esprimono la proteina fluorescente verde Dendra2 particolare nei macrofagi Tg (MPEG1: dendra2) 24 o neutrofili Tg (mpx: dendra2) 12. Quando S. iniae viene iniettato nella vescicola otica di 3 dpf larve, sia neutrofili e macrofagi vengono rapidamente reclutati nei primi 2 HPI (Figura 1). Tuttavia, quando eseguito correttamente, microiniezione di PBS nella vescicola otica non comporta la stessa robusta reclutamento dei leucociti ospitanti (
Figura 2: fagocitosi di S. iniae dai fagociti nella vescicola otica mpx transgenici:. dendra2 (A) o MPEG1: dendra2 (B) larva infettato con il rosso marcato S. iniae (rappresentato in magenta) e ripreso al posto infezione 60 minuti utilizzando un scann lasering microscopio confocale. Bar Scala, 30 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Fotoconversione dei macrofagi al otic vescicole 5 HPI con S. iniae. I macrofagi (raffigurati in verde) vescicola otica, designati dal cerchio (A), sono stati photoconverted (B) utilizzando un laser 405 nm su un microscopio confocale e tracciati nel tempo. Entro il 24 hpi, macrofagi photoconverted (rappresentato in magenta) sono migrati fino al tronco / caudale tessuto emopoietico (C); barra della scala, 50 micron. Ingrandimenti superiori delle regioni in scatola di C sono riportati in (i) e (ii), barra della scala 30 micron; frecce indicano photoconmacrofagi convertito. Cellule Photoconverted appaiono bianche a causa della risultante dalla fusione 543 nm fluorescenza rossa e qualsiasi residuo 488 nm fluorescenza verde. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo di infezione usato qui è utile per lo studio della risposta immunitaria ad un'infezione inizialmente localizzata in 2-3 embrioni DPF e larve. L'obiettivo di uno stimolo infiammatorio, come l'infezione, in una cavità chiuso come vescicola otica consente lo studio di neutrofili e macrofagi chemiotassi e fagocitosi. Un avvertimento di iniettare batteri nella vescicola otica è che la capacità dei neutrofili di fagocitare batteri efficientemente in cavità piene di liquido può dipendere dal particolare microbi. Sebbene Escherichia coli e Bacillus subtilis non sono facilmente fagocitati dai neutrofili nella vescicola otica 28, abbiamo trovato che i neutrofili sono in grado di fagocitare sia Pseudomonas aeruginosa e S. iniae in questa posizione 16, 24. Infezione localizzata è utile anche quando si studia l'invasività dei vari agenti patogeni. Per causare un'infezione sistemica i seguentinjection in una cavità chiusa, come vescicola otica, il microbo deve essere in grado di attraversare le barriere host fisici. In alternativa, diversi agenti patogeni possono contare su cellule ospiti per il trasporto e la diffusione dal sito iniziale di infezione. Questo rende le iniezioni localizzate utili per il confronto ceppi di virulenza alterata.
Durante microiniezione, per eliminare i batteri sedimentazione e intasamento dei aghi, aghi di cambiamento sia dopo ogni condizione o dopo circa 50 larve. Ciò contribuirà a garantire la sospensione l'ago è più uniforme. Se assestamento di batteri in dell'ago sembra essere un problema, un mix di PBS, 2% PVP40, e il 10% di glicerolo può aiutare a mantenere una sospensione omogenea. Per garantire che ciascuna larva viene iniettato con approssimativamente lo stesso numero di batteri, controlla una conta omogeneizzando una larva immediatamente dopo l'iniezione e l'omogeneizzato placcatura sul CNA agar. CNA agar selezionerà per la crescita di batteri gram-positivi coltivabili, non soloS. iniae, ma fornirà un'idea di quanto coerente le dosi di iniezione sono tra ogni individuo larva. Con un inoculo obiettivo di 100 CFU per larva, ci sono in genere tra 75-150 colonie su una piastra CNA. Il numero di non S. colonie gram-positivi iniae che crescono su un piatto CNA è probabilmente molto bassa, dal momento che la maggior parte dei pesci iniettato PBS solito comporta tra 0-20 colonie. Al più tardi momenti durante l'infezione, non è raro che vi essere variazione fino a mezzo log nella conta delle colonie tra larve infettati con la stessa dose infettiva. Questo potrebbe rappresentare leggere differenze fra larva individuale nella loro capacità di controllare l'infezione o potrebbe riflettere differenze nella quantità di batteri gram-positivi coltivabili in larve o E3 medie.
Mentre iniettare nella vescicola otica, è importante non iniettare un volume eccessivo o con una pressione troppo alta poiché ciò potrebbe provocare la cavità rottura. Volumi di iniezione shoULD essere mantenuto a circa 1 NL. Se l'ago è troppo grande, la microiniezione può causare danni al tessuto circostante, che possono influenzare il reclutamento dei leucociti ospitanti al sito di infezione o batteri possono consentire di fuoriuscire della vescicola otic. E 'anche importante confermare iniezione nello spazio corretta. Se l'ago viene inserito troppo in profondità, può colpire attraverso la vescicola otica o può colpire i vasi sanguigni che scorre intorno vescicola otica. Questo può portare alla deposizione di batteri nel sangue o all'esterno della vescicola, che possono alterare risposta dell'ospite.
È anche possibile che quando l'ago viene estratto, alcuni batteri possono essere accidentalmente depositati fuori vescicola otica, come dimostrato da Colucci-Guyon et al. 28, ma troviamo questo solo il caso in meno del 5% delle iniezioni. Cercando di iniettare nel centro della vescicola otic può contribuire ad evitare questa situazione. In una infezione di successo, la vescicola otica dovrebbe riempire with il colorante rosso fenolo, ma il colorante non deve fuoriuscire nei tessuti circostanti. Qualsiasi larve mis-iniezione deve essere immediatamente scartata. Iniezione di batteri etichettati è un modo utile per confermare una iniezione di successo (Figura 1B). Uno degli svantaggi di usare un colorante CellTracker è che questo colorante diventerà diluito come i batteri dividono, eventualmente impedendo ai batteri vengano visualizzati sotto fluorescenza. Abbiamo scelto un colorante rosso perché abbiamo usato neutrofili etichetta verde e linee transgeniche macrofagi per la maggior parte dei nostri studi.
Dendra2 è una proteina derivata da fotoconvertibile ottocorallo Dendronephthya sp. che può essere photoconverted da verde a uno stato fluorescente rosso con un laser 405 nm 29. Questo fotoconversione è un modo non invasivo per marcare le cellule e monitorare il loro destino nel corso dell'infezione. I leucociti reclutati al sito di infezione possono essere photoconverted e seguiti nel tempo per monitorare il loro dissemination tutta tessuti dell'ospite (Figura 3). In alternativa, leucociti potrebbero essere photoconverted prima infezione e poi monitorati post-microiniezione per determinare l'origine delle cellule reclutate al sito di infezione. Etichettatura batteri e cellule immunitarie consente per lo studio delle interazioni leucociti-patogeno in vivo, tra cui l'assunzione e la fagocitosi (Figura 1B e Figura 2). Distinguere la S. rosso marcato iniae dalla fluorescenza rossa di un leucocita photoconverted è difficile, quindi un diverso CellTracker colorante fluorescente potrebbe essere usato. Ciò sarebbe particolarmente utile per determinare quale delle cellule immunitarie photoconverted che lasciano la vescicola otica contiene S. iniae.
Le future applicazioni del metodo dell'infezione vescicola otica potrebbero includere la misurazione della velocità e direzionalità con cui neutrofili e macrofagi muovono in risposta a varie infezioni. Il k infezioneinetics può anche essere studiata per vedere quali cellule tipi sono i primi ad arrivare a un sito di infezione e quali tipi di cellule sono più robusta reclutati oltre a dove le cellule provengono o dove diffondere 30. Oltre a studiare l'assunzione di un'infezione inizialmente localizzata, questo modello infezione può essere usato per studiare la funzione dei componenti del sistema immunitario ospite durante l'infezione iniziale. Oligonucleotidi antisenso morfolino mirati RNA specifici possono essere utilizzati per abbattere l'espressione di accoglienza componenti del sistema immunitario, tra cui i recettori Toll-like, i recettori delle citochine e leucociti, e CRISPR-Cas o la tecnologia TALEN possono essere usati per creare mutanti genetici. Espressione genica utilizzando RNAseq o qPCR può anche essere utilizzato per caratterizzare l'espressione di alcuni geni ospitanti in risposta alle infezioni.
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Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio per la cura e la manutenzione zebrafish. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health, National Research Service Award A155397 di EA Harvie e NIH R01GM074827 Anna Huttenlocher.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml Eppendorfs | MidSci | AVSS1700 | |
| 14 ml Falcon tube | BD Falcon | 352059 | |
| 27 G x ½ in. needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 96-well Plate | Corning Incorporated | 3596 | |
| Agar | BD Biosciences | 214030 | |
| CellTracker Red | Molecular Probes, Invitrogen | C34552 | |
| CNA agar | Dot Scientific, Inc | 7126A | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-7m | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Ethanol 200 proof | MDS | 2292 | |
| Fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gel comb | VWR | 27372-482 | 4.2 mm width, 1.5 mm thick |
| Glass bottom dishes | Custom made by drilling a 16 - 18 mm hole in the center of a 35 mm tissue culture dish bottom and placing a 22 mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light. | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| High melt agarose | Denville Scientific, Inc. | CA3510-6 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | with FV-1000 system | |
| Low melt agarose | Fisher | BP165-25 | |
| Magnetic stand | Tritech (Narishige) | GJ-1 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipet tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | Tritech (Narishige) | M-152 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Nanodrop spectrophotmeter | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 100 x 15 mm |
| Phenol | Sigma Aldrich | P-4557 | |
| Phenol Red | Ricca Chemoical Company | 572516 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Potassium hydroxide | Sigma Aldrich | P-6310 | |
| Pronase | Roche | 165921 | |
| Protease peptone | Fluka Biochemika | 29185 | |
| Small cell culture dish | Corning Incorporated | 430165 | 35 x 10 mm |
| Sudan Black | Sigma Aldrich | S2380 | |
| Thin wall glass capillary injection needles | World Precision Instruments, Inc. | TW100-3 | |
| Todd Hewitt | Sigma Aldrich/Fluka Analytical | T1438 | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | Argent Chemical Laboratory/Finquel | C-FINQ-UE-100G | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast extract | Fluka Biochemika | 92144 |
References
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