Abstract
水生病原体、 ストレプトコッカスイニエは 、養殖業の年間損失億ドル以上を担当し、魚とヒトの両方で全身性疾患を引き起こすことができるである。 S.のより良い理解イニエ疾患の病因は、適切なモデルシステムが必要です。蛍光的には、免疫細胞をタグ付けして、遺伝的扱いやすさとゼブラフィッシュの初期の発達段階の光透過性は、トランスジェニック株の生成と非侵襲的イメージングを可能にします。数週間は、受精を投稿するまで、適応免疫系は、完全に機能していないですが、ゼブラフィッシュの幼虫は、好中球およびマクロファージの両方で保存された脊椎動物自然免疫系を持っている。したがって、幼虫感染モデルの生成はS.制御における自然免疫の特定の寄与の研究を可能にするイニエ感染。
微量注入の部位は、感染があるかどうかを決定する全身または最初にローカライズされた。ここでは、ゼブラフィッシュ高齢の2-3日後に受精などの感染の蛍光共焦点イメージングのための私たちの技術の耳の小胞の注射のために私たちのプロトコルを提示する。ローカライズされた感染部位は、宿主細胞および感染の普及の募集、初期の微生物の侵入を観察することができます。 S.のゼブラフィッシュ幼虫のモデルを使用して、我々の調査結果イニエ感染は、ゼブラフィッシュは、ローカライズ細菌感染における宿主好中球およびマクロファージの異なる寄与を調べるために使用できることを示している。さらに、我々は、免疫細胞の光標識は、感染の過程で、個々の宿主細胞の運命を追跡するために使用する方法を記載している。
Introduction
ストレプトコッカスイニエは、魚と人間の1の両方で全身性疾患を引き起こすことができる主要な水生病原体である。 S.ながらイニエは養殖業における大きな損失の原因である、それはまた、他の連鎖球菌のヒト病原体によって引き起こされるものと同様の臨床病理との免疫無防備状態のヒト宿主において疾患を引き起こすことができる潜在的な人畜共通感染病原体である。ヒト病原体との類似性を考えると、それは、Sを研究することが重要です自然宿主との関連でイニエ疾患の病因。 S.の大人のゼブラフィッシュモデルイニエ感染は、適応免疫系7を含むために、時間が短すぎ、感染の局所的部位、ならびに死をホストするために短期間にホスト白血球の堅固な浸潤を明らかにした。 S.に対する自然免疫応答への深い外観を得るためにインビボでの感染イニエ 、それは、nがより適しているモデルを使用することが必要である上の侵襲的なライブイメージング。
幼虫のゼブラフィッシュは、宿主 - 病原体相互作用を研究するため、ますます魅力的な脊椎動物のモデルにする多くの利点がある。ゼブラフィッシュは、比較的安価で使用し、哺乳類のモデルに比べて維持するのは簡単です。適応免疫は4-6週間後受精まで、機能的に成熟していないですが、幼虫が食作用および呼吸バースト2-6含む抗菌機能を備えた補完、Toll様受容体、サイトカイン、及び好中球およびマクロファージとの高度に保存された脊椎動物の自然免疫系を持っている、 8-11。また、遺伝的取り扱いやすさと開発の胚および幼虫の光透過性により、 生体内でリアルタイムで宿主-病原体相互作用を検討すること、蛍光標識された免疫細胞との安定したトランスジェニック系統の生成を可能にする。そのようなデンなどphotoconvertibleタンパク質を用いて、これらのトランスジェニック株の生成DRA2は、感染12の過程で個々の宿主細胞の起源と運命の追跡が可能になります。
ゼブラフィッシュ幼虫の感染モデルを開発する場合、マイクロインジェクションの選択されたサイトは、感染が最初に局所的又は全身性であるかどうかを判断します。キュビエの尾静脈またはダクト内に全身の血液の感染症は、最も一般的にゼブラフィッシュにおける微生物病原体を研究するために使用されると、ホストと微生物細胞、サイトカイン応答、および病原体株の間に病原性の違いの間の相互作用を研究するために有用である。遅い成長微生物について、16-1,000細胞期の胚の卵黄嚢への早期噴射の間であることが見出され、成長の遅い微生物のマイクロインジェクションのための最適な発達段階で、全身感染13,14を生成するために使用できる16から128細胞期15。しかし、ホスト開発の後期段階で、多くの微生物の嚢注射卵黄トンに対して致死的である傾向がある彼は、微生物および白血球16-18浸潤の欠如のために栄養豊富な環境のためにホストします。
局所感染は、通常、容易に非侵襲的イメージングを用いて定量することができる感染の部位に向けての白血球の指向遊走をもたらす。このタイプの感染は、白血球遊走、ならびに種々の白血球集団の異なる遊走および食作用の能力の調査を媒介するメカニズムの切開を可能にすることができる。細菌の菌株間の病原性の違いを調べるだけでなく、物理ホストの障害が全身になるために局所感染のために交差しなければならないので、微生物の侵入メカニズムを研究する際にローカライズされた感染症にも便利です。ゼブラフィッシュは、典型的には25〜31°C 19の温度で上昇するが、それらは厳しい温度要件を有する特定のヒト病原体の侵襲性の研究のために34〜35℃程度の高温で維持することができる病原性20、21のために。
多くの異なるサイトでは、後脳心室22、背側尾の筋肉18、心膜空洞23、および耳胞（耳）5、16、24を含む最初にローカライズされた細菌感染を生成するために使用されてきた。しかし、尾の筋肉への細菌の注射は、白血球応答13を調査する際に、結果を歪め得る細菌の独立した組織損傷および炎症を引き起こし得ることが見出されている。少ないダメージは後脳への注入に関連した、それは若い胚における白血球の最初は欠いているが、ミクログリアが住居を取るように、後脳心室が着実に時間をかけてより多くの免疫細胞を獲得されていますが。後脳心室は、画像へのより困難な場所です。耳胞は血管系25、26に直接アクセスすると、閉じた空洞である。それは、レイの通常欠いているkocytesが、白血球は感染症などの炎症性刺激に応答して耳胞に補充することができる。またためにイメージングの容易さおよび注入の可視化のゼブラフィッシュ熟成2-3日後に受精（DPF）中の細菌のマイクロインジェクションの好ましい部位である。したがって、我々はローカライズされた細菌感染の私たちのサイトとして、耳胞を選択しました。
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Protocol
大人と胚のゼブラフィッシュは、ウィスコンシン大学マディソン研究動物資源センターの大学に従って維持された。
1.マイクロインジェクション針の準備
- プル5、放送時間の開始時に、速度80、時刻70、空気の時間を、空気圧200、熱502 90を引く：以下の設定でマイクロピペットプラー装置を用いた薄壁ガラスキャピラリー注射針（1.0 OD / 0.75 ID）を調製プル5の終わりに。
- 先端開口は、約10μmの直径を有するように、微細なピンセットを使用して、引っ張ら針の先端を切る。
2.準備幼虫インジェクション料理
- 滅菌水で約4〜程度の車線幅とゲル櫛をすすぎ、乾燥させます。
- 溶液が透明になるまでE3媒体19およびマイクロ波で1.5から2パーセント高い溶融アガロース溶液を準備します。冷却した後、ペトリ皿（100×15 mm）のスワールにアガロースの一部を注ぐちょうど十分にアガロースを添加して完全に皿の底を覆う。
- アガロース層が固化したら、非コーマ終了したばかりのペトリ皿の上に載っているとコーミング端アガロースに触れているように、上部にすすぎ、乾燥ゲルコームを置き。下のアガロース層に対して30°の角度を作成する、櫛は、できるだけ水平であることを確認してください。
- 新鮮なアガロース層は櫛のウェルを覆うように櫛と底アガロース層との界面にアガロースの追加の少量を注ぐ。コームを取り外す前に完全に冷却してください。ピペットチップを使用して、井戸からアガロースのオーバーハング部分を削除する。
- 4℃での射出成形金型や店舗の上にE3媒体を注ぐ。
- 各使用の前に、注射の前に少なくとも1時間は28.5℃で新鮮な培地と温かい注射ランプと交換してください。
- 直前に注射し、注射ランプにE3を交換を200μg/ mlのエチル3-アミノベンゾエート（トリカイン）を含むE3媒体。
3. S.の準備接種イニエ
- は30g / Lトッドヒューイット、2g / Lの酵母エキスが20g / Lのプロテオースペプトン0.2％酵母エキス、2％のプロテオースペプトン（THY + P）を補充したトッドヒューイットブロス培地を調製し、オートクレーブ。寒天プレートの場合は、14グラム/ L寒天を追加します。
- 密封された15ミリリットルチューブにTHY + Pブロスの10ミリリットルに凍結された細菌株の100μlのアリコートをピペットにより細菌培養を感染前の晩を準備します。 37℃で撹拌せずに一晩インキュベートする。成長の14〜16時間後、冷凍庫ストックを作るか、または注射で使用するために準備するのどちらか一晩培養を使用しています。
- 1.7ミリリットル遠心管中で80％グリセロール500μlの中で一晩培養物1mlを配置することによって、冷凍庫のストックを作る。凍結融解サイクルを避けるために、-80℃で、このミックスとストアから100μlの1-利用アリコートを作る。
- S.のためにinfectiで使用イニエTHY + Pブロスの9.9ミリリットルに一晩培養の0.1ミリリットルを追加することによって、10ミリリットル文化の総量100：アドオン、1晩培養物を希釈する。約4~5時間、攪拌せずに37℃で成長する。ナノドロップ分光光度計を用いて600nmでの光学密度（OD）を監視し、OD 600 nmが0.250から0.500に達したときに、中間対数増殖期の細菌を収穫する。単位（CFU）/ mlの形成約10 8コロニーに相当する0.250のOD600 nmを。
- 5分間1500×gで1.7ミリリットル遠心管に細菌培養の1ミリリットルをペレット。新鮮なPBSおよび繰り返しの1ミリリットル中に懸濁します。 PBS中の細菌のOD600 nmを測定し、ペレットを、所望の濃度を達成するためにPBS中に再懸濁する。
- マイクロインジェクションの可視化を支援するために、0.1％の最終濃度のために注射前に細菌懸濁液にフェノールレッドを追加します。
- 熱で殺した細菌の注入を伴う実験のために、30分間95℃でPBS中の細菌を加熱する。熱殺すプロセスは固体THY + P寒天プレート上に注入量（約1 NL）をメッキし、37℃で一晩インキュベートすることによって、検出できないレベルに生菌数を減少させたことを確認してください。
4.ラベルS. CellTrackerレッド蛍光色素でINIA電子
- 生きた細菌細胞を標識するために、CellTracker蛍光色素または同等の原液を調製。使用される色素は、粉末の20×50μgのアリコートで提供され、DMSO中に再懸濁する必要があるように、10mMのストック濃度を得るためにチューブに7.3μlのDMSOを加える。
- 細胞を染色する最低の最適濃度を決定するために、細菌上の色素濃度（ 例えば、0.5〜25μM）の範囲をテストします。急速に分裂する細胞と長い実験は、色素のより高い濃度が必要な場合があります。
- （セクション3）上記のように遠心分離により1.7ミリリットルチューブに細菌培養の1.0ミリリットルをペレット。 1にペレットを再懸濁新しいPBSをMLと細菌培養への染料の適切なボリュームを追加。
- 30分間37℃で撹拌せずにインキュベートする。予め温めTHY + Pブロス1ml中の細菌を再懸濁し、スピンダウンし、37℃でさらに30分間、攪拌せずにインキュベートする。
- 細菌をスピンダウンし、OD600 nmのを測定し、（セクション3）上記で詳述したようにマイクロインジェクションのための細菌を希釈する前に、PBS中で2回洗浄する。私たちは通常、白血球動員及び食作用の私たちの研究のために1 NL注入量は約100 CFUを注入。
感染症のゼブラフィッシュ幼生の5準備
- 前の晩繁殖ペアを設定し、感染する準備が整うまで28.5℃で、E3培地でローゼンら 27インキュベート胚に記載されているように胚を集める。
- 結像されるゼブラフィッシュのために、N-フェニルチオ尿素（PTU）を添加することにより色素（メラニン）の発症を予防する0.2 nMでの最終濃度は24時間後に受精（ゼブラ）でのE3媒体。
- 胚を含む感染症の手動で微ピンセットで、dechorionate胚を2 DPF歳。代替的に、E3を除去し、（2 mg / ml）で約5分間、または穏やかなピペッティングを絨毛膜から胚を破壊するまでプロナーゼで置き換えることによりdechorionate胚。ほとんどの幼虫は3 DPFによって自然に孵化している必要があります。
- 200 / mlのトリカインを含むE3培地に絨毛膜を除去した幼虫を配置することにより、感染前にゼブラフィッシュは数分麻酔。
S. 6.耳胞インジェクション三日目の幼虫にイニエ
- マイクロインジェクターの電源を入れ、「ミリ秒」までの時間範囲を設定します。ライン内にガスをできるように、二酸化炭素タンクのバルブを開きます。マイクロインジェクターの圧力は約20 PSIをお読みください。 INCRための黒いローレットノブの右旋回によってマイクロインジェクターユニット内の圧力を調整して圧力を緩和または減少圧力のターニング反時計。
- 準備S.ボルテックスフェノール中文化赤とPBS イニエと引っ張らキャピラリー注射針に文化の2-3μLをロードするmicroloaderチップを使用します。
- 磁気スタンドに接続されているマイクロマニピュレーターにロードされた針をマウントし、針を約顕微鏡のベースに対して45〜65°の角度になるように実体顕微鏡下に配置します。
- マイクロインジェクターのフットペダルを押して、針の先端に接種物の落下を分配する。顕微鏡の接眼レンズ中のスケールバーを使用して、ドロップの直径を測定します。
- 代替的に、スケールバーを用いてガラス顕微鏡スライド上にミネラルオイルの滴への体積を注入することによって液滴の直径を推定する。ドロップの直径は1 NLボリュームについてです約0.10ミリメートル、である必要があります。
- 上の設定期間を調整することにより、液滴サイズを調整しますマイクロインジェクターや細いピンセットで針の先端の多くをオフにクリッピングすることによって。あまりにも多くの組織の損傷を引き起こすことを避けるために35ミリ秒 - 噴射時間が20の間でなければならないことに注意してください。
- プラスチックトランスファーピペットを用いて、トランスファー12は射出成形型の各ウェルに幼虫を麻酔。
- ウェルの左側に反対しているヘッドは顕微鏡と卵黄嚢の後ろの方に指摘されているように、静かに幼虫を配置するためにガラス棒、髪のループ、またはプラスチックチップを使用してください。天井に向かって幼虫アップの左耳を向けます。
- 実体顕微鏡の接眼レンズを通して見ると、両方が同じ視野にあるように、耳胞にロードされた針を整列するためにマイクロマニピュレータのノブを使用しています。ピアスニードルチップと耳胞の外側上皮層針の先端がちょうど小胞の内部にあるようにする。
- Sの所望の投与量の1 NLを注入するフットペダルを押すイニエ 。使用してください空洞を破裂させないように十分低い圧力。注入が成功した場合、耳のベシクルではなく、周囲の組織には、フェノールレッド接種材料（ 図1 AI）で満たす必要があります。すぐに注入プレートから任意のミス注入された魚を削除します。
- 慎重に幼虫の外に針を撤回し、次の幼虫がビューになるように手で注入プレートを移動します。 5倍の倍率の下でこれを行います。
注意：針の後退は生存と白血球動員結果を歪曲も耳の小胞の外側にいくつかの細菌の沈着の原因となります。これを回避するために、蛍光色素で標識された細菌を注入し、視覚的にこれが発生した任意の幼虫を除去するために蛍光顕微鏡下で注入された幼虫をスキャンすることをお勧めします。正確に注入された幼虫（ 図1のBi）に示されている。 - 注入量/接種材料は、実験の過程で同じまま確保するために、細菌sの低下を注入すべての48 回目の胚の後に滅菌PBSを100μlを含む1.7ミリリットル遠心管にuspension。注入量でCFUを決定するために、37℃で一晩THY + P寒天プレート上で100μlのプレート。
- 射出ランプ上の12幼虫のグループ全体が注入された場合には、慎重に井戸から幼虫を削除し、新しいペトリ皿（35×10ミリメートル2）にそれらを配置するためにプラスチック製のトランスファーピペットを使用しています。トリカイン溶液を除去し、幼虫が回復できるように、約2ミリリットルの新鮮なE3培地と交換してください。
- ピペットで96ウェルプレートの単一ウェルに幼虫に注入し、28.5℃でインキュベートする。これらのプレートで生存のために時間をかけて幼虫を監視したり、画像化またはCFUカウントのため、後に削除します。
好中球の7.スーダンブラック染色
注：以下の手順は、otのない限り、オービタルシェーカー上で小さなペトリ皿（35×10 mm 2）で 、室温で行うことができherwiseは述べています。各ステップで、使用される試薬の量は完全に幼虫をカバーするだけの十分な液体を使用して、皿当たり約2 mlである。
- 感染した幼虫の固定のために、E3培地を除去し、PBS溶液中の氷冷4％パラホルムアルデヒドで置き換えるガラスパスツールピペットを使用する。すぐに安楽死させるために、4℃で魚を置く。 4℃で一晩固定してください。
- 5分間ずつPBS中で3回洗浄する。
- 5時間30分：スーダンブラックによる染色（70％エタノール、0.1％フェノール、5 0.18％ストック1に希釈）。好中球の顆粒が汚れを取り込んだかどうかをチェックするために実体顕微鏡を使用してください。
- PBSでの最終洗浄した70％エタノール及びPBSの比が1：1の単一の洗浄、続いて70％エタノール中の単一の洗浄から開始5分間の洗浄を連続して行う。
- PBS + 0.1％トゥイーン（PBT）に再水和。
- 幼虫から顔料をクリアするには、約6-10分間、1％水酸化カリウム/ 1％過酸化水素で洗う。サンプルcloselを監視Yと約5分後に、クリアしていますどのくらいの顔料の見るために実体顕微鏡下で幼虫をご確認ください。溶液は長すぎる上に残されている場合は、卵黄嚢は膨張し、破裂します。
- PBSで5分間3回ずつ洗浄する。
- 画像の準備ができるまで1週間まで4℃でPBSまたはPBTいずれかのサンプルを保存し、数える。
- 画像スーダンブラック染色幼虫に、シングルキャビティうつ病スライド上に80％グリセロール、所定の位置に、次いでPBTに魚を転送。位置は、ピペットチップを用いて実体顕微鏡下で幼虫を修正しました。実体顕微鏡（ 図1 AII-IV）にカラーデジタルカメラを用いた画像。
感染幼虫から生菌の8列挙
- 希望の時間に幼虫を安楽死させるE3培地でトリカインの氷冷200〜300 mg / Lの溶液中で感染後。
- ピペットで1.7 ml遠心チューブに幼虫を安楽死さ。トリカイン溶液を除去し、0.2％の100μLと交換PBS中のトリトンX-100（PBSTx）。
- 27 G針を通して上下に10回通して幼虫を均質化する。
- 滅菌PBSでホモジネートの連続希釈液を準備します。たとえば、感染量は100 CFU、900μlの滅菌PBSにホモジネートのピペット100μlである。新しいピペットチップを使用して、900μlの滅菌PBS中に希釈ホモジネート100μlのを転送する。
- プレートグラム陽性菌の選択分離のためのコロンビアCNA寒天上の希釈液を100μl、48時間、37℃でインキュベートする。この培地は、グラム陰性およびグラム陽性細菌の両方の成長を支えるもの、THY + P寒天プレートよりも大きい選択を提供する。
- 500未満の個々のコロニーを有するプレート上で、コロニー数を数え、CFUの数を決定するために希釈係数を掛け。
イメージングのための幼虫の9固定
- デとしてPBS溶液中の氷冷4％パラホルムアルデヒド中で幼虫を修正セクション7でスクライブさ。
- 室温で、イメージングの前にPBSで各5分間、3回洗浄する。
ライブイメージングのための幼虫の10の準備
- 溶液が透明になるまで電子レンジで加熱することにより、E3で1.5％低融点アガロース溶液を調製する。
- それは涼しいが、硬化しないようにする55℃の水浴中でアガロース溶液を配置します。
- 0.016パーセントの最終濃度にアガロースにトリカインを追加します。
- プラスチック製のトランスファーピペットを用いて、実体顕微鏡のステージ上にガラスボトムディッシュに4-5麻酔をかけた幼虫を置く。
- 55℃の水浴からトリカインとアガロース溶液を除去し、1〜2分間室温でそれが冷ます。アガロースが冷却されている間、可能な限り、麻酔した幼虫からできるだけ多くの液体を除去。
- 表面の約半分が覆われるまで皿にアガロースを冷却注ぐ。アガロースを広めるために料理を渦巻。尚、アガロース場合熱すぎる、それは幼虫を殺すでしょう。あまりにも多くのアガロースを皿に添加された場合アガロースで集束する場合にも、顕微鏡の対物レンズは、皿の底を打つことができる。
- トランスファーピペットを用いて、皿の側面に浮いている幼虫をピックアップし、センターバックにそれらをピペット。
- 髪のループ、長いピペットチップやガラス棒で、必要に応じて実体顕微鏡下で、静かに幼虫を配置する。左耳の小胞は、皿の底に対して平らになるように、耳胞のイメージングのために、幼虫を配置する。
- ディッシュを移動する前に、約10分間アガロースクールしましょう。アガロースが固体でない場合、幼虫は位置をシフトすることができる。優しく湿ったそれを維持するためにアガロース層の上にいくつかのトリカインおよびE3ソリューションをピペット。
感染の11。共焦点イメージング
- FV-1000レーザー走査confoca倒立顕微鏡のステージ上に幼虫を有するガラスボトムディッシュを置きLシステム。
- 200〜300μmのピンホールを設定し、開口数0.75 / 20X対物レンズを使用して、3-6程度のスライスでのzスタックを設定する。
- 各チャネルのレーザパワーと検出器の利得を調整するために、連続ライン走査を使用する。
- 各蛍光チャネルのための線順次走査を使用すること（ 例えば、488および543 nm）を微分干渉コントラスト（DIC）は、好中球による初期の動員および食作用を観察するために2-6時間放置耳胞のタイムラプスムービー3分毎に行うおよびマクロファージ。長い時間のコースでは、アガロースから蒸発して乾燥を防ぐために、ペトリ皿に蓋を置く。
- 20Xまたは40X倍率で（ 図2）の幼虫をまだ固定します（ 図1B）の画像を取得するか、住んでいます。
耳胞でDendra2標識白血球の12光変換
注：Dendra2が緑から赤色蛍光にphotoconvertedすることができます1分間の関心領域（ROI）に（50〜70％のレーザパワーが十分であるべきである）、405 nmのレーザーの焦点を合わせることができる。以下FV-1000レーザー走査共焦点システムに使用されるステップバイステップのプロトコルである。
- 488 nmおよび543 nmのレーザーを用いてzスタック·スキャンを使用してサンプルを視覚化する。レーザパワーと検出器の利得を調整するために、連続ライン走査を使用する。全く偶然photoconverted赤色の蛍光がないことを確認してください。
- 「画像取得制御」ウィンドウで、「刺激設定」の下に「使用スキャナー」ツールを選択し、「メイン」を選択します。 405 nmのレーザーを選択して、70％の電力でそれを設定する。サークルオプションを使用すると、耳胞でROIを定義する。
- 「刺激開始の設定」の下で1フレームの予備活性60,000ミリ秒の活性化時間で」シリーズのアクティベーション」を選択します。 「見出しタイムスキャン」の下の「取得の設定」ウィンドウで、2を選択夜12時01分00秒のtervals（前用と後光変換のための1）。
注：タイムラプスシリーズのスキャンが完了したら、Dendra2は赤色蛍光状態にphotoconvertedされている必要があります。 - photoconverted赤色蛍光だけでなく、残りの緑色蛍光（ 図3）を可視化するために488 nmおよび543 nmのレーザーを使用してzスタックすることにより、試料をスキャンします。
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Representative Results
S.のマイクロインジェクション最初にローカライズされたホストの応答で、耳胞にイニエ （ 図1と図2）の結果。正しく注入された場合には、細菌は唯一、耳胞ではなく、周囲の組織または血液中に見られるべきである。これは、フェノールレッド色素（ 図1A）を用いてマイクロインジェクションの間に可視化することができる。ラベル細菌が注入された場合あるいは、感染した幼虫のクイックスキャンはすぐに細菌が唯一、耳胞ではなく、周囲の組織（ 図1B）であることを確認することができ、注射後。なお、投与量わずか10 CFU野生型S.イニエは 24〜48時間後に感染（HPI）、非病原性株、CPSA 1000 CFUの注入内致 死感染を確立することができる、致死感染を生じ、その歪みがホスト24内で増殖することができないようではありません。したがって、この局所的な感染モデルではdifferentiatすることができる変更された病原性の細菌の菌株間で電子。
最初は局所感染のマイクロインジェクションサイトは、白血球走化性の研究に有用である。白血球動員は、好中球顆粒のスーダンブラック染色（ 図1A）または蛍光トランスジェニック系統（ 図1B）のホルムアルデヒド固定のどちらかによって定量化することによってすることができます。 24：動員および免疫細胞の食作用能力を視覚化するために、我々は、マクロファージのTg（dendra2 MPEG1形式）に特異的に緑色蛍光タンパク質Dendra2を発現するトランスジェニック系統を使用 または好中球のTg（MPX：dendra2）12。場合にはS.イニエ3のdpf幼虫の耳胞に注入され、両方の好中球およびマクロファージは、急速に第2のhpi（ 図1）内に補充される。正しく行わしかし、耳の小胞へのPBSのマイクロインジェクションは、（ホスト白血球の同じ堅牢な募集にはなりません
図2：Sの貪食耳胞における食細胞によるイニエジェニックMPX：。dendra2（A）またはMPEG1：赤い標識S.に感染しdendra2（B）幼虫レーザーscannを用いイニエ （マゼンタで示されている）及び60分後感染で画像化共焦点顕微鏡る。スケールバーは30μm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：S.と耳胞5 HPIでのマクロファージの光変換イニエ 。サークル（A）で指定された耳胞で（緑色で示す）マクロファージ、共焦点顕微鏡上で405nmのレーザーを用いた（B）photoconverted、経時的に追跡した。 24 HPIでは、（マゼンタに描か）までトランク/尾造血組織（C）として移行したマクロファージをphotoconverted。スケールバーは50μm。 Cで囲み領域の高倍率は、（i）および（ii）、スケールバーは30μmで示されている。矢印はphotoconを指すマクロファージコンバートさ。 Photoconverted細胞が。なぜなら、マージされた543 nmの赤色蛍光と、残りの488 nmの緑色蛍光の白表示され、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここで使用される感染症法は2-3 DPF胚および幼虫において最初にローカライズされた感染に対する宿主の免疫応答の研究のために有用である。そのような耳胞などの閉じた空洞内の感染症などの炎症性刺激、の焦点は、好中球およびマクロファージ走化性および食作用の研究を可能にします。耳胞に細菌を注入する一つの注意点は、効率的に液体で満たされたキャビティ内の細菌を貪食する好中球の能力は、特定の微生物に依存し得るということである。 大腸菌や枯草菌が簡単に耳胞28中の好中球によって貪食されていませんが、我々は、好中球は、 緑膿菌とS.両方を貪食することができることを発見したこの場所16、24でイニエ 。種々の病原体の侵襲性を研究する際に局所感染にも便利です。 iの後の全身感染を引き起こすために閉じられたキャビティ内にnjectionなど耳胞として、微生物は、物理ホストの障壁を横断することができなければならない。あるいは、異なる病原体は感染の初期部位からの輸送と普及のための宿主細胞に依存してもよい。これは、変更された病原性の菌株を比較するためのローカライズされた注射が有用になる。
マイクロインジェクションの間、沈降および各条件の後、または約50幼虫後のいずれかの針、変更針を詰まら細菌を回避する。これは、針でサスペンションがより均一であることを確認するのに役立ちます。針中の細菌の沈降が問題であると思われる場合は、PBS、2％PVP40、及び10％グリセロールの混合物は、均質な懸濁液を保つのを助けることがあります。各幼虫が細菌のほぼ同じ数の注入されていることを確認するために、注射後とCNA寒天上ホモジネートをメッキすぐに幼虫を均質化することによって、CFU数を確認してください。 CNA寒天だけでなく、培養可能なグラム陽性菌の増殖のために選択するS.イニエが、それは、注入用量は、個々の幼虫の間でどのように一貫性のあるのアイデアを提供します。幼虫あたり100 CFUの目標接種では、CNAプレート上で一般的に75〜150の間にコロニーがあります。非S.数ほとんどのPBSを注入された魚は通常0-20コロニーの間で発生するので、CNAプレート上で生育イニエグラム陽性コロニーは、おそらく非常に低い。感染の間の後の時点で、同じ感染用量に感染した幼虫の間のコロニー数の半対数までのバリエーションが存在することがまれではない。これは、感染を制御する能力が個々の幼虫の間にわずかな違いを表すことができ、または幼虫またはE3培地で培養可能なグラム陽性細菌の量の差を反映し得る。
耳胞に注入しながら、これは、キャビティが破裂する原因と大きすぎる体積又は高すぎる圧力を注入しないことが重要である。注入ボリューム翔約1 NLに抑えることがULD。針が大きすぎる場合、マイクロインジェクションは、感染部位に対する宿主の白血球の動員に影響を与え得るか、細菌が耳胞から漏出することを可能にする、周囲の組織への損傷を引き起こす可能性がある。正しい空間に注入を確認することも重要である。針が深すぎる挿入されている場合、それは、耳胞を通して突くもあれば、耳のベシクルの周りを流れる血管を打つことがあります。これは血流中または宿主応答を変化させることができる小胞、外細菌の沈着をもたらし得る。
これは、針が抽出された場合コルッチ-Guyonのら 28によって示されるように、いくつかの細菌が誤って耳胞の外側に堆積させることができることも可能であるが、我々は、注射の5％未満における場合にこれを見つける。耳の小胞の中心に注入しようとすると、このような状況を回避するのに役立つことがあります。成功した感染症では、耳の小胞は、Wを埋める必要がありますフェノールレッド染料番目が、色素が周囲の組織に漏出しないようにしてください。でも誤注入された幼虫はすぐに破棄してください。ラベル細菌を注入することに成功注射（ 図1B）を確認に便利な方法です。 CellTracker色素を使用することの欠点の1つは、細菌が分裂するように、この色素は、最終的には、蛍光下で可視化された細菌を防ぐ、希になることである。我々は我々の研究の大半を緑で標識された好中球やマクロファージトランスジェニック系統を使用しているため私たちは、赤色染料を選んだ。
Dendra2はoctocoral Dendronephthya sp。由来の photoconvertibleタンパク質である。その405 nmのレーザー29と赤色蛍光の状態に緑色からphotoconvertedすることができます。この光変換は、細胞をマークし、感染の過程で彼らの運命を追跡するための非侵襲的な方法です。感染部位に動員白血球はphotoconvertedとそのDを監視するために経時的に追跡することができます宿主組織を通してissemination（ 図3）。また、白血球は感染前にphotoconverted、その後感染部位に動員細胞の起源を決定するために、ポストマイクロインジェクションをモニターすることができた。ラベリング細菌や免疫細胞は募集と食作用（ 図1Bおよび図2）を含む、 生体内で白血球-病原体相互作用の研究を可能にします。赤い標識S.の区別photoconverted白血球の赤色蛍光からイニエは困難であるので、異なる蛍光CellTracker色素を使用することができる。これはSを含む耳胞を残すphotoconverted免疫細胞のかを決定するために特に有用であるイニエ 。
耳のベシクル感染法の将来のアプリケーションは、好中球およびマクロファージは、さまざまな感染症に反応して移動することで、速度と方向性を測定することを含む可能性があります。感染Kineticsはまた、細胞型は最もロバスト細胞が由来する場所またはそれらが30発信先だけで動員される感染部位とこれに到着する最初のある細胞タイプ見て研究することができる。最初に局所感染に動員を研究に加えて、この感染モデルは、初期感染の間、宿主の免疫系成分の機能を研究するために使用することができる。特定のRNAを標的とするアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドは、Toll様受容体、サイトカイン受容体及び白血球を含む宿主の免疫成分の発現をノックダウンするために使用することができ、およびCRISPR-CasのまたはTALEN技術は、遺伝的変異体を作成するために使用することができる。 RNAseqまたは定量PCRを用いて遺伝子発現はまた、感染に応答して、特定の宿主遺伝子の発現を特徴付けるために使用することができる。
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Acknowledgments
著者らは、ゼブラフィッシュのケアとメンテナンスのために研究室のメンバーに感謝したいと思います。この作品は、アンナHuttenlocherにEAハービーとNIH R01GM074827に国立衛生研究所、国立研究サービス賞A155397によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml Eppendorfs | MidSci | AVSS1700 | |
| 14 ml Falcon tube | BD Falcon | 352059 | |
| 27 G x ½ in. needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 96-well Plate | Corning Incorporated | 3596 | |
| Agar | BD Biosciences | 214030 | |
| CellTracker Red | Molecular Probes, Invitrogen | C34552 | |
| CNA agar | Dot Scientific, Inc | 7126A | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-7m | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Ethanol 200 proof | MDS | 2292 | |
| Fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gel comb | VWR | 27372-482 | 4.2 mm width, 1.5 mm thick |
| Glass bottom dishes | Custom made by drilling a 16 - 18 mm hole in the center of a 35 mm tissue culture dish bottom and placing a 22 mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light. | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| High melt agarose | Denville Scientific, Inc. | CA3510-6 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | with FV-1000 system | |
| Low melt agarose | Fisher | BP165-25 | |
| Magnetic stand | Tritech (Narishige) | GJ-1 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipet tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | Tritech (Narishige) | M-152 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Nanodrop spectrophotmeter | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 100 x 15 mm |
| Phenol | Sigma Aldrich | P-4557 | |
| Phenol Red | Ricca Chemoical Company | 572516 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Potassium hydroxide | Sigma Aldrich | P-6310 | |
| Pronase | Roche | 165921 | |
| Protease peptone | Fluka Biochemika | 29185 | |
| Small cell culture dish | Corning Incorporated | 430165 | 35 x 10 mm |
| Sudan Black | Sigma Aldrich | S2380 | |
| Thin wall glass capillary injection needles | World Precision Instruments, Inc. | TW100-3 | |
| Todd Hewitt | Sigma Aldrich/Fluka Analytical | T1438 | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | Argent Chemical Laboratory/Finquel | C-FINQ-UE-100G | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast extract | Fluka Biochemika | 92144 |
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