Abstract
수생 병원균, 연쇄상 구균 iniae은 양식 산업의 연간 손실이 1 억 달러 이상을 담당하고 물고기와 인간 모두에서 전신 질환을 야기 할 수있다. S.의 이해 iniae 질환 발병 적절한 모델 시스템이 필요합니다. 형광 면역 세포를 태그와 함께 유전의 취급 용이성 및 제브라 피쉬의 초기 발달 단계의 광학 투명성이 유전자 변형 라인의 생성과 비 침습 이미징 할 수 있습니다. 몇 주 수정을 게시 할 때까지 적응 면역 시스템이 정상적으로 작동하지 않습니다,하지만 제브라 피쉬의 유충은 호중구와 대 식세포 모두 보존 된 척추 동물의 선천성 면역 시스템을 가지고있다. 따라서, 유충 감염 모델의 생성을 제어 S. 선천성 면역의 특정 공헌 연구를 허용 iniae 감염.
미세 주입의 사이트는 감염 여부를 확인할 수 있습니다전신 또는 처음 지역화. 여기서 우리는 귀의 소포 제브라 피쉬 세 2~3일 게시물 수정의 주입뿐만 아니라 감염의 형광 공 초점 영상에 대한 우리의 기술에 대한 우리의 프로토콜을 제시한다. 지역화 감염 사이트는 초기 미생물의 침략의 관찰, 숙주 세포의 모집 및 감염의 보급을 할 수 있습니다. S.의 제브라 피쉬 애벌레 모델을 사용하여 우리의 연구 결과 iniae 감염 지브라 피쉬 지역화 세균 감염에 호스트 호중구 및 대 식세포의 상이한 기여를 조사하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 우리는 면역 세포 photolabeling 감염 과정 동안 개별 숙주 세포의 운명을 추적 할 수있는 방법을 설명한다.
Introduction
스트렙토 iniae 물고기와 인간 모두에서 1 전신 질환을 야기 할 수있는 큰 수생 병원체이다. S. 동안 iniae은 양식업에 큰 손실을 책임지고 또한 다른 구균 인간 병원체에 의해 발생 된 것과 유사한 임상 병리 호스트 인간 면역 질병을 일으킬 수있는 잠재적 인 동물 매개 병원체이다. 인간의 병원체와의 유사성을 감안할 때, 그것은 S.을 연구하는 것이 중요하다 자연 숙주의 맥락에서 iniae 질환 발병. 미국의 성인 제브라 피쉬 모델 iniae 감염은 감염의 지역화 된 사이트뿐만 아니라 죽음을 호스팅 할 빠른 시간에 호스트 백혈구의 강력한 침투를 밝혀, 너무 짧은 시간은 적응 면역 시스템 (7)을 포함합니다. 얻기 위해 심도 S.에 대한 선천성 면역 반응을 조사 생체 내에서 감염 iniae, 그것은 N 더 의무가 모델을 사용할 필요가있다에 침습 라이브 영상.
유생 지브라 피쉬는 호스트 병원체 상호 작용을 연구하는데 더욱 매력적인 척추 동물 모델 만드는 장점을 가진다. Zebrafish의 사용 및 포유 동물 모델에 비해 유지 보수가 상대적으로 저렴하고 쉽습니다. 적응 면역 4-6 주 후 수정까지 기능적으로 성숙이 아니라 애벌레 식균 작용 및 호흡기 버스트 2-6을 포함하여 항균 기능을 보완, 수신자 같은 수용체, 사이토 카인, 호중구와 대 식세포와 고도의 보존 척추 동물의 선천성 면역 시스템을 가지고, 8-11. 또한, 취급 용이성 및 유전 배아 발달 및 유생의 광학적 투명도와 형광 표지 된 면역 세포가 생체 내에서 가능한 실시간 호스트 병원체 상호 작용을 조사 할 수있게 안정적으로 형질 전환 계통의 생성을 허용한다. 같은 덴 같은 photoconvertible 단백질을 사용하여 이러한 유전자 변형 라인의 세대dra2 감염 (12)의 과정을 통해 개별 숙주 세포의 기원과 운명의 추적 할 수 있습니다.
제브라 피쉬의 유충 감염 모델을 개발하는 경우, 미세 주입의 선택이 사이트는 감염 초기에 지역화 또는 전신 여부를 확인할 수 있습니다. 꼬리 정맥 또는 퀴비에의 덕트로 전신 혈액 감염은 가장 일반적으로 제브라 피쉬의 미생물 병원체를 연구하는 데 사용 및 병원체 균주 사이의 독성에 호스트와 미생물 세포, 사이토 카인 응답 및 차이 사이의 상호 작용을 연구하는 데 유용합니다. 느리게 성장하는 미생물, 16-1,000 세포 단계에서 배아 난황낭에 이른 주입 사이 인 것으로 밝혀 느리게 성장하는 미생물의 마이크로 인젝션 최적 발달 단계와, 전신 감염 13,14을 생성하기 위해 사용될 수있다 16-128 세포 단계 (15). 그러나 호스트 개발 후기 단계에서 많은 미생물의 주머니 주사 노른자는 t에 치명적인 경향이있다그는 백혈구 16-18 침투의 미생물 및 부족에 대한 영양이 풍부한 환경으로 인해 호스트.
국소 감염은 일반적으로 쉽게 비 침습성 영상화로 정량화 할 수있다 감염 부위쪽으로 향하는 백혈구 이동을 초래한다. 감염이 유형의 백혈구 이동뿐만 아니라 다양한 백혈구 집단의 상이한 이동성 및 포식성 조사 기능을 중재 메커니즘의 절개를 허용 할 수있다. 균주 사이의 독성의 차이를 검사뿐만 아니라 물리적 호스트 장벽이 전신이 될 지역화 감염에 대한 교차해야하기 때문에 미생물의 침입 메커니즘을 연구 할 때 현지화 감염도 유용하다. 제브라 피쉬는 전형적 25-31 °의 C (19)의 온도로 승온되어 있지만, 그들은 또한 엄격한 온도 요구와 인간의 특정 병원균의 침입에 대한 연구의 34 ~ 35 ° C의 높은 온도에서 유지 될 수있다독성 20, 21.
많은 다른 사이트 후뇌 심실 22, 꼬리 지느러미 근육 18 심낭 캐비티 (23), 및 귀의 소포 (EAR) 5, 16, 24을 포함한 국소 초기 세균 감염을 생성하는데 사용되어왔다. 그러나, 백혈구 응답 (13)을 조사 할 때 결과를 왜곡 할 수있다 박테리아의 조직 손상과 염증의 독립을 일으킬 수 있습니다 꼬리 근육에 박테리아의 주입을 발견되었습니다. 덜 손상은 후뇌로 주입과 관련된하고 젊은 배아에 백혈구의 초기없는 있지만 미세 아교 세포가 거주를 골라, 후뇌 심실 꾸준히 시간이 지남에 따라 더 많은 면역 세포를 얻게되지만. 후뇌 심실 또한 이미지에 더 어려운 위치입니다. 귀의 소포는 혈관 (25), (26)에 직접 액세스 할 수있는 폐쇄 중공 캐비티입니다. 그것은 레우의 일반적없는 것입니다kocytes하지만 백혈구 감염 같은 염증성 자극에 반응하여 귀의 소포에 채용 될 수있다. 또한 때문에 영상의 용이성과 주입의 시각화 제브라 피쉬 세 2-3일 포스트 수정 (DPF) 박테리아의 미세 주입의 바람직한 사이트입니다. 따라서, 우리는 지역화 된 세균 감염의 사이트로 귀의 소포를 선택했다.
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Protocol
성인 및 배아 제브라 피쉬는 위스콘신 - 매디슨 연구 동물 자원 센터의 대학에 따라 유지했다.
1. 미세 주입 바늘을 준비
- 손잡이 (5), 방송 시간의 시작에서, 속도 (80), 시간 (70), 대기 시간, 공기 압력 (200), 열 (502) (90)를 당겨 : 다음 설정을 마이크로 피펫 풀러 장치를 이용하여 얇은 벽 유리 모세관 주입 바늘 (1.0 OD / 0.75 ID)를 준비 풀 5의 끝에서.
- 선단 개구는 약 10 ㎛의 직경을 갖도록 뽑아 바늘의 선단을 끊는 미세 핀셋을 사용.
2. 준비 애벌레 사출 요리
- 멸균 물에 약 4-5mm의 차선 폭 젤 빗 세척하여 건조 할 수 있습니다.
- 솔루션이 깨끗해질 때까지 E3 매체 (19)와 전자 레인지의 1.5 % 높은 용융 아가로 오스 솔루션을 준비합니다. 냉각되면, 페트리 접시 (100 × 15mm)과 소용돌이에 아가로 오스의 일부를 부어,충분한 아가 로스를 첨가하여 완전히 접시의 저면을 덮도록.
- 아가로 오스 층이 응고되면 비 벌집 모양의 끝이 바로 페트리 접시의 상단에 휴식하고 빗질 끝이 아가로 오스를 만지고 있도록 상단에 헹구고 건조 겔 빗 놓습니다. 아가 저부 층에 대하여 30 °의 각도를 만드는, 빗 가능한 한 수평인지 확인.
- 신선한 아가 층은 빗의 웰을 덮도록 빗과 하단 아가 층 사이의 계면에서 아가 로스의 추가적인 소량 붓는다. 빗를 제거하기 전에 완전히 식을 때까지 기다리십시오. 피펫 팁을 사용하여 우물에서 아가로 오스의 돌출 부분을 제거합니다.
- 4 ° C에서 사출 금형 및 저장의 상단에 E3 매체를 따르십시오.
- 각 사용하기 전에 주입하기 전에 시간 이상 28.5 ° C에서 신선한 매체와 따뜻한 주입 램프로 교체합니다.
- 직전에 주사에, 함께 주입 램프에 E3를 대체200 ㎍ / ㎖의 에틸 3- 아미노 벤조 에이트 (tricaine)를 함유 E3 매체.
3. S. 준비 iniae 접종
- 0.2 % 효모 추출물 및 2 % proteose 펩톤 (네 + P)로 보충 토드 휴이트 국물 매체를 준비하고 오토 클레이브 : 30g / L 토드 휴이트, 2g /의 L 효모 추출물, 20g / L의 proteose 펩톤. 한천 플레이트를 들어, 14g / L의 한천을 추가합니다.
- 밀봉 된 15 ML 튜브에 THY + P 배지 10 ㎖에 얼어 붙은 세균 주식의 100 μL 나누어지는을 피펫 팅에 의해 감염되기 전에 박테리아 문화를 밤을 준비합니다. 37 ℃에서 교반없이 밤새 품어. 성장의 14 ~ 16 시간 후, 냉동 주식을하거나 주사에 사용하기 위해 준비 중 하룻밤 문화를 사용합니다.
- 1.7 ㎖의 원심 분리 관에 80 % 글리세롤의 500 μL에서 하룻밤 문화 1 ㎖를 배치하여 냉동 주식을합니다. 동결 - 해동 사이클을 피하기 -80 ° C에서이 믹스와 상점에서 100 ㎕를 하나 사용 씩을 확인하십시오.
- S. 들어 iniae는 infecti에 사용THY + P 국물의 9.9 ml의 하룻밤 문화의 0.1 ml를 추가하여 10 ml의 문화의 총 부피 100 : 기능은 밤새 문화 1을 희석. 약 4 ~ 5 시간 동안 교반없이 37 ° C에서 성장. Nanodrop 분광 광도계를 사용하여 600 nm에서 광학 밀도 (OD)를 모니터링하고 OD600 체결 토크에 도달 할 때 0.250-0.500 중간 대수 단계에서 박테리아를 수확. 0.250의 OD600 nm의 약 10 8 콜로니 형성 단위 (CFU) / ㎖에 해당합니다.
- 5 분 동안 1,500 XG에 1.7 ml의 원심 분리 관에 세균 배양액 1mL 펠렛. 신선한 PBS와 반복 1 ㎖에 재현 탁. PBS에서 박테리아의 OD600의 나노 측정, PBS의 펠렛 및 재현 탁 원하는 농도를 달성하기 위해.
- , 마이크로 인젝션의 시각화에 도움을 0.1 %의 최종 농도를 위해 주 사전에 세균 현탁액에 페놀 레드를 추가한다.
- 열 살해 박테리아의 주입을 포함하는 실험에서, 30 분 동안 95 ° C에서 PBS에서 박테리아를 가열한다.열 죽이는 과정은 고체 THY + P 한천 플레이트에 주입 부피 (약 1 NL)을 도금하고 37 ℃에서 하룻밤 배양에 의해 발견 할 수없는 수준으로 실행 가능한 박테리아의 수를 감소 있는지 확인합니다.
4. 레이블 S. CellTracker 적색 형광 염료와 inia 전자
- 세균 세포를 살아있는 레이블, 형광 염료 CellTracker 상당의 스톡 용액을 제조 하였다. 사용 된 염료 분말 20 × 50 μg의 분취오고 DMSO 중에 재현 탁 될 필요 바와 같이, 10 mM의 스톡 농도를 얻기 위해 튜브에 7.3 μL DMSO를 추가한다.
- 세포 얼룩 낮은 최적 농도를 결정 박테리아 염료 농도 (예를 들면, 0.5-25 μM)의 범위를 테스트한다. 빠르게 나누어 세포와 더 이상 실험은 염료의 높은 농도를 필요로 할 수있다.
- (제 3) 상술 한 바와 같이 원심 분리에 의해 1.7 ㎖의 튜브에 세균 배양의 1.0 ml의 펠렛. 1의 펠렛을 재현 탁신선한 PBS를 ml의 세균 배양에 염료의 적절한 볼륨을 추가합니다.
- 30 분 동안 37 ℃에서 교반하지 않고 배양한다. 미리 예열 THY + P 국물의 1 ml의 세균에 resuspend를 스핀 다운, 37 ° C에서 추가로 30 분 동안 교반하지 않고 배양한다.
- 박테리아를 스핀 다운 및 OD600의 나노 측정과 (섹션 3) 위에 설명 된대로 미세 주입에 대한 세균을 희석하기 전에 PBS로 두 번 씻는다. 우리는 일반적으로 백혈구 모집 및 식균 작용의 우리의 연구에 1 NL 사출 볼륨에서 약 100 CFU를 주입.
감염에 대한 Zebrafish의 유충 5. 준비
- 전날 밤 번식 쌍을 설정하고 감염 준비가 될 때까지 28.5 ° C에서 E3 매체에서 로젠 등. 27 품어 배아에 의해 설명 된 배아를 수집합니다.
- 이미지화 지브라 피쉬를 들어, 페닐 티오에 N - (PTU)을 첨가하여 안료 (melanization)의 발생을 예방0.2 nm의 최종 농도에 대한 24 시간 게시물 수정 (HPF)에서 E3 매체.
- 배아와 관련된 감염의 경우 수동으로 미세 핀셋으로, dechorionate 배아를 2 DPF 세. 또는, E3을 제거하고 약 5 분 동안 또는 부드러운 피펫 팅까지 프로 나제 (2 ㎎ / ㎖)로 대체하여 dechorionate 배아에서 배아 융모막 나누기. 대부분의 유충은 3 DPF에 의해 자연적으로 부화한다.
- 200 ㎍ / ㎖의 tricaine을 포함 E3 매체에 dechorionated 유충을 배치하여 이전에 감염 제브라 피쉬 몇 분 정도 마취.
S. 6. 귀의 소포 주입 세 가지 일 이전 애벌레로 iniae
- 마이크로 인젝터를 켜고 "밀리 초"까지의 시간 범위를 설정합니다. 라인 내로 가스를도록 이산화탄소 탱크 밸브를 열어. 마이크로 인젝터의 압력은 약 20 PSI를 읽어야합니다. 증분의 검은 마디 노브를 시계 방향으로 돌려 마이크로 인젝터 장치의 압력을 조절감소 압력 회전 반 시계 방향으로 압력 또는 완화.
- 준비 S. 와동 페놀 빨간색과 PBS와 microloader 팁을 사용 iniae 문화 뽑아 모세 혈관 주사 바늘로 문화의 2-3 μl를로드합니다.
- 바늘이 현미경의베이스에 대해 45-65 ° 각도가 대략되도록 실체 현미경 스탠드와 자기 위치를 미세 조작기에 연결로드에 바늘을 탑재.
- 마이크로 인젝터의 발 페달을 눌러 바늘의 끝 부분에 접종 한 방울을 분배합니다. 현미경의 접안 렌즈에 눈금 막대를 사용 방울의 직경을 측정한다.
- 대안 적으로, 스케일 바 유리 현미경 슬라이드에 미네랄 오일 방울의 체적에 주입함으로써 방울의 직경을 추정한다. 방울의 직경은 1 NL 체적에 대해 약 0.10 mm이어야한다.
- 설정의 시간을 조정함으로써, 입자경을 조정할마이크로 인젝터 또는 미세 핀셋으로 바늘 끝의 더를 클리핑하여. 너무 많은 조직의 손상을 발생하지 않도록하기 위해 35 밀리 초 - 주입 시간이 20 사이 여야합니다.
- 플라스틱 이전 피펫을 사용하여, 전사 12 사출 금형의 각 웰에 애벌레를 마취시켰다.
- 잘의 왼쪽에있는 머리는 현미경과 난황 주머니의 뒤쪽으로 지적 될 수 있도록 부드럽게 애벌레의 위치를 유리 막대, 헤어 루프, 또는 플라스틱 팁을 사용합니다. 천장을 향해 유충 최대의 왼쪽 귀를 가리 킵니다.
- 실체 현미경의 접안 렌즈를 통해 보면, 모두 같은 시야에 있도록 귀의 소포로로드 된 바늘을 줄을 미세 조작기에있는 노브를 사용합니다. 피어스 바늘 끝과 귀 소포의 외부 상피층이되도록 바늘 끝은 소포 내에.
- 풋 페달에 눌러 S. 원하는 용량의 1 NL을 주입하는 iniae. 를 사용하십시오압력이 낮은 경우 공동 파열되지 않도록. 주입이 완료되면 귀의 소포 아니라 주변 조직은 페놀 레드 균액 (도 1 AI)로 기입한다. 즉시 주입 판에서 모든 잘못 주입 물고기를 제거합니다.
- 조심스럽게 유충에서 바늘을 철회하고 다음 유충이보기에 있도록 손으로 주입 판을 이동합니다. 5 배에서이 작업을 수행합니다.
참고 : 바늘의 후퇴 생존과 백혈구 모집 결과를 왜곡 할 수있다 귀의 소포의 외부 일부 박테리아의 증착 될 수 있습니다. 이를 미연에 방지하기 위해서는 형광 염료로 표지 된 박테리아를 주입 시각적이 발생하는 유충을 제거하기 위해 형광 현미경으로 주입 유충을 검사하는 것이 좋습니다. 제대로 주입 유충 (그림 1 BI)에 표시됩니다. - 주입 부피 / 접종 실험에 걸쳐 동일하게 유지되도록하기 위해, 박테리아의 방울을 분사매 48 번째 배아 후 멸균 PBS 100 ㎕를 함유하는 1.7 ml의 원심 분리 튜브에 uspension. 주입 부피에서 CFU를 결정하기 위해 37 ℃에서 하룻밤 THY + P 한천 플레이트에 100 μL를 접시.
- 사출 램프에 12 애벌레의 전체 그룹이 주입되었을 때,주의 깊게 우물에서 애벌레를 제거하고 새로운 배양 접시 (35 X 10mm 2)에 올려 놓으 플라스틱 전송 피펫을 사용합니다. tricaine 솔루션을 제거하고 유충은 복구 할 수 있도록 약 2 ml의 신선한 E3 매체의 교체.
- 피펫은 96 웰 플레이트의 단일 우물에 유충을 주입 28.5 ° C에서 품어. 이 판에서 생존을 위해 시간이 지남에 유충을 모니터 또는 영상 또는 CFU 카운트 나중에 제거합니다.
호중구의 7 수단 블랙 염색
주 : 다음 단계는 구약 않는 진탕에 작은 페트리 접시 (35 X 10mm 2) 실온에서 수행 할 수 있습니다herwise는 말했다. 각 단계에 대해 사용될 시약의 양은 완전히 유충을 덮도록 충분한 액체를 사용하여 접시 당 2 ml의 약이다.
- 감염된 유충 정용, E3 배지를 제거하고 PBS 용액에 빙냉 4 % 파라 포름 알데히드로 대체 유리 파스퇴르 피펫을 사용한다. 즉시 안락사 4 ° C에서 물고기를 배치합니다. 4 ℃에서 하룻밤 수정합니다.
- 5 분마다 PBS에서 3 회 반복한다.
- 5 시간 30 분 : 수단 블랙으로 얼룩 (70 % 에탄올, 0.1 % 페놀 5 0.18 %의 주식은 1 희석). 호중구 과립이 얼룩을 가지고 있는지 확인하려면, 실체 현미경을 사용합니다.
- PBS에 최종 세척 한 다음 70 % 에탄올과 PBS의 비를 1 : 1로 세척 한 다음 70 % 에탄올로 단일 세척부터 5 분간 세척의 시리즈를 수행.
- PBS 플러스 0.1 % 트윈 (PBT)에 재수.
- 유충 안료를 제거하려면, 약 60-10 분 동안 1 % 수산화 칼륨 / 1 % 과산화수소 중에서 세척 하였다. 샘플 closel 모니터Y 약 5 분 후, 삭제 얼마나 많은 안료의보고 실체 현미경을 이용하여 유충을 확인합니다. 용액이 너무 오래에 남아있는 경우, 난황 주머니가 부풀어 버스트 것입니다.
- PBS로 5 분간 3 회를 씻으십시오.
- 이미지에 준비가 될 때까지 최대 1 주일 동안 4 ° C에 PBS 또는 PBT 하나의 샘플을 저장하고 계산합니다.
- 이미지 수단 블랙 염색 유충, PBT로 물고기를 전송 한 후 80 % 글리세롤로 단일 캐비티 우울증 슬라이드에 배치합니다. 위치 피펫 팁을 사용하여 입체 현미경 유충을 고정. 실체 현미경에 (그림 1 AII-IV)을 컬러 디지털 카메라를 사용하여 이미지.
감염된 유충에서 실행 가능한 박테리아의 8 열거
- 원하는 시간 E3 매체 tricaine의 빙냉 200-300 ㎎ / L 용액에 감염 골대 유충 안락사.
- 피펫은 1.7 ml의 원심 분리기 튜브에 유충을 안락사. tricaine 솔루션을 제거하고 0.2 % 100 ㎕로 교체PBS의 트리톤 X-100 (PBSTx).
- 27 G 바늘을 통해 위아래로 10 회를 전달하여 유충을 균질.
- 멸균 PBS에서 균질의 연속 희석을 준비합니다. 예를 들어, 감염성 투여 량은 100 CFU, 900 μL 피펫 멸균 PBS로 파쇄 액 100 ㎕ 경우. 새로운 피펫 팁을 사용하여 900 ㎕를 멸균 PBS에 희석 된 균질의 100 μl를 전송합니다.
- 플레이트 (100) 그람 양성 박테리아의 선택적 분리를위한 컬럼비아 CNA 한천 희석 μL, 48 시간 동안 37 ° C에서 배양한다. 이 매체는 모두 그람 음성 및 그람 양성 박테리아의 성장을 지원하는 THY + P 한천 플레이트,보다 더 큰 선택을 제공 할 것입니다.
- 500 개 미만의 개별 콜로니 플레이트에서 콜로니의 수를 계산하고 CFU의 수를 결정하기 위해, 희석 배수를 곱하여.
이미징 애벌레 9. 고정
- 드 등의 PBS 용액에 빙냉 4 % 파라 포름 알데히드에 고정 유충7 장에서 스 크라이 빙.
- 실온에서 촬상 전에 PBS로 5 분간 3 회 씻는다.
라이브 영상에 대한 애벌레 10. 준비
- 용액이 깨끗해질 때까지 전자 레인지 가열에 의해 E3에서 1.5 % 저 융점 아가로 오스 용액을 준비한다.
- 이 멋진하지만 강화하지 수 있도록 55 ° C의 물을 욕조에 아가로 오스 솔루션을 놓습니다.
- 0.016 %의 최종 농도로 아가로 오스에 추가 tricaine.
- 플라스틱 전송 피펫을 사용하여, 실체 현미경의 무대에 유리 바닥 접시에 4-5 마취 유충을 배치합니다.
- 55 ° C의 물을 욕조에서 tricaine와 아가로 오스 솔루션을 제거하고 1-2 분 동안 실온에서 냉각을 할 수 있습니다. 아가로 오스가 냉각되는 동안, 가능한 한 마취 유충에서 많은 액체를 제거합니다.
- 표면의 약 절반이 덮여 때까지 접시에 아가로 오스 냉각 붓는다. 아가로 오스를 확산 접시를 소용돌이. 참고 아가로 오스 경우너무 뜨거운, 그것은 유충을 죽일 것이다. 아가로 오스가 너무 접시에 첨가되는 경우, 아가 로스를 통해 포커싱 또한, 현미경의 대물 렌즈는 접시의 바닥에 충돌 할 수있다.
- 전송 피펫을 사용하여 요리의 측면에 떠있는 유충을 선택하고 다시 센터에 그들을 피펫.
- 모발 루프 긴 피펫 팁 또는 유리막 원하는 실체 현미경을 부드럽게 유충 위치. 왼쪽 귀 소포가 접시의 바닥에 평평하게되도록 귀 소포의 영상화, 유충 위치.
- 접시를 이동하기 전에 약 10 분 동안 아가로 오스 멋진하자. 아가로 오스가 고체가 아닌 경우 유충 위치를 이동할 수 있습니다. 부드럽게 촉촉한 그것을 유지 아가 층의 상부 일부 tricaine 및 E3 용액을 피펫.
감염의 11 공 촛점 이미징
- FV-1000 레이저 스캐닝 confoca와 거꾸로 현미경의 무대에 유충으로 유리 바닥 접시를 놓습니다L 시스템.
- 200-300 μm의 핀홀을 설정하고, 개구 수를 3-6 μm의 슬라이스 Z-스택을 설정 0.75 / 20X 대물 렌즈를 이용.
- 각 채널에 대한 레이저 파워 검출기 이득을 조정하도록 연속 주사 라인을 사용한다.
- 각각의 형광 채널에 대한 순차적 인 라인 스캔을 사용하여 (예를 들어, 488 및 543 ㎚) 및 차등 간섭 대비 (DIC)은 호중구 초기 모집 및 식균 작용을 관찰하기 위해 2-6 시간 동안 왼쪽 귀의 소포의 시간 경과 영화 매 3 분 실시 대 식세포. 긴 시간 코스의 경우, 아가로 오스에서 증발과 건조를 방지하기 위해 페트리 접시에 뚜껑을 배치합니다.
- 20 배 또는 40 배 배율 (그림 2) 유충을 여전히 고정 (그림 1B)의 이미지를 획득 또는 살고있다.
귀의 소포의 Dendra2 표지 백혈구의 (12) 광
참고 : Dendra2 빨간색 형광 녹색에서 photoconverted 수 있습니다1 분 동안이자 (ROI)의 영역에 405 nm의 레이저 (50-70% 레이저 파워 충분합니다)를 중심으로. 이하 FV-1000 레이저 스캐닝 공 초점 현미경에 사용되는 단계별 프로토콜이다 :
- 488 nm에서 543 nm의 레이저와 Z-스택 검사를 사용하여 샘플을 시각화. 레이저 파워 검출기 이득을 조정하기 위해 연속적인 라인 스캔을 사용한다. 어떤 실수 photoconverted 적색 형광이없는 있는지 확인하십시오.
- "이미지 수집 제어"창에서, "자극 설정"에서 "사용 스캐너"도구를 선택하고 "주"를 선택합니다. 405 nm의 레이저를 선택하고 70 %의 전력으로 설정합니다. 원형 옵션을 사용하여 귀 소포에서 ROI를 정의한다.
- "자극 시작 설정"에서 1 프레임의 사전 활성화 및 60,000 밀리의 활성화 시간 "시리즈의 활성화"를 선택합니다. "제목 시간 스캔"에서 "취득 설정"창에서, 2를 선택0시 1분 0초 (전 하나 하나 포스트 광에 대한)의 tervals.
참고 : 시간 경과 시리즈 스캔이 완료되면, Dendra2가 그 적색 형광 상태로 photoconverted되어 있어야합니다. - photoconverted 적색 형광뿐만 아니라 남아있는 녹색 형광 (그림 3)를 시각화하기 위해 488 nm에서 543 nm의 레이저를 사용하여 Z-스택에 의해 샘플을 검사합니다.
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Representative Results
S.의 미세 주입 처음 지역화 된 호스트 응답에 귀의 소포로 iniae (그림 1과 그림 2) 결과. 정확하게 주입되면, 세균은 귀의 소포에 아닌 주변 조직 또는 혈액으로 이해되어야한다. 이는 페놀 적색 염료를 (도 1a)를 사용하여 마이크로 인젝션 중에 가시화 될 수있다. 레이블이 박테리아가 주입되는 경우 또는 감염 유충의 빠른 검사는 즉시 박테리아는 귀의 소포에 아닌 주변 조직 (그림 1B)이다 확인할 수 주입을 게시 할 수 있습니다. 비록 10 CFU 야생 유형 S.만큼 작은 용량 iniae은 24 ~ 48 시간 게시물 감염 (HPI), avirulent 변형, CPSA의 1,000 CFU의 주입에서 치명적인 감염을 구축 할 수있다, 치명적인 감염을 초래할 및 그 변형은 호스트 (24)에 증식 할 수없는 것 같습니다하지 않습니다. 따라서,이 국소 감염 모델 differentiat 수변경된 독성의 균주 사이의 전자.
초기에 국소 감염의 미세 주입 사이트는 백혈구 주 화성을 연구하는 데 유용합니다. 백혈구 모집 호중구 과립의 수단 블랙 염색 (그림 1A) 또는 형광 유전자 변형 라인 (그림 1B)의 포름 알데히드 고정 중 하나에 의해 정량화함으로써 수 있습니다. 모집 및 면역 세포의 탐식 기능을 시각화하기 위해, 우리는 특히 대 식세포에서 녹색 형광 단백질 Dendra2을 표현하는 유전자 변형 라인을 사용 Tg는 (MPEG1 : dendra2) (24) 또는 호중구의 Tg (MPX : dendra2) 12. 시 S. iniae이 3 DPF 유충의 귀의 소포에 주입, 모두 호중구와 대 식세포가 빠르게 처음 2 HPI (그림 1)에서 모집한다. 정확하게 수행 그러나, 귀의 소포 내로의 마이크로 인젝션은 PBS (호스트 백혈구 같은 견고한 채용 초래하지 않는다
그림 2 : S.의 탐식 귀의 소포에서 식세포에 의해 iniae 형질 전환 MPX :. dendra2 (A) 또는 MPEG1 : dendra2 (B)는 유충 빨간색 표지 S. 감염 iniae는 (마젠타에 도시) 및 레이저를 사용 scann 후 60 분 동안 감염에 결상공 초점 현미경을 보내고. 스케일 바, 30 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : S.와 귀의 소포 5 HPI에서 대 식세포의 광 iniae. 원 (A)에 의해 지정된 귀에서 소포 (녹색에 도시) 식세포, 공 초점 현미경에 405 nm의 레이저를 사용하여 (B) photoconverted 시간 동안 추적 하였다. 24 HPI으로 (마젠타에 도시)까지 트렁크 / 꼬리 조혈 조직 (C)로 마이그레이션 한 대 식세포를 photoconverted; 스케일 바, 50 μm의. C의 박스 영역의 높은 배율이 (i)과 (ii), 스케일 바은 30㎛에 도시된다; 화살표는 photocon를 가리변환 된 대 식세포. Photoconverted 세포가 있기 때문에 488 nm의 녹색 형광 남아있는 병합 543 nm의 적색 형광 및 흰색 나타납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 사용되는 감염 경로는 2-3 DPF 배아 및 유충의 초기에 국소 감염에 대한 숙주 면역 반응의 연구에 유용합니다. 이러한 귀의 소포와 같은 밀폐 된 공동의 감염으로 염증 자극,의 초점은 호중구와 대 식세포 화성과 식균 작용의 연구에 있습니다. 귀의 소포에 박테리아를 주입 한 가지주의 할 점은 호중구의 기능을 효율적으로 유체로 채워진 공동의 탐식 박테리아가 특정 미생물에 의존 할 수있다 할 것입니다. 대장균 및 바실러스 서브 틸리 쉽게 귀의 소포 (28)의 호중구에 의해 포식되지 않지만, 우리는 호중구가 녹농균 및 S. 모두를 탐식 할 수있는 것을 발견했다 이 위치 16, 24에 iniae. 각종 병원균의 침입을 연구 할 때 현지화 감염도 유용하다. 전신 감염 I에 따라 발생하기 위하여폐쇄 공동으로 njection 같은 귀의 소포로, 미생물은 물리적 호스트 장벽을 통과 할 수 있어야합니다. 대안 적으로, 다른 병원체 감염의 초기 위치로부터 수송 및 보급을위한 숙주 세포에 의존 할 수있다. 이 변경된 독성 균주를 비교하는 데 유용 지역화 주사를합니다.
미세 주입하는 동안 정착 및 각 조건 후 약 50 유충 이후에 바늘, 변화 바늘을 막는 박테리아를 방지 할 수 있습니다. 이 바늘에 매달리기보다 균일 보장하는 데 도움이됩니다. 바늘에 박테리아의 정착은 균질 한 현탁액을 유지하는 데 도움이 될 수 있습니다 문제, PBS의 혼합, 2 % PVP40, 10 % 글리세롤을 것 같다합니다. 각각의 유충이 박테리아의 대략 같은 수의 주입되고 있음을 보장하기 위해, 즉시 유충을 균질화 주사를 다음과 CNA 한천에 균질 도금하여 CFU 수를 확인합니다. CNA 한천뿐만 아니라, 배양 그람 양성 박테리아의 성장을 선택할 것이다S. iniae는 있지만, 주사 투여 량은 각각의 유충 사이에 일관된 방법의 개념을 제공 할 것이다. 유충 당 100 CFU의 목표 접종으로, CNA 판에 일반적으로 75-150 사이의 식민지가있다. 비 S.의 수 대부분의 PBS를 주입 물고기는 일반적으로 0-20 식민지 사이에서 발생하기 때문에 CNA의 접시에 성장 iniae 그람 양성 식민지, 아마 매우 낮다. 같은 감염성 투여 감염 유충 집락 사이에 반 로그까지의 변화가있을 때까지 동안 감염 이후 시점에서 일은 드물지 않다. 이것은 감염을 제어하는 능력 개별 유충 간의 약간의 차이를 나타낼 수 또는 유충 또는 E3 배지에서 배양 그람 양성 박테리아의 양의 차이를 반영 할 수있다.
귀의 소포 내로 주입하는 동안,이 공동이 파열 될 수 있으므로 너무 크거나 너무 높은 볼륨 압력을 주입하지 않는 것이 중요하다. 사출 볼륨 우대략 1 NL로 유지 ULD. 바늘이 너무 큰 경우, 마이크로 인젝션은 감염 부위에 숙주 백혈구의 채용에 영향을 미칠 수 있거나 또는 세균 귀 소포 새어도록 허락 주변 조직에 손상을 일으킬 수있다. 그것은 올바른 공간으로 주입을 확인하는 것도 중요합니다. 바늘이 너무 깊이 삽입 될 경우, 귀의 소포 통해 찌를 수 또는 소포 귀 주위를 흐르는 혈관을 칠 수있다. 이는 호스트 응답을 변경할 수있다 혈류 내로 또는 외부 소포 박테리아의 증착을 초래할 수있다.
이것은 바늘이 추출 될 때 콜 루치-귀용 외. (28)에 의해 도시 된 바와 같이, 일부 박테리아는 실수 귀의 소포의 외부에 증착 될 수 있다는 것도 가능하다,하지만 단지 주사 5 % 이하의 경우가이 발견. 귀의 소포의 중심에 삽입하려고하면 이러한 상황을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 성공적인 감염, 귀의 소포는 와트까지 작성해야페놀 빨간색 염료 i 번째,하지만 염료는 주변 조직에 누설하지 않아야합니다. 모든 잘못 주입 유충은 즉시 폐기해야합니다. 레이블이 박테리아를 주입하는 것은 성공적인 주사 (그림 1B)를 확인하는 유용한 방법입니다. CellTracker 염료를 사용하는 단점들 중 하나는 박테리아 결국 형광 하에서 가시화되는 박테리아 방지 분할이 염료로 희석 될 것이다. 우리는 녹색 표지 호중구 및 우리의 대부분의 연구에 대한 대 식세포 유전자 변형 라인을 사용했기 때문에 우리는 붉은 염료를 선택했다.
Dendra2는 octocoral Dendronephthya의 속 유래 photoconvertible 단백질이다. 이는 405 nm의 레이저 (29) 적색 형광 상태로 녹색에서 photoconverted 수 있습니다. 광이 셀을 표시하고 감염에 걸쳐 그들의 운명을 추적하는 비 침습적 방법이다. 감염 부위로 보충 백혈구 photoconverted 및 D를 모니터링하는 시간이 지남에 따라 될 수있다호스트 조직 전반에 걸쳐 issemination (그림 3). 또한, 백혈구 전에 감염에 photoconverted 후 감염의 사이트에 모집 세포의 기원을 결정 후 미세 주입을 모니터링 할 수 있습니다. 라벨 붙이기 세균과 면역 세포 모집 및 식균 작용 (그림 1B 및 그림 2)를 포함하는 생체 내에서 백혈구가 병원균 상호 작용의 연구에 있습니다. 빨간색 표지 S. 구별 photoconverted 백혈구의 적색 형광을 발 iniae 어려워서 CellTracker 다른 형광 염료가 사용될 수있다. 이것은 S.을 포함하는 귀의 소포를 떠나 photoconverted 면역 세포의 결정에 특히 유용 할 것이다 iniae.
귀의 소포 감염 방법의 미래 응용 프로그램은 호중구와 대 식세포는 다양한 감염에 대한 응답으로 이동하는 속도와 방향성을 측정 포함 할 수있다. 감염 Kinetics은 세포 유형은 가장 견고 세포가 발생하는 장소 나 30을 보급 곳에 추가로 모집 감염의 사이트 어느 도착하는 첫번째있는 세포 유형을보고 공부하실 수 있습니다. 국소 감염 초기에 채용 공부 외에도이 감염 모델은 초기 감염시 숙주 면역 시스템 구성 요소의 기능을 연구하는데 사용될 수있다. 특정의 RNA를 대상으로, 안티센스 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드가 수신자 같은 수용체, 사이토 카인 수용체 및 백혈구 등을 포함하는 숙주 면역 구성 요소의 발현 노크하는데 사용될 수 CRISPR를-캐스 또는 TALEN 기술은 유전자 돌연변이를 만드는 데 사용될 수있다. 유전자 발현을 사용하거나 RNAseq qPCR의 감염도에 응답하여 특정 숙주 유전자의 발현을 특징 짓는 데에 이용 될 수있다.
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Acknowledgments
저자는 제브라 피쉬의 관리 및 유지 보수에 대한 실험실 구성원에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 국립 보건원, EA 하비에 국가 연구 서비스 상 A155397 안나 Huttenlocher에 NIH R01GM074827에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml Eppendorfs | MidSci | AVSS1700 | |
| 14 ml Falcon tube | BD Falcon | 352059 | |
| 27 G x ½ in. needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 96-well Plate | Corning Incorporated | 3596 | |
| Agar | BD Biosciences | 214030 | |
| CellTracker Red | Molecular Probes, Invitrogen | C34552 | |
| CNA agar | Dot Scientific, Inc | 7126A | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-7m | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Ethanol 200 proof | MDS | 2292 | |
| Fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gel comb | VWR | 27372-482 | 4.2 mm width, 1.5 mm thick |
| Glass bottom dishes | Custom made by drilling a 16 - 18 mm hole in the center of a 35 mm tissue culture dish bottom and placing a 22 mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light. | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| High melt agarose | Denville Scientific, Inc. | CA3510-6 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | with FV-1000 system | |
| Low melt agarose | Fisher | BP165-25 | |
| Magnetic stand | Tritech (Narishige) | GJ-1 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipet tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | Tritech (Narishige) | M-152 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Nanodrop spectrophotmeter | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 100 x 15 mm |
| Phenol | Sigma Aldrich | P-4557 | |
| Phenol Red | Ricca Chemoical Company | 572516 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Potassium hydroxide | Sigma Aldrich | P-6310 | |
| Pronase | Roche | 165921 | |
| Protease peptone | Fluka Biochemika | 29185 | |
| Small cell culture dish | Corning Incorporated | 430165 | 35 x 10 mm |
| Sudan Black | Sigma Aldrich | S2380 | |
| Thin wall glass capillary injection needles | World Precision Instruments, Inc. | TW100-3 | |
| Todd Hewitt | Sigma Aldrich/Fluka Analytical | T1438 | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | Argent Chemical Laboratory/Finquel | C-FINQ-UE-100G | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast extract | Fluka Biochemika | 92144 |
References
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