Abstract
Vann patogen, Streptococcus iniae, er ansvarlig for over 100 millioner dollar i årlig tap for oppdrettsnæringen og er i stand til å forårsake systemisk sykdom hos både fisk og mennesker. En bedre forståelse av S. iniae sykdom patogenesen krever en passende modell system. Den genetiske tractability og den optiske åpenhet av de tidlige utviklingsstadier av sebrafisk tillate for generering og ikke-invasiv bildediagnostikk av transgene linjer med fluorescently merket immunceller. Den adaptive immunsystem er ikke fullt funksjonell før flere uker etter befruktning, men sebrafisk larver har et konservert virveldyr medfødte immunsystemet med både nøytrofile granulocytter og makrofager. Således, generering av et larveinfeksjonsmodell tillater studiet av det bestemte bidrag fra medfødt immunitet i å kontrollere S. iniae infeksjon.
Stedet for mikroinjeksjon vil avgjøre om en infeksjon ersystemisk eller opprinnelig lokalisert. Her presenterer vi våre protokoller for otic vesikkel injeksjon av sebrafisk alderen 2-3 dager etter befruktning, så vel som våre teknikker for fluorescerende konfokal avbildning av infeksjon. En lokalisert infeksjon Nettstedet tillater observasjon av første mikrobe invasjon, rekruttering av vertsceller og formidling av infeksjon. Våre funn ved hjelp av sebrafisk larve modell av S. iniae infeksjon indikerer at sebrafisk kan anvendes for å undersøke de forskjellige bidrag fra verts neutrofiler og makrofager i lokaliserte bakterielle infeksjoner. I tillegg, vil vi beskrive hvordan photolabeling av immunceller kan benyttes for å spore individuelle vertscelle skjebne i løpet av infeksjonen.
Introduction
Streptococcus iniae er en viktig patogen akvatisk som er i stand til å forårsake systemiske sykdom hos både fisk og mennesker 1. Mens S. iniae er ansvarlig for store tap i oppdrettsnæringen, er det også en potensiell zoonotiske patogen, stand til å forårsake sykdom hos immunsupprimerte menneskelige verter med kliniske patologi som ligner på de som er forårsaket av andre streptokokker menneskelige patogener. Gitt sine likheter med menneskelige patogener, er det viktig å studere S. iniae sykdom patogenesen i sammenheng med en naturlig vert. En voksen sebrafisk modell av S. iniae infeksjon viste sterk infiltrering av verts leukocytter til det lokaliserte område for infeksjon så vel som en hurtig tid til å være vert for død, til en tid for kort bære det adaptive immunsystemet 7. For å få en grundig titt inn i det medfødte immunrespons mot S. iniae infeksjon in vivo, er det nødvendig å anvende en modell som er mer mottagelig for non-invasiv levende avbildning.
Larvesebrafisk har en rekke fordeler som gjør det til et stadig mer attraktivt virveldyr modell for å studere vert-patogen interaksjoner. Sebrafisk er relativt billig og lett å bruke og vedlikeholde i forhold til pattedyrmodeller. Adaptiv immunitet er ikke funksjonelt moden før 4-6 uker etter befruktning, men larver har et høyt konservert virveldyr medfødte immunsystemet med komplement, Toll-lignende reseptorer, cytokiner, og nøytrofile og makrofager med antimikrobielle evner inkludert fagocytose og åndedretts burst 2-6, 8-11. I tillegg er det genetiske tractability og optisk transparens av embryonale og larveutviklingsstadier tillate dannelsen av stabile transgene linjer med fluorescensmerkede immunceller som gjør det mulig å undersøke vert-patogen vekselvirkninger i sanntid in vivo. Generering av disse transgene linjer ved hjelp av en photoconvertible protein som Dendra2 gir mulighet for sporing av individuelle vertscelle opprinnelse og skjebne i løpet av 12 infeksjon.
Ved utvikling av en sebrafisk larveinfeksjonsmodell, vil det valgte området av mikroinjeksjon avgjøre om en infeksjon er i utgangspunktet lokalisert eller systemisk. Systemiske blod infeksjoner i halevenen eller Duct av Cuvier er mest brukt til å studere mikrobielle patogener i sebrafisk og er nyttige for å studere samspillet mellom vert og mikrobielle celler, cytokin svar, og forskjeller i virulens mellom patogene stammer. For langsommere voksende mikroorganismer, kan tidlig injeksjon i plommesekken fra et embryo i 16-1,000 cellestadiet brukes til å generere en systemisk infeksjon 13,14, med den optimale utviklingsstadiet for mikroinjeksjon av en saktevoksende mikroorganisme funnet å være mellom den 16-128 cellestadiet 15. Imidlertid plommesekken injeksjoner av mange mikrober på senere stadier av verts utvikling tendens til å være dødelig for than vert på grunn av næringsrikt miljø for mikroben og mangel på infiltrere leukocytter 16-18.
En lokalisert infeksjon resulterer vanligvis i rettet migrasjon av leukocytter mot infeksjonsstedet som lett kan kvantifiseres med ikke-invasiv bildediagnostikk. Denne typen infeksjon kan gi rom for disseksjon av mekanismene som formidler leukocyttmigrering samt undersøkelse av forskjellige trekkende og fagocytiske evner av ulike leukocyttpopulasjoner. Lokaliserte infeksjoner er også nyttig når undersøke forskjeller i virulens mellom bakteriestammer samt studere mikrobe invasjonsmekanismer siden fysiske verts barrierer må krysses for en lokalisert infeksjon å bli systemisk. Sebrafisk blir typisk hevet ved temperaturer på 25-31 ° C 19, men de kan også opprettholdes ved temperaturer så høye som 34 til 35 ° C for studier av invasivitet av visse humane patogener med krav strenge temperaturfor virulens 20, 21.
Mange forskjellige områder har blitt brukt til å generere en innledningsvis lokalisert bakteriell infeksjon, inkludert hindbrain hjertekammer 22, dorsal halemuskelen 18, pericardial hulrommet 23, og otisk vesikkel (øre) 5, 16, 24. Det har imidlertid vist seg at injeksjon av bakterier inn i halemuskelen kan forårsake vevsskade og betennelse uavhengig av bakterier, som kan skew resultater ved å undersøke leukocytt-respons 13. Selv om mindre skade er forbundet med injeksjon i hindbrain og selv om det i utgangspunktet er fritt for leukocytter i små embryoer, hindbrain ventrikkel stadig får mer immune celler over tid som mikroglia ta opphold. Hindbrain ventrikkel er også mer vanskelig sted til bildet. Otic vesikkel er en lukket hul hulrom uten direkte tilgang til vaskulaturen 25, 26. Det er normalt blottet for leukocytes, men leukocytter kan rekrutteres til otic vesikkel som svar på inflammatoriske stimuli som infeksjon. Det er også et foretrukket område av mikroinjeksjon av bakterier i sebrafisk alderen 2-3 dager etter befruktning (DPF) på grunn av den enkle bildebehandling og visualisering av injeksjonen. Derfor valgte vi otic vesikkel som vår side av lokalisert bakteriell infeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voksne og embryonale sebrafisk ble vedlikeholdt i samsvar med University of Wisconsin-Madison Forskning Animal Resources Center.
1. Klarmikroinjeksjon Needles
- Forberede tynn vegg glasskapillar kanyler (1.0 OD / 0.75 ID) ved hjelp av en mikropipette avtrekker enhet med følgende innstillinger: lufttrykk 200, varme 502, trekk 90, hastighet 80, tid 70, luft tid på starten av pull 5, luft tid ved enden av trekk 5.
- Ved hjelp av fin pinsett, bryte av spissen av nålen trekkes slik at spissen åpningen har en diameter på omtrent 10 um.
2. Å Larve Injection Retter
- Skyll en gel kam med kjørefelt bredde på ca 4-5 mm i sterilt vann og la tørke.
- Forberede en 1,5-2% høy smelte agarose løsning i E3 medium 19 og mikrobølgeovn inntil oppløsningen er klar. Når avkjølt, helle noe av agarose i en petriskål (100 x 15 mm) og virvel,legge akkurat nok agarose til å dekke bunnen av fatet.
- Når agarose lag har stivnet, plasserer skylt og tørket gel kam på toppen slik at den ikke-kjemmet enden er bare hviler på toppen av petriskålen, og kjemmet enden berører agarose. Sikre at kammen er så horisontalt som mulig, noe som skaper en 30 ° vinkel i forhold til bunnen agarose lag.
- Hell en ytterligere liten mengde agarose ved grenseflaten mellom kammen og undersiden agarose lag, slik at den friske agarose sjikt dekker brønnene av kammen. La det avkjøles helt før du fjerner kam. Ved hjelp av en pipette tips, fjern eventuelle overhengende deler av agarose fra brønnene.
- Hell E3 medium på toppen av injeksjon mold og oppbevares ved 4 ° C.
- Før hver bruk, erstatte med friske middels og varm injeksjon ramper ved 28,5 ° C i minst en time før injeksjon.
- Umiddelbart før injeksjoner, erstatte E3 på injeksjons rampen medE3 medium inneholdende 200 ug / ml etyl-3-aminobenzoat (Tricaine).
3. Klar S. iniae Inokulum
- Forbered og autoklaveres Todd Hewitt buljong-medium supplert med 0,2% gjærekstrakt og 2% proteose pepton (THY + P): 30 g / L Todd Hewitt, 2 g / l gjærekstrakt, 20 g / l proteose pepton. For agarskåler, legg til 14 g / L agar.
- Forbered bakteriekulturer natten før infeksjoner ved å pipettere en 100 ul porsjon av frosne bakterie lager i 10 ml THY + P kokes i en forseglet 15 ml tube. Inkuber over natten uten omrøring ved 37 ° C. Etter 14-16 timer av vekst, bruker natten kultur enten å lage fryse aksjer eller klargjøre for bruk i injeksjoner.
- Gjør fryse bestander ved å anbringe 1 ml av en over natten kultur i 500 ul av 80% glycerol i en 1,7 ml sentrifugerør. For å unngå fryse-tine sykluser, lage 100 mL ett-bruk porsjoner fra denne blandingen og oppbevares ved -80 ° C.
- For S. iniae brukes i infections fortynnes natten kultur 1: 100 for et totalvolum på 10 ml kultur ved tilsetning av 0,1 ml over natten kultur til 9,9 ml THY + P buljong. Vokse ved 37 ° C uten omrøring i omtrent 4-5 timer. Overvåke optisk tetthet (OD) ved 600 nm ved hjelp av en Nanodrop spektrofotometer og høste bakterier i mid-logaritmisk fase når OD600 nm når 0,250 til 0,500. En OD600 nm på 0,250 tilsvarer ca. 10 8 kolonidannende enheter (CFU) / ml.
- Pellet 1 ml av bakteriekulturen i en 1,7 ml sentrifugerør ved 1500 xg i 5 min. Resuspender i 1 ml av frisk PBS og gjenta. Mål OD600 nm av bakteriene i PBS, til pelleten, og resuspender i PBS oppnå den ønskede konsentrasjon.
- For å hjelpe til i visualisering av mikroinjeksjon, tilsett fenolrødt til den bakterielle suspensjoner før injeksjon for en endelig konsentrasjon på 0,1%.
- For forsøk med injeksjon av varmedrepte bakterier, varme bakterier i PBS ved 95 ° C i 30 min.Bekrefte at varmedrepende prosessen redusert antall av levedyktige bakterier til upåviselige nivåer ved utsåing et injeksjonsvolum (ca. 1 nl) på solid THY + P-agarplater og inkubering over natten ved 37 ° C.
4. Merking S. Inia e med en CellTracker Red Fluorescent Dye
- Å merke levende bakterieceller, utarbeide en stamløsning av en CellTracker fluorescerende fargestoff eller tilsvarende. Som det fargestoff som brukes kommer i 20 x 50 ug porsjoner av pulver og må resuspendert i DMSO, tilsett 7,3 ul DMSO til røret for å oppnå en 10 mM stamkonsentrasjon.
- Test en rekke fargestoffkonsentrasjoner (for eksempel, 0,5-25 pM) på bakteriene for å bestemme den laveste optimale konsentrasjon som flekker på cellene. Hurtig delende celler og lengre eksperimenter kan kreve en høyere konsentrasjon av fargestoff.
- Pellet 1,0 ml bakteriekultur i et 1,7 ml rør ved sentrifugering som beskrevet ovenfor (avsnitt 3). Resuspender pelleten i ettml-frisk PBS og tilsett passende volum av fargestoff til bakteriekultur.
- Inkubere uten risting ved 37 ° C i 30 min. Spinne ned de bakterier og resuspender i 1 ml forvarmet THY + P buljong og inkuberes uten omrøring i ytterligere 30 minutter ved 37 ° C.
- Spinn ned bakterier og vask to ganger i PBS før måling av OD600 nm og fortynne bakterier for mikroinjeksjon som beskrevet ovenfor (§ 3). Vi vanligvis injisere ca 100 CFU i en nl injeksjonsvolum for våre studier av leukocytt rekruttering og fagocytose.
5. Utarbeidelse av Sebrafisk Larver for infeksjoner
- Sett opp hekkende par natten før og samle embryoer som beskrevet av Rosen et al. 27 Inkuber embryo i E3 medium ved 28.5 ° C til den er klar til å infisere.
- For sebrafisk som skal avbildes, forhindre utviklingen av pigment (melanization) ved tilsetning av N-Phenylthiourea (PTU) tilE3 medium ved 24 timer etter befruktning (HPF) for en endelig konsentrasjon på 0,2 nM.
- For infeksjoner som involverer embryoer alderen 2 dpf, dechorionate embryoer manuelt med et par fine pinsett. Alternativt dechorionate embryoer ved å fjerne E3 og erstatte med pronase (2 mg / ml) i ca. 5 minutter eller inntil forsiktig pipettering bryter embryoer ut av chorion. De fleste larver burde ha klekket naturlig med 3 dpf.
- Bedøve sebrafisk flere minutter før infeksjon ved å plassere dechorionated larver til E3 medium som inneholder 200 mikrogram / ml Tricaine.
6. Otic Vesikkel Injeksjon av S. iniae inn Three Day Gammel Larver
- Slå på microinjector og angi tidsperioden til "millisekund". Åpne ventilen på karbondioksid tanken for å la gass inn i linjen. Trykket av microinjector bør lese omtrent 20 psi. Juster trykket i microinjector enheten ved urviseren dreining av den svarte fingerskruen for incrlettet trykket, eller vri snu for redusert trykk.
- Vortex forberedt S. iniae kultur i fenolrødt og PBS og bruke en microloader tips å laste 2-3 mL av kulturen inn i en trakk kapillær kanyle.
- Montere lastet nålen på en mikromanipulator som er koblet til et magnetisk stativ og plassere det under et stereomikroskop, slik at nålen er i en tilnærmet 45 til 65 ° vinkel i forhold til bunnen av mikroskopet.
- Trykk på fotpedalen av microinjector å dispensere en dråpe av inokulum på spissen av nålen. Måle diameteren av dråpen ved hjelp av målestokken i den okulære linsen av mikroskopet.
- Alternativt kan beregne diameteren av rulle ved injisering av et volum i en dråpe mineralolje på et mikroskop-objektglass med en skala bar. Diameteren av fallet bør være ca 0,10 mm, som handler om en en nl volum.
- Juster dråpestørrelse ved å justere tidsinnstilling påden microinjector eller ved å klippe av mer av nålespissen med fine pinsett. Merk at injeksjons tiden bør være mellom 20 - 35 ms å unngå å forårsake for mye skade på vev.
- Ved hjelp av et plastoverførings pipette, overføring 12 bedøvet larver i hver brønn av sprøytestøpeformen.
- Bruk en glasstav, hår sløyfe, eller plastspiss til å forsiktig plassere larvene slik at hodene er pekte mot baksiden av mikroskopet og eggeplomme sacs er mot venstre side av brønnen. Peke på venstre øre av larven opp mot taket.
- Ser gjennom okulær objektivet av stereomikroskopet, bruke knottene på mikromanipluatoren å stille opp den lastet nål med otic vesikkel slik at begge er i samme synsfelt. Pierce den ytre epitellaget av otic vesikkel med nålespissen slik at nålespissen er rett innenfor vesikkel.
- Trykk på fotpedalen for å injisere en nl av ønsket dose av S. iniae. Sørg for å bruke enlavt nok trykk for ikke å briste i hulrommet. Hvis injeksjonen er vellykket, otic vesikkel, men ikke det omkringliggende vev, bør fylle med fenolrød inoculum (Figur 1 Ai). Umiddelbart fjerne mis-injisert fisk fra injeksjons plate.
- Trekke forsiktig nålen ut av larven og flytte injeksjon plate for hånd slik at neste larven er i sikte. Gjør dette under 5X forstørrelse.
Merk: Tilbaketrekkingen av nålen kan resultere i avsetningen av noen bakterier utenfor otic vesikkel, som kan skew overlevelse og leukocytt-rekruttering resultater. For å unngå dette, er det anbefalt å injisere fluorescerende fargestoff merkede bakterier og visuelt skanne injisert larver under et fluorescerende mikroskop for å fjerne larvene der dette har skjedd. En riktig injisert larve er vist i (figur 1 Bi). - For å sikre at injeksjonsvolum / inokulum forblir den samme i løpet av forsøket, injiserer en dråpe bakterie suspension inn i en 1,7 ml sentrifugerør inneholdende 100 ul steril PBS etter hver 48 th embryo. Plate 100 ul stø + P-agarplater ved 37 ° C over natten for å bestemme CFU i injeksjonsvolumet.
- Når hele gruppen av 12 larver på injeksjons rampen har blitt injisert, bruke nøye en plast overføringspipetten å fjerne larvene fra brønnene og plassere dem i en ny petriskål (35 x 10 mm 2). Ta av Tricaine løsning og erstatte med ca 2 ml fersk E3 medium for å la larvene å gjenopprette.
- Pipetter larver injisert inn i enkeltbrønner i en 96-brønns plate og inkuber ved 28,5 ° C. Overvåke larver over tid for å overleve i disse platene eller fjerne senere for bildebehandling eller CFU teller.
7. Sudan Svart Farging av Nøytrofiler
Merk: Følgende trinn kan gjøres ved romtemperatur i en liten petriskål (35 x 10 mm 2) på en orbital shaker med mindre otherwise oppgitt. For hvert trinn, er mengden av reagens som brukes omtrent 2 ml pr tallerken, ved hjelp av akkurat nok væske til å fullstendig dekke larver.
- For fiksering av infiserte larver, bruke et glass Pasteur pipette for å fjerne E3 medium og erstatte med en iskald 4% paraformaldehyde i PBS løsning. Umiddelbart plassere fisken ved 4 ° C for å avlive. Fix natten ved 4 ° C.
- Vask 3 ganger i PBS i 5 min hver.
- Flekken med Sudan svart (0,18% lager fortynnet 1: 5 i 70% etanol, 0,1% fenol) i 30 min til 5 timer. Bruk en stereomikroskop for å sjekke om nøytrofile granulater har tatt opp flekken.
- Utføre en serie av 5 min vasker starter med en enkelt vask i 70% etanol, etterfulgt av en enkelt vask av et 1: 1 forhold av 70% etanol og PBS, etterfulgt av en avsluttende vask i PBS.
- Rehydrere i PBS pluss 0,1% tween (PBT).
- Å fjerne pigment fra larvene, vask i 1% kaliumhydroksid / 1% hydrogen peroxide for ca 6-10 min. Overvåke prøven closely og etter ca 5 min, sjekk larvene under en stereomikroskop for å se hvor mye av pigmentet har ryddet. Hvis løsningen er igjen på for lenge, vil eggeplomme sacs hovne opp og sprekker.
- Vask 3 ganger i 5 min hver i PBS.
- Lagre prøvene i enten PBS eller PBT ved 4 ° C i opp til en uke før du er klar til bilde og telle.
- Til bilde Sudan Black-stained larver, overføre fisken inn PBT og deretter inn i 80% glyserol og plasser den på et enkelt hulrom depresjon lysbilde. Stilling fast larver under et stereomikroskop ved hjelp av en pipette. Bilde ved hjelp av en farge digitalt kamera på en stereomikroskop (Figur 1 Aii-iv).
8. Enumeration av levedyktige bakterier fra infiserte larver
- Avlive larver på ønsket tid etter infeksjon i en iskald 200-300 mg / L løsning av Tricaine i E3 medium.
- Pipetter avlives larver i 1,7 ml sentrifugerør. Ta av Tricaine løsning og erstatte med 100 ul 0,2%Triton X-100 i PBS (PBSTx).
- Homogen larver ved å passere opp og ned 10 ganger gjennom en 27 G nål.
- Forbered serielle fortynninger av homogenates i steril PBS. For eksempel, hvis den infeksiøse dose er 100 CFU, pipette, 100 ul av homogenatet i 900 ul steril PBS. Ved hjelp av en ny pipettespiss, overføre 100 ul av den fortynnede homogenat i 900 ul steril PBS.
- Plate 100 ul av fortynningene på Columbia CNA agar for selektiv isolering av gram-positive bakterier, og inkuber ved 37 ° C i 48 timer. Dette medium vil gi større valg enn THY + P-agarplater, som vil understøtte veksten av både gram-negative og gram-positive bakterier.
- På plater med færre enn 500 individuelle kolonier, telle antall kolonier og multipliser med fortynningsfaktoren å bestemme antall CFU.
9. Fiksering av Larver for Imaging
- Fix larver i en iskald 4% paraformaldehyde i PBS løsning som debeskrevet i kapittel 7.
- Ved romtemperatur, vaskes tre ganger i 5 minutter hver i PBS før avbildning.
10. Utarbeidelse av Larver for Live Imaging
- Fremstille en 1,5% lavt smeltepunkt agarose løsning i E3 ved oppvarming i mikrobølgeovn inntil løsningen er klar.
- Plasser agarose løsning i en 55 ° C vannbad for å la den avkjøles, men ikke stivne.
- Legg Tricaine til agarose til en sluttkonsentrasjon på 0,016%.
- Ved hjelp av en plast overføring pipette, plasserer 4-5 bedøvet larver i en glassbunn fatet på scenen av en stereomikroskop.
- Ta av Tricaine og agarose løsning fra 55 ° C vannbad og la den avkjøles i romtemperatur i 1-2 min. Mens agarose er kjøling, fjerne så mye væske fra en bedøvet larver som mulig.
- Hell den avkjølte agarose i formen inntil omtrent halvparten av overflaten er dekket. Virvle fatet å spre agarose. Merk at hvis agarosener for varmt, vil det drepe larvene. Også, hvis for mye agarose tilsettes til fatet, kan objektivlinsen av mikroskopet treffer bunnen av skålen ved fokusering gjennom agarose.
- Ved hjelp av en overføring pipette, plukke opp larvene som har fløt til sidene av parabolen og pipettér dem tilbake i sentrum.
- Under stereomikroskop, forsiktig plassere larver som ønsket med et hår sløyfe, en lang pipette eller en glasstav. For avbildning av otic vesikkel, plasserer larvene slik at den venstre otic vesikkel er flatt mot bunnen av fatet.
- La agarose kjølig i ca 10 min før du flytter fatet. Larvene kan skifte stillinger hvis agarosen er ikke solid. Forsiktig pipettér noen Tricaine og E3 løsning på toppen av agarose lag for å holde det fuktig.
11. Confocal Imaging of Infection
- Plasser glassbunn fatet med larver på scenen av en invertert mikroskop med en RB-1000 laser scanning confocal system.
- Still pinhole til 200-300 mikrometer og ved hjelp av en numerisk aperture 0.75 / 20X objektiv, sett z-stabler med 3-6 mikrometer skiver.
- Bruk kontinuerlig avsøkning linje for å justere lasereffekten og detektor forsterkning for hver kanal.
- Ved hjelp av sekvensiell skanning linje for hver fluorescens kanal (f.eks 488 og 543 nm) og kontrast differensial forstyrrelser (DIC), gjennomføre en time lapse film fra venstre otic vesikkel hvert 3 min for 2-6 timer for å observere innledende rekruttering og fagocytose av nøytrofile og makrofager. For lengre tid kurs, legg lokk på petriskål for å hindre fordamping og uttørking av agarose.
- Erverve stillbilder av fast (figur 1B) eller leve (figur 2) larver på 20X eller 40X forstørrelse.
12. Photoconversion av Dendra2-merket Leukocytter på Otic Vesikkel
Merk: Dendra2 kan photoconverted fra grønn til rød fluorescensved å fokusere et 405 nm laser (50-70% laser makt bør være tilstrekkelig) på regionen av interesse (ROI) i 1 min. Nedenfor er det trinn-for-trinn-protokollen som brukes for FV-1000 konfokal laser scanning system:
- Visualisere prøven med en z-stack skanning med 488 nm og 543 nm lasere. Bruk kontinuerlig avsøkning linje for å justere lasereffekten og detektor forsterkning. Kontroller at det ikke er noe uhell photoconverted rød fluorescens.
- På "Image Acquisition Control" vinduet, under "Stimulus Setting" velg "Bruk Scanner" verktøyet og velg "main". Velg 405 nm laser og sette den på 70% strøm. Bruke alternativet sirkel, definere ROI i otic vesikkel.
- Under "Stimulus begynne å sette" velg "Aktivering i serie" med en preaktivering av en ramme og en aktiveringstiden på 60.000 ms. På "Acquisition Setting" vinduet under "Time Scan overskriften", velge 2 ifrister av 00:01:00 (ett for pre- og en for etter photoconversion).
Merk: Etter at tid forfalle serien skanningen er fullført, skal Dendra2 har blitt photoconverted til sin røde fluorescerende tilstand. - Skanne prøven av en z-stabelen ved hjelp av 488 nm og 543 nm lasere for å visualisere photoconverted rød fluorescens så vel som en hvilken som helst gjenværende grønn fluorescens (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroinjeksjon av S. iniae inn otic vesikkel (figur 1 og figur 2) resulterer i en innledningsvis lokalisert vertsrespons. Når injisert riktig, bør bakteriene kun sees i otic vesikkel og ikke i det omgivende vev eller blod. Dette kan visualiseres ved mikroinjeksjon ved hjelp av fenol-rødt fargestoff (figur 1A). Alternativt, hvis merket bakterier blir injisert, en rask skanning av infiserte larver umiddelbart etter injeksjonen kan bekrefte at bakteriene er bare i otic vesikkel og ikke omkringliggende vev (figur 1B). Selv en dose så lite som 10 CFU villtype S. iniae er i stand til å etablere en dødelig infeksjon i løpet av 24 til 48 timer etter infeksjon (HPI), injeksjon av 1000 CFU av en avirulent stamme, cpsA, ikke resulterer i dødelig infeksjon, og at belastningen synes ute av stand til å formere seg i verten 24. Dermed er denne lokaliserte infeksjonsmodell i stand til å differentiate mellom bakteriestammer av endret virulens.
Mikroinjeksjon områder av opprinnelig lokalisert infeksjon er nyttige for å studere leukocyttpopulasjoner kjemotaksis. Leukocytt rekruttering kan ved kvantifisert ved enten Sudan Svart farging av nøytrofile granulater (figur 1A) eller formaldehyd fiksering av fluorescerende transgene linjer (Figur 1b). Å visualisere rekruttering og fagocytiske evner av immunceller, brukte vi transgene linjer uttrykker den grønne fluorescerende protein Dendra2 spesielt i makrofager Tg (MPEG1: dendra2) 24 eller nøytrofile Tg (mpx: dendra2) 12. Når S. iniae injiseres i otic vesikkel av 3 dpf larver, er både nøytrofile granulocytter og makrofager hurtig rekruttert innen de første 2 HPI (figur 1). Imidlertid, når den utføres på riktig måte, mikroinjeksjon av PBS i otic vesikkel resulterer ikke i samme robust rekruttering av leukocytter verts (
Figur 2: fagocytose av S. iniae av fagocytter i otic vesikkel Transgenic mpx:. dendra2 (A) eller MPEG1: dendra2 (B) larve infisert med rød-merket S. iniae (avbildet i magenta) og avbildes på 60 min etter infeksjon ved hjelp av en laser SCANNing konfokal mikroskop. Skala bar, 30 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Photoconversion av makrofager ved otisk vesikkel 5 HPI med S. iniae. makrofager (som er avbildet i grønt) ved otisk vesikkel, betegnet med sirkelen (A), ble photoconverted (B) ved anvendelse av en 405 nm laser i et konfokalt mikroskop og spores over tid. Med 24 HPI, photoconverted makrofager (avbildet i magenta) har migrert så langt som til trunk / hale blodkreft vev (C); skala bar, 50 mikrometer. Høyere forstørrelser av eske regionene i C er vist i (i) og (ii), skala bar 30 mikrometer; piler peker photoconkonverteres makrofager. Photoconverted celler vises hvitt på grunn av det fusjonerte 543 nm rød fluorescens og eventuelle gjenværende 488 nm grønn fluorescens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Infeksjonen metode som brukes her er nyttig for studier av vertens immunrespons til en først lokalisert infeksjon i 2-3 DPF befruktede egg og larver. Fokus for en inflammatorisk stimulus, slik som infeksjoner, i et lukket hulrom som otic vesikkel tillater studiet av nøytrofile granulocytter og makrofag kjemotakse og fagocytose. En påminnelse for injisering av bakterier i otic vesikkel er at evnen av nøytrofiler til effektivt fagocyttere bakterier i væskefylte hulrom kan være avhengig av den spesielle mikrobe. Selv om Escherichia coli og Bacillus subtilis ikke er lett utsatt for fagocytose av neutrofiler i otic vesikkel 28, er det funnet at neutrofiler er i stand til å fagocyttere både Pseudomonas aeruginosa og S. iniae i denne plasseringen 16, 24. Lokalisert infeksjon er også nyttig når man studerer invasivitet av ulike patogener. For å forårsake en systemisk infeksjon etter injection inn i et lukket hulrom som otic vesikkel, må mikroben være i stand til å passere fysiske verts barrierer. Alternativt kan forskjellige patogener er avhengige av vertsceller for transport og spredning fra den innledende infeksjonsstedet. Dette gjør lokaliserte injeksjoner nyttige for å sammenligne stammer av endret virulens.
Under mikroinjeksjon, for å unngå bakterier bosetting og tilstopping nålen, skifte nåler enten etter hver tilstand eller etter ca 50 larver. Dette vil bidra til å sikre suspensjon i nålen er mer ensartet. Ved sedimentering av bakterier i nålen synes å være et problem, en blanding av PBS, 2% PVP40, og 10% glyserol, kan bidra til å holde en homogen suspensjon. For å sikre at hver larve blir injisert med omtrent samme antall bakterier, kontrollerer CFU tellinger ved å homogenisere en larve umiddelbart etter injeksjon, og plettering av homogenatet på CNA-agar. CNA agar vil selektere for vekst av dyrkbare gram-positive bakterier, ikke bareS. iniae, men det vil gi et inntrykk av hvor konsekvent injeksjonsdoser er mellom hver enkelt larve. Med et mål inoculum på 100 CFU per larve, er det vanligvis mellom 75-150 kolonier på en CNA plate. Antallet ikke-S. iniae gram-positive kolonier som vokser på en CNA plate er sannsynligvis svært lav, siden de fleste PBS injisert fisk vanligvis resultere i mellom 0-20 kolonier. Ved senere tidspunkter i løpet av infeksjonen, er det ikke uvanlig at det finnes variasjoner på opp til en halv log i kolonitall mellom larver infisert med det samme infeksiøs dose. Dette kan representere små forskjeller mellom individuelle larve i deres evne til å kontrollere infeksjonen eller kan reflektere forskjeller i mengden av dyrkbare gram-positive bakterier i larver eller E3 medium.
Selv om injeksjon i otic vesikkel, er det viktig ikke å injisere for stort volum eller med for høyt trykk, da dette kan føre til at hulrommet til å sprekke. Injeksjonsvolumer should holdes på ca 1 nl. Hvis nålen er for stor, kan mikroinjeksjon forårsake skade på omliggende vev, noe som kan påvirke rekrutteringen av verts leukocytter til stedet for infeksjon eller kan tillate bakterier å lekke ut av otic vesikkel. Det er også viktig å bekrefte injeksjon i den riktige plass. Hvis nålen er satt inn for dypt, kan det rote gjennom otic vesikkel eller den kan treffe blodårer flyter rundt otic vesikkel. Dette kan føre til avleiring av bakteriene inn i blodstrømmen eller utenfor vesikkel, som kan endre vertsresponser.
Det er også mulig at når nålen er trukket ut, noen bakterier kan bli utilsiktet avsettes utenfor otic vesikkel som vist ved Colucci-Guyon et al. 28, men vi finner at dette skal bare være tilfelle i mindre enn 5% av injeksjonene. Prøver å injisere inn i sentrum av otic vesikkel kan bidra til å unngå denne situasjonen. I en vellykket infeksjon, bør otic vesikkel fylle opp wed fenol rødt fargestoff, men farvestoffet bør ikke lekke ut til det omgivende vev. Noen mis-injisert larver bør umiddelbart forkastet. Injisering merket bakterier er en nyttig måte å bekrefte en vellykket injeksjon (figur 1B). En av ulempene ved anvendelse av en CellTracker fargestoff er at dette fargestoffet vil bli fortynnet ettersom bakteriene deler, til slutt å forhindre bakterier fra å bli visualisert under fluorescens. Vi valgte et rødt fargestoff fordi vi brukte grønn-merket nøytrofile og makrotransgene linjer for de fleste av våre studier.
Dendra2 er en photoconvertible protein fra octocoral Dendronephthya sp. som kan photoconverted fra en grønn til en rød fluorescerende tilstand med en 405 nm laser 29. Denne photoconversion er en ikke-invasiv måte å markere celler og sporer deres skjebne i løpet av infeksjonen. Leukocytter rekruttert til stedet for infeksjon kan photoconverted og følges over tid for å overvåke sine dissemination hele verts vev (figur 3). Alternativt kan leukocytter bli photoconverted før infeksjon og deretter overvåket etter mikroinjeksjon for å fastslå opprinnelsen av celler som rekrutteres til stedet for infeksjon. Etikette bakterier og immunceller tillater studiet av leukocytt-patogen interaksjoner in vivo inkludert rekruttering og fagocytose (figur 1B og Figur 2). Skille den rød-merket S. iniae fra den røde fluorescens fra et photoconverted leukocytt er vanskelig, slik at en annen fluorescerende fargestoff CellTracker kunne brukes. Dette vil være spesielt nyttig for å avgjøre hvilke av de photoconverted immunceller som forlater otic vesikkel inneholde S. iniae.
Fremtidige anvendelser av otic vesikkel-infeksjon fremgangsmåte kan omfatte måling av hastighet og retnings av neutrofiler og makrofager, som beveger seg i respons til ulike infeksjoner. Infeksjonen kinetics kan også bli undersøkt for å se hvilke celletyper er de første som kommer til et nettsted for infeksjon og hvilke celletyper som er mest robust rekruttert i tillegg til hvor cellene stammer eller hvor de spre 30. I tillegg til å studere rekrutteringen til en innledningsvis lokalisert infeksjon, kan denne infeksjonsmodellen brukes til å studere funksjonen av vertens immunsystem-komponenter under innledende infeksjon. Antisens- morfolino oligonukleotider som er rettet mot spesifikke RNA kan brukes til å slå ned uttrykk for vertsimmun komponenter, inkludert Toll-lignende reseptorer, cytokinreseptorer og leukocytter, og CRISPR-Cas eller TALEN teknologi kan brukes til å lage genetiske mutanter. Genekspresjon ved hjelp RNAseq eller qPCR kan også brukes til å karakterisere ekspresjonen av visse vertsgener som respons på infeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke lab medlemmer for sebrafisk stell og vedlikehold. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health, National Research Service Award A155397 til EA Harvie og NIH R01GM074827 til Anna Huttenlocher.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml Eppendorfs | MidSci | AVSS1700 | |
| 14 ml Falcon tube | BD Falcon | 352059 | |
| 27 G x ½ in. needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 96-well Plate | Corning Incorporated | 3596 | |
| Agar | BD Biosciences | 214030 | |
| CellTracker Red | Molecular Probes, Invitrogen | C34552 | |
| CNA agar | Dot Scientific, Inc | 7126A | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-7m | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Ethanol 200 proof | MDS | 2292 | |
| Fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gel comb | VWR | 27372-482 | 4.2 mm width, 1.5 mm thick |
| Glass bottom dishes | Custom made by drilling a 16 - 18 mm hole in the center of a 35 mm tissue culture dish bottom and placing a 22 mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light. | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| High melt agarose | Denville Scientific, Inc. | CA3510-6 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | with FV-1000 system | |
| Low melt agarose | Fisher | BP165-25 | |
| Magnetic stand | Tritech (Narishige) | GJ-1 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipet tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | Tritech (Narishige) | M-152 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Nanodrop spectrophotmeter | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 100 x 15 mm |
| Phenol | Sigma Aldrich | P-4557 | |
| Phenol Red | Ricca Chemoical Company | 572516 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Potassium hydroxide | Sigma Aldrich | P-6310 | |
| Pronase | Roche | 165921 | |
| Protease peptone | Fluka Biochemika | 29185 | |
| Small cell culture dish | Corning Incorporated | 430165 | 35 x 10 mm |
| Sudan Black | Sigma Aldrich | S2380 | |
| Thin wall glass capillary injection needles | World Precision Instruments, Inc. | TW100-3 | |
| Todd Hewitt | Sigma Aldrich/Fluka Analytical | T1438 | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | Argent Chemical Laboratory/Finquel | C-FINQ-UE-100G | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast extract | Fluka Biochemika | 92144 |
References
- Agnew, W., Barnes, A. C. Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination. Vet. Microbiol. 122 (1-2), 1-15 (2007).
- Danilova, N., Steiner, L. A. B cells develop in the zebrafish pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13711-13716 (2002).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Willett, C. E., Cortes, A., Zuasti, A., Zapata, A. Early Hematopoiesis and Developing Lymphoid Organs in the Zebrafish. Dev. Dyn. 214, 323-336 (1999).
- Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
- Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development(Cambridge, England). 126 (17), 3735-3745 (1999).
- Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. G. Streptococcus-Zebrafish Model of Bacterial Pathogenesis. Infect. Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).
- Jault, C., Pichon, L., Chluba, J. Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in Danio rerio. Mol. Immunol. 40 (11), 759-771 (2004).
- Meijer, A. H., et al. Expression analysis of the Toll-like receptor and TIR domain adaptor families of zebrafish. Mol. immunol. 40 (11), 773-783 (2004).
- Seeger, A., Mayer, W. E., Klein, J. A Complement Factor B-Like cDNA clone from the Zebrafish (Brachydanio rerio). Mol. immunol. 33, 511-520 (1996).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J. Immunol. Methods. 292 (1-2), 119-129 (2004).
- Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J. Leukoc. Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. , 1-9 (2012).
- Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS ONE. 6 (2), e16779 (2011).
- Veneman, W. J., Marín-Juez, R., et al. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury. Cell. Microbiol. , (2012).
- Sar, A. M., et al. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell. Microbiol. 5 (9), 601-611 (2003).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S Inhibits Neutrophil Recruitment during the Early Stages of Streptococcus pyogenes Infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. New York, NY. (2002).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (9), 139-151 (2006).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 5 (12), e1000697 (2009).
- Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae. Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).
- Haddon, C., Lewis, J. Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
- Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -Y., Phillips, B. Development of the zebrafish inner ear. Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
- Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
- Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).
