Abstract
Водных патогенов, Streptococcus iniae, несет ответственность за более чем 100 миллионов долларов в ежегодных потерь для аквакультуры и способен вызывать системное заболевание в обоих рыбы и человека. Лучшее понимание S. Патогенез заболевания iniae требует соответствующей модели системы. Генетический уступчивость и оптической прозрачности на ранних стадиях развития в данио позволяют поколения и неинвазивной визуализации трансгенных линий с флуоресцентно помечены иммунные клетки. Адаптивная иммунная система функционирует не полностью, пока несколько недель не после оплодотворения, но данио личинки имеют сохраняется позвоночных врожденную иммунную систему, включающую как нейтрофилов и макрофагов. Таким образом, генерация личинок модели инфекции позволяет изучать конкретный вклад врожденного иммунитета в борьбе S. iniae инфекции.
Сайт микроинъекции будет определить, является ли инфекциясистемный или первично локализовано. Здесь мы представляем наши протоколы для слухового инъекции пузырьков из рыбок данио в возрасте 2-3 дней после оплодотворения, а также наших методов флуоресцентной конфокальной микроскопии инфекции. Локализуется инфекция сайт позволяет наблюдать за начальным микробов вторжения, набор клеток-хозяев и распространение инфекции. Наши результаты, используя данио личинок модель S. iniae инфекции показывают, что данио могут быть использованы для изучения различные взносы принимающих нейтрофилов и макрофагов в локализованных бактериальных инфекций. Кроме того, мы опишем, как photolabeling иммунных клеток может быть использована для отслеживания участи отдельные клетки-хозяина в ходе инфекции.
Introduction
Streptococcus iniae является одним из основных водных патогенов, которые способны вызвать системное заболевание и в рыбе и человека 1. В то время как S. iniae несет ответственность за больших потерь в отрасли аквакультуры, также потенциал зоонозных патогенов, способных вызвать заболевание у ослабленных людей хостов с клиническими патологиями подобных тем, которые вызваны другими стрептококковой патогенов человека. Учитывая, что его сходство с патогенами человека, важно изучить S. Патогенез болезни iniae в контексте естественного хозяина. Взрослых данио модель S. iniae инфекции показал надежную инфильтрацию лейкоцитов в принимающих локализованного места инфекции, а также к быстрому времени на проведение смерть, слишком малое время, чтобы включать в адаптивной иммунной системы 7. Для того, чтобы получить в глубокий взгляд на врожденного иммунного ответа к S. iniae инфекции в естественных условиях, необходимо использовать модель, более склонны к пна инвазивной живого изображения.
Личиночной данио имеет ряд преимуществ, которые делают его более привлекательным модель позвоночных для изучения хозяин-патоген взаимодействий. Данио рерио относительно недороги и просты в использовании и обслуживании по сравнению с моделями млекопитающих. Адаптивного иммунитета не является функционально зрелого до 4-6 недель после оплодотворения, но личинки имеют высоко консервативны позвоночных врожденной иммунной системы комплемента, с Toll-подобных рецепторов, цитокинов и нейтрофилов и макрофагов с антимикробными возможностей в том числе фагоцитоза и респираторного взрыва 2-6, 8-11. Кроме того, генетический трактабильность и оптическая прозрачность эмбриональных и личиночных стадий развития позволяет для генерации стабильных трансгенных линий с флуоресцентно меченые клетки иммунной системы, что делает его можно рассматривать хост-патоген взаимодействий в реальном времени в естественных условиях. Генерирование этих трансгенных линий с использованием photoconvertible белок, такой как Dendra2 позволяет отслеживать отдельные происхождения клетки-хозяина и судьбы на протяжении инфекции 12.
При разработке данио личинок модель инфекции, выбранное место микроинъекции будет определить, является ли инфекция первоначально локализовано или системным. Системные крови инфекции в хвостовую вену или в воздуховоде Кювье наиболее часто используется для изучения микробных патогенов в данио и полезны для изучения взаимодействий между хозяином и микробных клеток, ответов цитокинов, а также различия в вирулентности между штаммами возбудителя. Для более медленных растущих микроорганизмов, в начале инъекции в желточного мешка эмбриона на стадии 16-1,000 клеток могут быть использованы для генерации системной инфекции 13,14, с оптимальной стадии развития для микроинъекции медленно растущих микроорганизмов обнаружили, что между этап 16 до 128 клеток 15. Тем не менее, желточного мешка инъекции многих микробов на более поздних стадиях развития принимающей правило, смертельным для тон пройдет за счет богатой питательными веществами среды для микробов и отсутствие Лейкоциты проникают 16-18.
Локализованы инфекция обычно приводит к направленной миграции лейкоцитов по направлению к месту инфекции, которые могут быть легко количественно с неинвазивной визуализации. Этот тип инфекции может позволить для вскрытия механизмов, которые обеспечивают миграцию лейкоцитов, а также исследование различных миграционных и фагоцитирующих возможностей различных групп населения лейкоцитов. Локализованные инфекции также могут быть использованы при изучении различий в вирулентности между бактериальных штаммов, а также изучения механизмов вторжения микробов, так как физические барьеры хоста должно быть скрещенными за местной инфекции, чтобы стать системным. Данио рерио, как правило, поднял при температуре 25-31 ° С 19, но они также могут быть сохранены при температуре выше, чем 34-35 ° С в течение исследований инвазивности определенных патогенов человека с жесткими требованиями температурывирулентности 20, 21.
Много различных сайтов были использованы для создания изначально локализованного бактериальной инфекции, включая заднего мозга желудочка 22, спинной хвостовой мышцы 18, 23 полости перикарда и слухового пузырька (уха) 5, 16, 24. Тем не менее, было обнаружено, что введение бактерий в хвостовой мышцы может вызвать повреждение тканей и воспаление независимо от бактерий, которые могут исказить результаты при исследовании лейкоцитов ответ 13. Хотя и не столь ущерб, связанный с введением в мозге и, хотя это изначально лишены лейкоцитов у молодых эмбрионов, задний мозг желудочка постоянно получает больше иммунных клеток с течением времени, как микроглии выбирать местожительство. Задний мозг желудочка также более трудные локации к изображению. Слухового пузырька является замкнутую полую полость без прямого доступа к сосудистой 25, 26. Это, как правило, лишены Leukocytes, но лейкоциты могут быть привлечены к слуховым пузырьком в ответ на воспалительные стимулы, такие как инфекции. Это также предпочтительным местом микроинъекции бактерий в данио в возрасте 2-3 дней после оплодотворения (DPF) из-за легкости обработки изображений и визуализации инъекции. Таким образом, мы выбрали слухового пузырька как нашем сайте локализованного бактериальной инфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Взрослые и эмбриональные данио были сохранены в соответствии с Университетом Висконсин-Мэдисон исследования на животных ресурсного центра.
1. Подготовка микроинъекции Иглы
- Подготовка Тонкие стены иглы стеклянный капилляр инъекций (1,0 OD / 0,75 ID) с помощью микропипетки съемник устройства со следующими параметрами: давление воздуха 200, тепла 502, потяните 90, скорость 80, время 70, эфирное время в начале выдвижной 5, эфирного времени в конце тянуть 5.
- Использование тонких пинцетом, разорвать кончик вытащил иглу так, чтобы отверстие наконечник имеет диаметр приблизительно 10 мкм.
2. Подготовка личинок закачку Блюда
- Промойте гель расческой с шириной полосы примерно 4-5 мм в стерильной воде и дайте высохнуть.
- Подготовьте 1,5-2% Высокая расплава раствора агарозы в E3 среды 19 и микроволновой печью, пока раствор не станет прозрачным. После охлаждения залить некоторые из агарозы в чашку Петри (100 х 15 мм) и вихрь,добавив ровно столько агарозы, чтобы полностью покрыть дно тарелки.
- После агарозном слой затвердеет, поместите промывают и сушат гель гребень на верхней, так что не-расчесаны конец всего лежит на верхней части чашки Петри и причесаны конец касаясь агарозы. Убедитесь, что гребень как по горизонтали, как это возможно, создавая угол 30 ° по отношению к нижней агарозном слоя.
- Налейте дополнительный небольшое количество агарозы на поверхности раздела между гребнем и нижней агарозном слоя таким образом, что свежие агарозном слой покрывает лунки гребнем. Дайте полностью остыть, прежде чем снимать гребень. Использование кончик пипетки, удалите все выступающие части агарозы из скважин.
- Налейте E3 среду в верхней части литья под давлением и хранят при температуре 4 ° С.
- Перед каждым использованием, заменить свежей средой и теплая впрыска пандусы на 28,5 ° С в течение по крайней мере час перед инъекцией.
- Непосредственно перед инъекциями, замените E3 впрыска рампы сЕ3 среду, содержащую 200 мкг / мл этилового эфира 3-аминобензойной кислоты (Tricaine).
3. Подготовка S. iniae Посевной
- Подготовка и автоклав Тодд Хьюитт бульон среду, дополненную 0,2% дрожжевого экстракта и 2% пептона Протеаза (THY + P): 30 г / л Тодд Хьюитт, 2 г / л дрожжевого экстракта, 20 г / л пептона Протеаза. Для чашках с агаром, добавляют 14 г / л агара.
- Подготовка бактериальных культур в ночь перед инфекций с помощью пипетки 100 мкл аликвоты замороженного бактериального акций в 10 мл Твоего + P бульона в герметичной 15 мл трубки. Инкубируют в течение ночи без перемешивания при 37 ° С. После 14-16 ч роста, использовать ночной культуры либо сделать запасы морозильника или подготовить для использования в инъекций.
- Сделать запасы морозильной путем размещения 1 мл ночной культуры в 500 мкл 80% глицерина в 1,7 мл центрифужную пробирку. Чтобы избежать циклов замораживания-оттаивания, составит 100 мкл одноразовые аликвот из этой смеси и хранить при температуре -80 ° C.
- Для S. iniae используется в infectiДополнения, разбавить ночной культуры 1: 100 для общего объема 10 мл культуры путем добавления 0,1 мл ночной культуры в 9,9 мл THY + P бульоне. Выращивают при температуре 37 ° С без перемешивания в течение примерно 4-5 ч. Монитор оптической плотности (ОП) при 600 нм, используя NanoDrop спектрофотометр и урожай бактерии в середине логарифмической фазы, когда OD 600 нм достигает 0.250-0.500. OD 600 нм 0,250 соответствует примерно 10 8 колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл.
- Гранул 1 мл бактериальной культуры в 1,7 мл центрифужную пробирку на 1500 мкг в течение 5 мин. Ресуспендируют в 1 мл свежего PBS и повторить. Измерьте OD600 нм бактерий в PBS, осадок, и ресуспендируют в PBS, чтобы достичь желаемой концентрации.
- Для помощи в визуализации микроинъекции, добавить фенол красный с бактериальных суспензий перед инъекцией для конечной концентрации 0,1%.
- Для экспериментов с инъекции убитых нагреванием бактерий, нагреть бактерии в PBS при 95 ° С в течение 30 мин.Убедитесь, что процесс тепловыделения убийство уменьшается количество жизнеспособных бактерий до неопределяемых уровней путем посева вводимый объем (примерно 1 NL) на твердом Авиалиний + P чашки с агаром и инкубировали в течение ночи при 37 ° С.
4. Маркировка С. INIA электронной с CellTracker Красной флуоресцентный краситель
- Для маркировки живых бактериальных клеток, подготовить исходный раствор в CellTracker флуоресцентного красителя или его эквивалент. Как краситель используется приходит в 20 х 50 мкг аликвот порошка и должен быть повторно суспендируют в ДМСО, добавляют 7,3 мкл ДМСО к трубе, чтобы получить 10 мМ маточного концентрацию.
- Тест диапазон концентраций красителей (например, 0,5-25 мкМ) на бактерии, чтобы определить оптимальную концентрацию низкая, что окрашивает клетки. Быстро делящиеся клетки и длинные эксперименты могут потребовать более высокую концентрацию красителя.
- Гранул 1,0 мл бактериальной культуры в 1,7 мл трубки центрифугированием, как описано выше (в разделе 3). Ресуспендируют осадок в 1мл свежей PBS и добавляют соответствующий объем красителя к бактериальной культуре.
- Инкубируйте без перемешивания при 37 ° С в течение 30 мин. Спин вниз бактерии и ресуспендируют в 1 мл подогретого THY + P бульона и инкубируют без перемешивани в течение дополнительных 30 мин при 37 ° С.
- Спин вниз бактерии и мыть два раза в PBS перед измерением OD 600 нм и разбавления бактерии для микроинъекции, как описано выше (раздел 3). Как правило, мы вводят примерно 100 КОЕ в 1 нл объемом впрыска для наших исследований вербовки лейкоцитов и фагоцитоза.
5. Подготовка данио рерио Личинки для инфекций
- Настройка гнездящихся пар ночь перед и собирать эмбрионы, как не описывается Розен и др. 27 инкубировать эмбрионов в Е3 среды на 28,5 ° С до готовности заразить.
- Для данио, которые будут изображаемого, предотвратить развитие пигмента (меланизации) путем добавления N-фенилтиомочевины (ПТУ) вЕ3 среда в 24 часов после оплодотворения (HPF) для конечной концентрации 0,2 нМ.
- При инфекциях, связанных с эмбрионами в возрасте 2 DPF, dechorionate эмбрионов вручную с парой тонких пинцетом. Альтернативно, зародыши dechorionate путем удаления и замены E3 проназой (2 мг / мл) в течение приблизительно 5 мин или до осторожно пипеткой разрушает эмбрионов из хориона. Большинство личинок следует вылупились, естественно, на 3 денье.
- Обезболить данио несколько минут до заражения путем размещения dechorionated личинок в E3 среде, содержащей 200 мкг / мл Tricaine.
6. слухового пузырька Инъекция S. iniae на три дневных личинок
- Включите microinjector и установить временной интервал, "мс". Открыть кран на баке диоксида углерода, чтобы газ в линии. Давление microinjector следует читать примерно 20 PSI. Отрегулируйте давление в microinjector блока по часовой стрелке поворота черной рифленой ручкой для Incrоблегчили давление или против часовой стрелки поворота для пониженного давления.
- Vortex подготовленный С. iniae культуры в фенолового красного и PBS и используют наконечник microloader для загрузки 2-3 мкл культуры в капиллярной тянут инъекционной иглой.
- Установить загруженный иглы на микроманипулятора, подключенного к магнитным стойки и положение его под стереомикроскопа так, чтобы игла приблизительно угол 45-65 ° по отношению к нижней части микроскопа.
- Пресс на педаль в microinjector обойтись каплю инокулята на кончике иглы. Измерьте диаметр капли с помощью шкалы бар в глазной линзе микроскопа.
- В качестве альтернативы, оценить диаметр капли путем введения в объем капли минерального масла на предметное стекло микроскопа с масштабной линейки. Диаметр капли должна быть примерно 0,10 мм, что составляет около 1 нл объема.
- Отрегулируйте размер капли, регулируя продолжительность настройки наmicroinjector или отсечения от более кончика иглы с мелкими пинцетом. Обратите внимание, что время впрыска должно быть между 20 - 35 мс, чтобы не вызывать слишком много повреждений тканей.
- С помощью пластмассовой пипетки передачи, передача 12 анестезировали личинок в каждую лунку для литья под давлением.
- Использование стеклянной палочки, цикл волос или пластиковый наконечник, чтобы аккуратно расположить личинок, так что головки направлены в сторону задней части микроскопа и желтка мешочков против левой стороны скважины. Укажите левое ухо личинки к потолку.
- Просматривая окуляр стереомикроскопа, используйте ручки на микроманипулятора выстроить загруженный иглы с слухового пузырька, так что оба находятся в одном поле зрения. Пирс наружный эпителиальный слой слухового пузырька с кончика иглы так, чтобы кончик иглы только внутри пузырька.
- Нажмите на педаль, чтобы ввести 1 нл желаемую дозу S. iniae. Будьте уверены, чтобы использоватьдостаточно низкое давление, чтобы не привести к разрыву полость. Если инъекции является успешным, слухового пузырька, но не окружающие ткани, необходимо заполнить с фенола красного инокулята (фиг.1 Ай). Немедленно снять любое неправильно вводили рыбу из инжекционного пластины.
- Тщательно убрать иглу из личинки и перейти впрыска пластину рукой так, чтобы в следующем личинка в поле зрения. Сделайте это под 5-кратным увеличением.
Примечание: отвода иглы может привести к осаждению некоторых бактерий за пределами слухового пузырька, которые могут исказить выживания и набора лейкоцитов результаты. Чтобы избежать этого, рекомендуется, чтобы ввести бактерий флуоресцентным красителем меченных и визуально проверить вводят личинки под флуоресцентным микроскопом, чтобы удалить личинок, где это произошло. Правильно вводить личинка показано на (рис 1 BI). - Для обеспечения объема впрыска / посевной остается тем же самым в течение эксперимента, вводят каплю бактериальных сuspension в 1,7 мл центрифужную пробирку, содержащую 100 мкл стерильной PBS после каждой 48-й эмбриона. Пластина 100 мкл твою + Р чашках с агаром при 37 ° С в течение ночи, чтобы определить КОЕ в объеме инъекции.
- Когда вся группа 12 личинок на инъекции рампы была введена, тщательно использовать пластиковую передачи пипетки, чтобы удалить личинок из ячеек и поместить их в новую чашку Петри (35 х 10 мм 2). Извлеките Tricaine решение и заменить примерно 2 мл свежей среды E3, чтобы личинки восстановить.
- Пипеткой вводят личинок в отдельных лунках 96-луночного планшета и инкубировать в в 28,5 ° C. Монитор личинок в течение долгого времени для выживания в этих плит или удалить позже изображений или КОЕ пунктам.
7. Судан черные пятна нейтрофилов
Примечание: Следующие шаги можно сделать при комнатной температуре в небольшой чашке Петри (35 х 10 мм 2) на орбитальном шейкере исключением случаев, когда OTherwise заявил. Для каждого шага, количество используемого реагента составляет примерно 2 мл на чашку, используя только достаточно жидкости, чтобы полностью покрыть личинок.
- Для фиксации инфицированных личинок, используют стекло пипетки Пастера, чтобы удалить E3 среду и заменить на льду 4% параформальдегидом в растворе PBS. Сразу же место рыбу на 4 ° С до эвтаназии. Исправить в течение ночи при 4 ° С.
- Промыть 3 раза в PBS в течение 5 мин каждый.
- Пятно с судан черный (0,18% акций разводили 1: 5, в 70% -ном этаноле, 0,1% фенола) в течение 30 мин до 5 ч. Используйте стереомикроскопа, чтобы проверить, если нейтрофилов гранулы взяли на себя пятно.
- Выполнение серию 5 мин промывок, начиная с одной стирки в 70% -ном этаноле с последующим одной стирки в соотношении 1: от 70% -ным этанолом и один PBS, с последующей конечной промывкой в PBS.
- Увлажняет в PBS плюс 0,1% Tween (PBT).
- Чтобы очистить пигмент от личинок, мыть в 1% гидроксида калия / 1% перекиси водорода в течение примерно 6-10 мин. Следить за образец closelу и примерно через 5 минут, проверьте личинки под стереомикроскопом чтобы увидеть, сколько пигмента очищается. Если раствор оставляют слишком долго, желток мешки набухают и лопаются.
- Промыть 3 раза по 5 минут в каждом PBS.
- Храните образцы в любом PBS или PBT при 4 ° С в течение 1 недели до готовности к изображению и считать.
- Для изображения Судан Черный окрашенных личинок, передавать рыбу в PBT, а затем в 80% глицерина и поместить на одной полости депрессии слайда. Фиксированное положение личинки под стереомикроскопом с помощью пипетки. Изображение с помощью цветную цифровую камеру на стереомикроскопом (рис 1 Aii-IV).
8. Перечень жизнеспособных бактерий от зараженных личинок
- Эвтаназии личинок в нужном раз после инфекции в ледяной 200-300 мг / л раствора в Tricaine E3 среды.
- Внесите эвтаназии личинок в 1,7 мл центрифужные пробирки. Снимите Tricaine решение и заменить 100 мкл 0,2%Тритон Х-100 в PBS (PBSTx).
- Перемешать личинок при прохождении вверх и вниз 10 раз через иглу 27 G.
- Подготовка последовательных разведений гомогенатов в стерильной PBS. Например, если инфекционный доза 100 КОЕ, пипетки 100 мкл гомогената в 900 мкл стерильной PBS. Используя новый наконечник пипетки, передача 100 мкл разбавленного гомогената в 900 мкл стерильной PBS.
- Пластина 100 мкл разведений на агаре Columbia CNA для селективного выделения грамположительных бактерий, и инкубируют при 37 ° С в течение 48 ч. Эта среда будет обеспечивать больший выбор, чем чашки с агаром, THY + P, которые будут поддерживать рост обеих грамотрицательных и грамположительных бактерий.
- На плитах с менее чем 500 отдельных колоний, подсчитать количество колоний и умножить на коэффициент разбавления, чтобы определить количество КОЕ.
9. Фиксация личинок для работы с изображениями
- Закрепить личинок в ледяной 4% параформальдегида в PBS растворе в виде отописано в разделе 7.
- При комнатной температуре, промыть 3 раза по 5 минут в каждом PBS до визуализации.
10. Подготовка личинок для живых изображений
- Подготовьте 1,5% легкоплавких агарозы решение в Е3 при нагревании в микроволновой печи, пока раствор не станет прозрачным.
- Поместите раствора агарозы в C на водяной бане 55 °, чтобы она здорово, но не твердеет.
- Добавить Tricaine в агарозе до конечной концентрации 0,016%.
- С помощью пластмассового передачи пипетки, поместите 4-5 наркозом личинок в стеклянной нижней блюдо на сцене стереомикроскопа.
- Снимите Tricaine и раствора агарозы из водяной бане 55 ° C и дайте ему остыть при комнатной температуре в течение 1-2 мин. В то время как агарозу охлаждения, удалить как можно больше жидкости из анестезированных личинок, насколько это возможно.
- Налейте охлажденный агарозы в блюдо примерно до половины поверхности не покрыта. Вихревой блюдо для распространения агарозы. Заметим, что если агарозыслишком жарко, он убьет личинок. Кроме того, если слишком много агарозы добавляют к чашке, линза объектива микроскопа может попасть в нижнюю часть тарелки при фокусировке через агарозы.
- Использование передачи пипетки, подобрать личинки, которые плавали по бокам блюдо и пипетки их обратно в центр.
- Под стереомикроскопа, аккуратно поместите личинки, как требуется с волос петли, долгое наконечником пипетки или стеклянной палочкой. Для визуализации слухового пузырька, установите личинок, так что осталось слухового пузырька является плоской против нижней части блюда.
- Пусть агарозном остыть в течение примерно 10 мин, прежде чем перейти блюдо. Личинки могут изменять свое положение, если агарозы не солидно. Осторожно пипетки некоторое Tricaine и раствор E3 на верхней части слоя агарозы, чтобы держать его влажным.
11. конфокальной микроскопии-инфекции
- Поставьте стеклянным дном блюдо с личинками на этапе инвертированного микроскопа с FV-1000 лазерной сканирующей confocaL Система.
- Установите крошечное отверстие 200-300 мкм и с помощью числовая апертура, 0.75 / 20X объектив, установленный Z-стеки 3-6 мкм ломтиками.
- Используйте непрерывное сканирование линии для регулировки усиления мощности лазера и детектора для каждого канала.
- Использование последовательного сканирования строки для каждого флуоресценции канала (например, 488 и 543 нм) и дифференциальный интерференционный контраст (DIC), провести время съемки видео левого слухового пузырька каждые 3 мин в течение 2-6 ч, чтобы наблюдать начальный набор и фагоцитоз нейтрофилов и макрофаги. Для более курсов время, место крышку на чашке Петри, чтобы предотвратить испарение и высыхание агарозы.
- Приобретать неподвижных изображений фиксированной (рис 1В) или жить (Рисунок 2) личинки в 20х или 40х увеличении.
12. фотопреобразования Dendra2-меченого лейкоцитов в слуховым пузырьком
Примечание: Dendra2 может быть photoconverted от зеленого до красной флуоресценциипри фокусировке нм лазера 405 (50-70% мощности лазера должна быть достаточной) на область интереса (ROI) в течение 1 мин. Ниже шаг за шагом протокол, используемый для системы FV-1000 лазерного сканирования конфокальной:
- Визуализация примера с использованием сканирования Z-стека с 488 нм и 543 нм лазеров. Используйте непрерывное сканирование линии для регулировки усиления мощности лазера и детектора. Убедитесь в том, что нет случайно photoconverted красной флуоресценции.
- В окне "Image Control Приобретение", в разделе "Стимул Настройка" выберите "Использовать сканер" инструмент и выберите "Основной". Выберите волны 405 нм лазера на и установите его на 70% мощности. Использование опции круг, определить рентабельность инвестиций в слуховым пузырьком.
- Под "Стимул начать установку" выберите "Активация в серии" с предварительной активации 1 кадр, а время активации 60 000 мс. В окне "Настройка Приобретение" под "время сканирования заголовком" выберите 2 винтервалах от 00:01:00 (один для пред- и один для пост-фотопреобразования).
Примечание: После промежуток времени серия завершения сканирования, Dendra2 должны были photoconverted его красного флуоресцентного состояния. - Сканирование образец, Z-стек с помощью 488 нм и 543 нм лазеров для визуализации photoconverted красную флуоресценцию, а также оставшуюся зеленую флуоресценцию (рисунок 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Микроинъекция S. iniae в слуховым пузырьком (рисунок 1 и рисунок 2) приводит к изначально локализованного ответа хозяина. При введении правильно, бактерии должны рассматриваться только в слуховой пузырек, а не в окружающих тканях или крови. Это могут быть визуализированы в течение микроинъекции с использованием фенола красного красителя (рис 1а). Кроме того, если помечены бактерии вводят, быстрое сканирование инфицированных личинок сразу после инъекции может подтвердить бактерии только в слуховой пузырек и не окружающие ткани (рис 1B). Хотя доза, как мало, как 10 КОЕ дикого типа С. iniae способен создать смертельную инфекцию в течение 24-48 ч после заражения (ИНН), инъекции 1000 КОЕ авирулентный деформации, CPSA, не приводит к летальному инфекции и, что штамм, похоже, не размножаются в организме хозяина 24. Таким образом, это локализованная модель инфекция может differentiatе между бактериальных штаммов измененной вирулентностью.
Микроинъекция сайты изначально местной инфекции являются полезными для изучения лейкоцитов хемотаксис. Набор лейкоцитов может быть количественно либо Судан Черного окрашивания нейтрофилов гранул (рис 1А) или формальдегида фиксации люминесцентных трансгенных линий (рис 1б). Для визуализации вербовки и фагоцитоза возможности иммунных клеток, мы использовали трансгенных линий, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок Dendra2 в частности, в макрофагах Tg (MPEG1: Dendra2) 24 или нейтрофилы Tg (MPX: Dendra2) 12. Когда С. iniae вводят в слуховой пузырек из 3 DPF личинок, как нейтрофилы и макрофаги быстро завербован в течение первого 2 и ИНН (рисунок 1). Однако, когда выполнены правильно, микроинъекции PBS в слуховым пузырьком не приводит к той же надежной найма принимающих лейкоцитов (
Рисунок 2: Фагоцитоз S. iniae фагоцитов в слуховым пузырьком Трансгенные MPX:. Dendra2 () или MPEG1: Dendra2 (B) личинка заражена красно-меченого S. iniae (изображен на пурпурный) и отображаемого на пост инфекции 60 мин с использованием лазерного scannчисле конфокальной микроскопии. Масштабная линейка, 30 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: фотопреобразования макрофагов слухового пузырька 5 HPI с S. iniae. Макрофаги (изображенные на зеленый) в слухового пузырька, назначенные окружности (A), были photoconverted (В) с использованием 405 нм лазера на конфокальной микроскопии и отслеживали в течение долгого времени. К 24 HPI, photoconverted макрофаги (изображен на пурпурный) мигрировали так далеко, как ствол / хвостового кроветворной ткани (С); Масштабная линейка, 50 мкм. Увеличениями этих коробках регионов С приведены в (I) и (II), масштабной линейки 30 мкм; Стрелки указывают на photoconвратили макрофаги. Photoconverted клетки появляются белые, потому что объединенной 543 нм красной флуоресценции и все оставшиеся в 488 нм зеленую флуоресценцию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Способ инфекции используется здесь, является полезным для изучения иммунного ответа на изначально локализованного инфекции в 2-3 DPF эмбрионов и личинок. В центре воспалительного стимула, таких как инфекции, в замкнутой полости, таких как слухового пузырька позволяет для изучения нейтрофилов и макрофагов хемотаксиса и фагоцитоза. Одно предостережение инъекционных бактерии в слухового пузырька является то, что способность нейтрофилов эффективно фагоцитируют бактерии в заполненных жидкостью полостей может зависеть от конкретного микроорганизма. Хотя кишечной палочки и Сенная палочка не так легко фагоцитированы нейтрофилов в слухового пузырька 28, мы обнаружили, что нейтрофилы способны фагоцитируют как синегнойной палочки и С. iniae в этом месте 16, 24. Локализованные инфекции также полезны при изучении инвазивность различных патогенов. Для того, чтобы вызвать системная инфекция Ниже яnjection в замкнутой полости, таких как слухового пузырька, микроб должен быть способен пройти физические барьеры хост. Кроме того, различные патогены могут рассчитывать на клетках-хозяевах для транспортировки и распространения от исходного места инфекции. Это делает локализованные инъекции полезны для сравнения штаммов измененной вирулентностью.
Во время микроинъекции, чтобы избежать бактерии урегулирования и засорение иглы, иглы изменения либо после каждого условия или после примерно 50 личинок. Это поможет обеспечить подвеска в иглу является более равномерным. Если заселения бактериями в иглу, кажется, проблема, сочетание PBS, 2% PVP40 и 10% глицерина может помочь сохранить однородную суспензию. Чтобы гарантировать, что каждый личинка впрыскивают с примерно одинаковым числом бактерий, проверить счетчики КОЕ путем гомогенизации личинка сразу же после инъекции и покрытие гомогената на CNA агар. CNA агар выберет для роста культивируемых грамположительных бактерий, не толькоС. iniae, но это даст представление о том, насколько последовательны дозы впрыска составляет от каждого отдельного личинки. С целевой инокулята 100 КОЕ на личинки, то, как правило, между 75-150 колоний на тарелке CNA. Число нефинансовых S. iniae грамположительных колоний, выросших на тарелку CNA, вероятно, очень низка, так как большинство PBS вводят рыба обычно приводят между 0-20 колоний. В более поздние моменты времени, в течение инфекции, это не редкость для там быть изменение до половины бревна в подсчета колоний между личинками инфицированных с той же дозой заражения. Это может представлять небольшие различия между отдельными личинки в их способности контролировать инфекцию или может отражать различия в количестве культивируемых грам-положительных бактерий у личинок или E3 среды.
При введении в слуховым пузырьком, важно, чтобы не вводить слишком большой объем или слишком высокое давление, так как это может привести к полости к разрыву. Объемов закачки шоÜLD быть примерно 1 NL. Если игла слишком велик, микроинъекции может привести к повреждению окружающих тканей, которые могут повлиять на набор принимающих лейкоцитов к месту инфекции или может позволить бактериям вытекать из слухового пузырька. Важно также, чтобы подтвердить инъекции в правильном пространстве. Если игла вставлена слишком глубоко, это может протыкать слухового пузырька, или он может ударить кровеносные сосуды, протекающие вокруг слухового пузырька. Это может привести к осаждению бактерий в кровоток или вне пузырька, которые нарушают реакцию хозяина.
Также возможно, что, когда игла извлекается, некоторые бактерии могут быть случайно хранение вне слухового пузырька, как показано Colucci-Гийон и др. 28, но мы нашли, что это только в том случае меньше, чем 5% от инъекций. Попытка привнести в центре слухового пузырька может помочь избежать этой ситуации. В успешного заражения слухового пузырька должны заполнить WIth фенолового красного красителя, но краситель не должен вытекать в окружающие ткани. Любое неправильное вводят личинки должны быть немедленно отброшены. Инъекционных меченых бактерий полезный способ подтверждения успешного инъекции (рис 1б). Один из недостатков использования CellTracker краситель является красителем, что это станет разводили, как бактерии разделить, в конце концов, предотвращая бактерии от быть визуализированы при флуоресценции. Мы выбрали красную краску, потому что мы использовали помеченный зеленым нейтрофилов и макрофагов трансгенных линий для большинства наших исследований.
Dendra2 является photoconvertible белок, полученный из octocoral Dendronephthya Sp. которые могут быть photoconverted от зеленого до красного флуоресцентного состояния с помощью лазера 29 405 нм. Это фотопреобразования является неинвазивным способом выделения клеток и отслеживать их судьбу в течение инфекции. Лейкоциты рекрутируются в месте инфекции может быть photoconverted и последовал за время контроля за их Dissemination всей ткани хозяина (рис 3). Кроме того, лейкоциты могут быть photoconverted до заражения и затем мониторинг пост-микроинъекции, чтобы определить происхождение клеток, набранных в месте инфекции. Маркировка бактерии и клетки иммунной системы позволяет для изучения лейкоцитов патоген взаимодействий в естественных условиях, включая наем и фагоцитоза (рис 1B и рис 2). Отличительные красный меченных S. iniae из красного флуоресценции photoconverted лейкоцитов сложно, поэтому различные флуоресцентные CellTracker краситель может быть использован. Это было бы особенно полезно определить, какие из photoconverted иммунных клеток, которые оставляют слухового пузырька содержать S. iniae.
Будущие применения слухового метода инфекции везикул может включать в себя измерения скорости и направленности, с помощью которого нейтрофилы и макрофаги двигаться в ответ на различные инфекции. Инфекции кinetics также могут быть изучены, чтобы увидеть, какая ячейка типы первым прибыть на сайт инфекции и какие типы клеток наиболее энергично, набранных в дополнение к, где клетки возникают или когда они распространяют 30. В дополнение к изучению пополнением изначально локализованного инфекции, эта инфекция модель может быть использована для изучения функции хост-машины иммунной системы во время первичного инфицирования. Antisense морфолиновые олигонуклеотиды, которые нацелены на конкретные РНК могут быть использованы, чтобы сбить выражение иммунного компонентов, включая Toll-подобных рецепторов, рецепторов цитокинов и лейкоцитов, и CRISPR-CAS или технология Тален может быть использован для создания генетических мутантов. Экспрессия генов с помощью RNAseq или КПЦР также может быть использован для характеристики экспрессии некоторых генов хозяина в ответ на инфекцию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить членов лаборатории для рыбок данио ухода и обслуживания. Эта работа была выполнена при поддержке Национального института здравоохранения, Национальный исследовательский Service Award A155397 Е.А. Харви и NIH R01GM074827 Анне Huttenlocher.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml Eppendorfs | MidSci | AVSS1700 | |
| 14 ml Falcon tube | BD Falcon | 352059 | |
| 27 G x ½ in. needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 96-well Plate | Corning Incorporated | 3596 | |
| Agar | BD Biosciences | 214030 | |
| CellTracker Red | Molecular Probes, Invitrogen | C34552 | |
| CNA agar | Dot Scientific, Inc | 7126A | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-7m | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Ethanol 200 proof | MDS | 2292 | |
| Fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gel comb | VWR | 27372-482 | 4.2 mm width, 1.5 mm thick |
| Glass bottom dishes | Custom made by drilling a 16 - 18 mm hole in the center of a 35 mm tissue culture dish bottom and placing a 22 mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light. | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| High melt agarose | Denville Scientific, Inc. | CA3510-6 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | with FV-1000 system | |
| Low melt agarose | Fisher | BP165-25 | |
| Magnetic stand | Tritech (Narishige) | GJ-1 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipet tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | Tritech (Narishige) | M-152 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Nanodrop spectrophotmeter | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 100 x 15 mm |
| Phenol | Sigma Aldrich | P-4557 | |
| Phenol Red | Ricca Chemoical Company | 572516 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Potassium hydroxide | Sigma Aldrich | P-6310 | |
| Pronase | Roche | 165921 | |
| Protease peptone | Fluka Biochemika | 29185 | |
| Small cell culture dish | Corning Incorporated | 430165 | 35 x 10 mm |
| Sudan Black | Sigma Aldrich | S2380 | |
| Thin wall glass capillary injection needles | World Precision Instruments, Inc. | TW100-3 | |
| Todd Hewitt | Sigma Aldrich/Fluka Analytical | T1438 | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | Argent Chemical Laboratory/Finquel | C-FINQ-UE-100G | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast extract | Fluka Biochemika | 92144 |
References
- Agnew, W., Barnes, A. C. Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination. Vet. Microbiol. 122 (1-2), 1-15 (2007).
- Danilova, N., Steiner, L. A. B cells develop in the zebrafish pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13711-13716 (2002).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Willett, C. E., Cortes, A., Zuasti, A., Zapata, A. Early Hematopoiesis and Developing Lymphoid Organs in the Zebrafish. Dev. Dyn. 214, 323-336 (1999).
- Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
- Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development(Cambridge, England). 126 (17), 3735-3745 (1999).
- Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. G. Streptococcus-Zebrafish Model of Bacterial Pathogenesis. Infect. Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).
- Jault, C., Pichon, L., Chluba, J. Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in Danio rerio. Mol. Immunol. 40 (11), 759-771 (2004).
- Meijer, A. H., et al. Expression analysis of the Toll-like receptor and TIR domain adaptor families of zebrafish. Mol. immunol. 40 (11), 773-783 (2004).
- Seeger, A., Mayer, W. E., Klein, J. A Complement Factor B-Like cDNA clone from the Zebrafish (Brachydanio rerio). Mol. immunol. 33, 511-520 (1996).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J. Immunol. Methods. 292 (1-2), 119-129 (2004).
- Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J. Leukoc. Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. , 1-9 (2012).
- Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS ONE. 6 (2), e16779 (2011).
- Veneman, W. J., Marín-Juez, R., et al. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury. Cell. Microbiol. , (2012).
- Sar, A. M., et al. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell. Microbiol. 5 (9), 601-611 (2003).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S Inhibits Neutrophil Recruitment during the Early Stages of Streptococcus pyogenes Infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. New York, NY. (2002).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (9), 139-151 (2006).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 5 (12), e1000697 (2009).
- Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae. Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).
- Haddon, C., Lewis, J. Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
- Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -Y., Phillips, B. Development of the zebrafish inner ear. Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
- Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
- Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).
