Summary
Burada, üç boyutta normal doku parçaları canlı olarak tümör hücrelerinin istilasını incelemek için bir protokol mevcut. Bu organ kültürü tekniği, özellikle in vitro koşullarında potansiyel anti-invasif ilaçlar test etmek için uygulanır.
Abstract
Civciv, kalp deneyin amacı, üç boyutlu olarak tümör istilasını incelemek için ilgili bir organ kültür yöntemi sunmaktır. Deney invaziv ve invazif olmayan hücreler arasında ayrım ve tümör invazyonu üzerinde test bileşiklerinin etkileri etüdüne olanak sağlamıştır olabilir. Kanser hücreleri - ya agrega veya tek hücreleri gibi - embriyonik civciv kalp parçaları ile karşı karşıya kalırlar. Birkaç gün veya hafta içinde süspansiyon içinde organ kültürü sonra, karşı karşıya kültürler sabitlenmiş ve histolojik analiz için parafin içine gömülmüştür. kanser hücreleri ve normal doku arasında üç boyutlu etkileşimi, daha sonra hematoksilen-eozin ile ya da kalp dokusunda, epitoplar ya da karşı karşıya kanser hücreleri için immünohistokimyasal boyama sonrası lekelenmiş dizi bölgelerinin arasında yeniden yapılmıştır. Deney kanseri istilası kanser hücreleri ve komşu stromal ana elemanlarının (miyofibroblastlar, endoth arasındaki moleküler etkileşimlerin sonucu olduğu son kavramı ile tutarlıdırElial hücreler, hücre dışı matris bileşenleri, vs.). İşte, bu stromal ortamı yaşayan bir doku parçası olarak kanser hücrelerine sunulmaktadır. Testin alaka Destekleyici yönleri birden vardır. Ilerici işgal ve yedek zamanında ve ev sahibi dokusunun alanı ve invaziv ve karşı karşıya hücrelerin in vivo non-invaziv genel tahlilin sonucu ile ilişkilidir: tahlilde Invasion kanser işgali kriterlerine uygundur. Ayrıca, in vivo hücre istilası desen, patologlar tarafından tanımlanan deneyde histolojik görüntü yansıtılır. Çok sayıda potansiyel olarak anti-invasif organik konjener bileşiklerle elde edilen sonuçlar kantitatif yapı-aktivite ilişkisi (QSAR) analizi, klinikte kullanılan flavonoidler ve chalcone ve bilinen bir anti-metastatik ilaçlar için yapı-aktivite ilişkilerinin (örneğin, mikrotübül inhibitörleri çalışma izin ) ve deneyde istilasını inhibe eder. However, tahlil kanser işgali hesap immünolojik katkıları dikkate almaz.
Introduction
Invasion kötü huylu tümörlerin özelliğidir. Bu aktivite, çevredeki dokuların tahrip olmasına yol açar, ama aynı zamanda metastaz oluşumunda rol oynadığı gösterilmiştir tesis edilir. Kanser hastalarının invazyon ve metastaz ve etkili anti-invaziv tedaviler ölmektedir beri hala tümör hücrelerinin işgali geliştirilmiştir taklit kıt, laboratuar deneyleri bulunmaktadır. Civciv, kalp deneyin amacı, üç boyutlu olarak tümör istilasını incelemek için ilgili bir organ kültür yöntemi sunmaktır. Tahlil invaziv ve non-invaziv hücreler arasında ayrım ve tümör işgali üzerine test bileşiklerinin etkilerini incelemek için izin verir.
tahlilin kullanımı arkasındaki mantık tümörler neoplastik hücreler sürekli olarak stroma (ev sahibi hücreler ve hücre-dışı matris) etkileşim ekosistemlerin olduğu gerçek bir kavramdır ve bu moleküler interaksiyonlarda işgali ile bu ince ayarlanmış 1 olduğu. Yani, deneyde tümör hücreleri Livi ile karşı karşıya kalırlarTümör hücreleri tarafından işgali için alt-tabakalar olarak değil, aynı zamanda stroma hücreleri ve matris elemanlarının farklı bir kaynağı olarak da iş görür ng civciv embriyosu kalp fragmanları 2. Civciv, kalp miyositleri, fibroblastlar ve endotel hücreleri içerir ve hücre dışı matris laminin, fibronektin ve kollajen farklı oluşmaktadır. Bu şekilde, üç boyutlu bir organ kültürü tekniği, hasta tümör istilası karıştığı bir çok selüler ve moleküler etkileşimleri kapsar.
civciv kalp testinin ana avantajı stromal etkilerin uygulamasıdır. Bu özellik, bazal membran 3 veya interstisyel matrisin 4 molekülleri oluşan cansız jeller halinde tümör hücrelerinin istilasını dayanmaktadır, in vitro olarak, diğer invazyon deneylerde daha tamamlanır. organ kültür deney bulunan tümör hücreleri ve normal yaşam konak doku arasındaki çatışma kavramı birkaç tarafından getirilmiştirAlmanya'da 7 Wolff ve Schneider Fransa'da 5, Birleşik Krallık 6 easty ve easty ve Schleich dahil yazarlar. Atıf yöntemler üzerinde civciv kalp işgali testinin iki teknik avantajları parçalarının hacmi kolaylıkla standardize olabilir ve organ kültürü sırasında fonksiyonel bütünlük izlenmesine olanak sağlar kasılma, kalmasıdır. Bunlar yumurta içindeki steril içeriğine kesilerek edilebilir, çünkü Ayrıca, kuş embriyolar, tercih edilir. tahlil tümör hücrelerine çevreleyen karmaşık stromal sunarak civciv chorioallantois membran tahlil 8 kavramsal benzerlik vardır.
Deney başarılı şekilde 9 ve HCT-8 (Kolon), 10 hücre çizgisi ailesine MCF-7 (meme) ile aynı insan tümörlerinden invaziv ve invazif olmayan hücre varyantları arasında ayırt etmek için uygulanmıştır. teknik, hem de potansiyel olarak anti-invasif bileşikleri test etmek için kullanışlıdır
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Şekil farklı tahlil adımları 1. şematik bakış. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Önceden kültürlenmiş Kalp Fragments hazırlanması 1. (PHF'ler)
- 9 gün boyunca 37 ° C 'de, bir döllenmiş civciv yumurta inkübe edin. (Yuva Pazartesi günü, örneğin) tümör hücre agrega ile (bir Perşembe günü, örneğin) 4 gün boyunca PHF'lerin sonraki hazırlanmasını sağlayan tarih ve nihai çatışma bu inkübasyon tamamlayın.
- Su içinde% 70 (h / h) etanol ile kabuk dezenfekte. Steril çözeltiler ve malzemeler kullanılarak bir doku kültür dolabı içinde tüm diğer kullanımların gerçekleştirilmesi. Künt forseps kullanarak embriyonik kutbunda kabuk açın.
- Hol embriyo çekinding bir enükleasyon kaşık (Şekil 2) ile boyun. Ringer tuzu çözeltisi 5 ml ihtiva eden 5 sm bir çapı olan bir cam petri embriyo yerleştirin.
- Iki eliyle keskin forseps kullanarak cildinizi açık sökük ile ventral göğüs cildi açın, manipülasyon aynı türüne göre sternum kaldırmak ve onun büyük kan damarları kesmek için mikrodiseksiyon iridektomi makas kullanarak kalbini incelemek. Kalibre oküler ızgara ile bir macroscope altında tüm diğer manipülasyonlar gerçekleştirin.
Bir enükleasyon kaşıkla yumurta dışarı embriyo kaldırma Şekil 2.. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Bir cam Petri kabı kalp aktarın% 5 fetal sığır serumu ile MEM-Rega 3 kültür ortamı 5 ml ihtiva eden 5 sm bir çapa sahiptir. Mikrodiseksiyon iridektomi makas kullanarak kalbin üst kafatası üçte keserek atrial ve ilgili damarları çıkartın. Keskin forseps bir çift ile ventriküller perikard parçalara ayır.
- Makas iridektomi mikrodiseksiyon kullanarak ventriküllerde sagital hemiseksiyona yapın ve hafifçe keskin forseps ile çalkalayarak kanı çıkarın.
- % 5 fetal sığır serumu ile taze MEM-Rega 3 kültür ortamı 5 ml ihtiva eden 5 sm bir çapı olan bir cam Petri kabı içine ventriküller aktarın. Mikrodiseksiyon iridektomi makas kullanılarak çapı yaklaşık 0.4 mm parçalar halinde ventriküllerde kesilir. Bir kalp yaklaşık 100 parçaları elde edebilirsiniz.
Not: Bir kalp yaklaşık 100 parçaları verebilir - Yemeğin merkezine doğru tüm ventriküler parçaları götürmek için hafifçe Petri kabı çevirin. Eylül ile paslanmaz çelik iğne ile tüm korpus Aliena kaldırventriküler parçaları onları arating ve Petri kabı çevresine doğru onları sürüş.
- 2 kültür ortamı (MEM-Rega'ya 3 artı% 10 h / h cenin sığır serumu) içinde 3 mL içeren 50 ml'lik bir Erlenmeyer şişesine, bir cam Pasteur pipet ile kalp fragmanları aktarın.
Not: Tam orta hacimli şişeler bireysel değişken alt konveks bağlıdır: kendi alt merkezi sıvı sadece ince bir film ile kaplanmış olmalıdır. - Tapa ile hava içinde% 5 CO2 karışımı ile balon (ler), gaz, ve 24 saat süre ile 70 devir / dakika (rpm) ile 37 ° C'de bir Gyrotory çalkalayıcıda balon (ler) inkübe edilir. Bu süspansiyon kültürü aşama gerekçesi tümör hücre agregatları ile daha sonra çatışma için müsait sferik kalp dokusu parçaları elde etmektir.
- Petri kabı, kalp fragmanları ve kültür ortamı aktarın. Bir iğne ile korpus Aliena, nekrotik (karanlık) fragmanlar ve kalp parçalarının holdingleri atın.
- Başka bir 60 saat Aşama 1.9 de tarif edildiği gibi kültür ortamı 6 ml ihtiva eden bir 50 ml'lik bir Erlenmeyer şişesi içinde kalan kalp parçaları inkübe edin.
Not: Bu kuluçka süresi boyunca, fragmanları, küresel hale gelecektir. Bunlar miyoblastların bir çekirdeği ve bunun çevresinde fibroblastik hücrelerden oluşan ince bir tabaka oluşur. - Fibroblastik hücre ince, homojen bir katman (saydam bir kapsül oluşturan) ve macroscope ve iğne yoluyla 0.4 mm arasında bir çapa sergileyen küresel parçaları seçin. Bir civciv, kalp yaklaşık 20 uygun PHF'ler verecektir. Taze kültür ortamı içeren bir petri kabı, 37 ° C 'de ritmik daralacak birçoğu bu PHF'ler, aktarın. Bu PHF'ler Test hücreleri ile yüzleşme için hazırız.
2. Hazırlık ve Küresel Bremze Agregaları Çatışma
- Yan-katı agar ortamı hazırlanması: Üç kere kaynatılarak Ringer tuz çözeltisi 15 ml agar 100 mg çözülür. Güzelfetal sığır serumu ve 7.5 ml: 40 ° C'de süspansiyon ve Ringer tuzu çözeltisi 7.5 ml / yumurta akı (1: 1) ekleyin.
- 50 ml'lik bir Erlenmeyer şişesi içindeki uygun bir kültür ortamı içinde 1 x 10 5 Test hücre / ml ihtiva eden bir süspansiyon, 6 ml hazırlayın. Yüzleşmeler kültürünün başlangıcı planlanmaktadır önce 3 gün yapın. 3 gün boyunca 70 rpm'de 37 ° C'de bir Gyrotory çalkalayıcıda şişesi inkübe edin. Kullanılan kültür ortamının tipine bağlı olarak, hava içinde% 5 veya% 10 (h / h) CO2 karışımı ile şişeler gazdır.
- Kalibre göz ızgara ile donatılmış bir macroscope altında agrega görüntüleyin. 0.2 mm bir çapı olan küresel hücre agrega (bir iğne ile) seçin.
- Yarı katı agar ortamı 13 ihtiva eden bir embriyonik saat camı için kültür ortamı, minimum miktarda sekiz seçilen PHF'lerin (çap = 0.4 mm) aktarmak için, bir Pasteur pipeti kullanarak. Bir daire oluşturmak üzere bir iğne ile tek tek PHF'lerin taşıyın. Aspire aşırı ortamfiltre kağıdı küçük bir parça ile (bakınız Şekil 3).
PHF'lerin çevresinde aşırı sıvı Şekil 3. Aspirasyon. Sekiz PHF'ler bir embriyolojik saat cam yarı-katı agar yerleştirilir ve sıvı fazlalığı, küçük bir üçgen parça op filtre kağıdı ile çıkarılır. Oklar 8 ayrı PHF'ler gösteriyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Pasteur pipet kullanarak çember içine on Seçilen küresel hücre agrega (çap = 0.2 mm) getirin. Fazla orta aspire. Birbirleri ile temas yapana kadar iğne ile PHF'nin her doğru biri agrega taşıyın. Filtre kağıdı küçük bir parça kullanarak aspire aşırı ortam.
- Parafin ile saat-cam kapağı Seal ve incukesmek 4 37 ° C'de - 24 saat, PHF'lerin test hücre yapışma özelliklerine bağlı olarak değişir.
- Önceden ısıtılmış (37 ° C), kültür ortamı ile karşı karşıya çiftleri daldırın ve kültür ortamı, 1.5 ml ihtiva eden bir 5 ml'lik bir Erlenmeyer şişesi içine Pasteur pipetiyle, her bir çifti aktarın.
- 120 rpm'ye ayarlanmış 37 ° C'de bir Gyrotory çalkalayıcıda şişeler inkübe edin. Test hücreleri (bakınız Şekil 4) için kullanılan kültür ortamı türüne bağlı olarak, hava içinde% 5 veya% 10 (h / h) CO2 ile şişeler gazdır.
- , Ortam konsantrasyonunu engellemek Ringer tuzu çözeltisinin 2 ml'si ile doldurulmuş iki yan 5 ml'lik Erlenmeyer şişesinde geçirerek gazların nemlendirmek için. Her 8 gün kültür ortamı yenileyin.
Şekil 4. Küçük Erlenmeyer bir Gyrotory shak üstünde şişeleri. er kültür ortamı, 1.5 ml şişeler bir gaz içinde bulunmaktadır, silikon tıpa ile kapatılmıştır - ve çıkış iğne ve 37 ° C'de 120 rpm'de taşındı. Gaz (3 ve 4) dağıtılan bireysel, karşı karşıya gelecek çiftleri ile kültür ortamı ihtiva eden küçük şişeler daha fazla steril Ringer tuz çözeltisi ile doldurulmuş daha büyük bir Erlenmeyer şişeye (2), bir giriş boru (1) tarafından yönetilen, ve (5 ve 6). Son olarak, harcanmış gaz, steril bir su tuzağı ile daha büyük bir şişe içinde toplanmış olan (7), bu hava kaçabilir yerden (8). Şekil ev yapımı bir platform plakasının üstüne kültür pillerin iki set gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Yüzleşme Kültürlerin 3. Histoloji
- Bouin-Hollande tespit çözeltisi hazırlayın.
- Tek damıtılmış su, 100 ml kuprik asetat 2.5 g (nötr) çözündürün veyavaş pikrik asit 4.0 g ekleyin.
- Bir kağıt filtre ile çözüm Filtre. Formalin 10 ml asetik asit içinde 1 ml ilave edilir. Tek damıtılmış su içinde doymuş bir cıva klorür çözeltisi 1 kısmı ile bu çözeltinin 9 parça karıştırın.
DİKKAT: Bu çözüm çok zehirli maddeler içermektedir. Formalin, cilt ile temasında, inhalasyon yoluyla toksik ve eğer yuttu. Asetik asit alımından sonra ağız ve bağırsak için aşındırıcı olduğunu. Pikrik asit hızla ısıtılan veya perküsyon ile alerjik ve ne zaman patlayıcıdır. Civa klorür mukoza ve nefrotoxic son derece yakıcıdır. Bouin-Hollande çözeltisinin hazırlanması için koruyucu giysi ve eldiven giyin ve ateşten iyi havalandırılan alan uzaktan onu anlaştım. Alternatif bir sabitleme işlemi, fosfat tamponlu tuzlu su içinde% 4 formaldehit dayanmaktadır.
- Birkaç gün veya inkübasyon hafta şöyle sonra bireysel kültürleri sabitleyin. İlk olarak, Ringer tuzuna kültürleri aktarmakBirkaç saniye için çözüm serum proteinleri uzaklaştırmak için. Daha sonra, yaklaşık 2 saat boyunca 3 ml Bouin-Hollande sabitleme çözeltisi ihtiva eden 3 cm çapında Petri kutuları için batırın.
- Mümkün olduğu kadar tespit çözeltisi kaldırmak için 2 saat süre ile su içinde kuluçkalanmadan önce Kültürlerin demineralize su, 3 ml üç kez yıkayın. Son olarak, su içinde% 70 (h / h) etanol içinde 3 ml transfer. Bu çözümün O / N kültürleri tutun, ama bu gün bir dizi için uzatılabilir.
- 2 saat için her 96% su içinde (v / v) etanol,% 100 etanol veya% 100 izopropanol,% 100 ksilen 100 ml içeren kavanozlar yoluyla ardışık olarak aktararak kurutmak.
- (Ksilen az miktarda) ayrı bir cam lamel, her kültür transfer, parafine gömme bir şarap şişesi kapsülün altındaki lamel ve 56 ° C'de, sıvı parafın mumu ile sabit malzeme kapsar. 24 saat boyunca 56 ° C'de inkübe edin ve daha sonra oda sıcaklığına kadar gömülü malzeme soğutulur.
DİKKAT: Bir benzen türevi ksilen Teneffüs sonra toksik olabilir ve sadece iyi havalandırılan yerlerde ele alınmalıdır gibi.
- (Ksilen az miktarda) ayrı bir cam lamel, her kültür transfer, parafine gömme bir şarap şişesi kapsülün altındaki lamel ve 56 ° C'de, sıvı parafın mumu ile sabit malzeme kapsar. 24 saat boyunca 56 ° C'de inkübe edin ve daha sonra oda sıcaklığına kadar gömülü malzeme soğutulur.
- Şarap şişesi kapsülü ve lamel çıkarın ve sabit kültürünü içeren parafin blok kesip.
- Bir microtome 14 kullanarak tüm yüzleşmeler çiftinin 8 mikron kalınlığında parafin kesitleri olun ve bir yapışma ajanı olarak doku yapıştırıcısı çözeltisi ile önceden tedavi edilmiş üç alternatif mikroskop cam slaytlar tüm bölümleri toplamak. Bu immün engel olabilir, çünkü bir yapışma ajanı olarak yumurta beyazı kaçının.
Not: mikroskop cam slaytlar Tedavi öncesi doku yapıştırıcı solüsyonu 1 küçük bir damla ve Pastör pipet ile demineralize su 3 küçük damla teslim ve slayt kapsayacak şekilde onları karıştırılarak yapılır. - 10 dakika boyunca 100 mi,% 100 ksilen içeren bir kavanoza iki kez daldırılmasıyla ilk slayt parafin çıkarın.
- 10 sn için batırılarak slaytlar rehydrateiksilen / etanol (1: 1) su içinde,% 100 etanol,% 96 (h / h) etanol,% 70 su (hac / hac) etanol ve son olarak demineralize edilmiş su, aşağıdaki çözeltiler, 100 ml içeren kavanoz.
- Su içinde% 96 İyot (h / h), etanol (w / v), 2 dakika süreyle% 0.5 100 ml ihtiva eden bir kavanoz içine daldırma ile cıva klorür kristalleri eritilir.
- 10 sn için, su içinde sodyum tiosülfat (w / v)% 5, 100 ml ihtiva eden bir kavanoza bölümleri temizleyin. Sonra damıtılmış su ile iyice slaytlar yıkayın.
- , 2 dakika boyunca 100 mi, Harris hematoksilin içeren bir kavanoza slaytlar inkübe 0.1 M HCl kısa bir süre su altında ve daha sonra 10 dakika boyunca akan musluk suyu içinde yıkayın.
- 1 dakika süre ile su içinde (ağ / hac)% 0.1 eozin 100 mi ihtiva eden bir kavanoza inkübe edin.
- % 100 etanol iki kez minerali giderilmiş su, 70% (v / v) etanol,% 96 (h / h) etanol, ksilen-etanol: çözeltilerin aşağıdaki dizi 100 ml ihtiva eden kavanozlarda kısa altında kalma ile kurutmak (1: 1) ve son olarak% 100 ksilen.
- Monteslaytlar üzerinde orta 2 ayrı damla damlatmak suretiyle orta montaj slaytlar, bunların üzerine bir lamel koyarak bu genişlemesine izin ve 24 saat boyunca oda sıcaklığında sertleşmeye sağlar.
4. İmmünhistokimya
- Tris tamponlu tuz (TBS) hazırlayın. Tris- (hidroksimetil) -aminometan (Tris baz), 6.0 g minerali giderilmiş su içinde 4.5 L NaCI 45.0 g çözündürülür. 1 M HCI (yaklaşık 42 mi) ile pH 7.6 ye getirin. 5 L. yapmak için damıtılmış su ekleyin
- Tris-HCI tamponu hazırlayın. Minerali giderilmiş suyun 800 ml Tris bazı 60 g çözündürülür. 6 M HCI (yaklaşık 65 mi) ile pH 7.6 ye getirin. Kullanmadan önce distile su ile 1 L seyreltin 10x yapmak için damıtılmış su ilave edilir.
- Tris-BSA% 0.1 tamponu hazırlayın. Tris baz, 12.1 g minerali giderilmiş suyun 4.5 L NaCl 45.0 g çözündürülür. 1 M HCI (yaklaşık 42 mi) ile pH 8.2 ye getirin. Büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ve NaN 3 6.5 g 5.0 g ekleyin. 5 L. yapmak için mineralden arındırılmış su ilave
DİKKAT: NaN3 yüksek olduğuzehirli bir ürün. Asitlerle temas etmesi çok zehirli gazlar açığa çıkar. Eldiven giyin ve tüm yollarla gitmesini engellemek. NaN3 teşkil eden, bakır, kurşun ve diğer metaller ile çok hassas patlayıcı bileşikler. Bol su ile yıkayın lavabolar. Alternatif bir koruyucu% 0.01 tiyomersal olup. - Eşyaları 3,2-3,10 izleyin.
- TBS veya Tris-% 0.1 BSA tamponu slaytlar batırın ve bir kağıt havlu kullanarak bölümlerde etrafında aşırı sıvı silin.
- Co BSA (w / v) Tris-% 0.1 TBS içinde% 5 veya yüksek bir nem odası içinde 30 dakika boyunca BSA tamponu (w / v) (kapalı bir kutu seyreltilmiş 150 ul normal keçi serumu 01:20 uygulanır içeride yüksek nem sağlayan bir açık su alıcı) ile slayt -incubation. Sonra bir kağıt havlu ile aşırı sıvı kaldırmak.
- Yüksek nem odasında en az 2 saat boyunca% 1 (h / h) normal keçi serumu ile takviye edilmiş BSA (w / v) Tris-% 0.1 içerisinde seyreltilmiş 150 ul primer antiserumun uygulanır. Birincil antiserum optimal dilüsyon belirlemek empiriyapılsın.
Not: İmmünohistokimya civciv kalp antijenleri tespit etmek için kullanılabilir, fakat, özel antikorlar kullanılarak, civciv, kalp antijenleri için açıklanan teknik aynı zamanda (örneğin, yeşil fluoresan proteini), diğer antijenler 15 tatbik edilebilir. - 5-10 dakika süreyle, bir sallanan masa üzerinde BSA ağ / hac Tris-0.1% iki kez slaytlar yıkayın.
- Bir kağıt havlu ile aşırı sıvı çıkarın ve fazla 150 ul keçi anti-tavşan antiserumu geçerlidir (ör., TBS içinde 1:20) en az 1 saat boyunca yüksek nem odasında.
- 5-10 dakika süreyle, bir sallanan masa ile TBS ile iki kez yıkanır.
- Bir kağıt havlu kullanarak fazla sıvıyı çıkarın. Yüksek nem odasında en az 1 saat boyunca% 1 (h / h) normal keçi serumu ile desteklenmiş TBS içinde 250: 1 oranında seyreltilmiş peroksidaz anti-peroksidaz kompleksi uygulayın. Kompleksin seyreltme toplu bağlıdır.
- TBS ile slaytlar yıkayın ve Tris-HCl tampon, pH 7.6 aktarın.
- Bir Tris-içine slaytlar aktarınBir kaç dakika için diaminobenzidin 0.25 g / L ve% 0.01 (h / h) H2O 2 ihtiva eden HCl tampon. Civciv kalp lekeli olduğunda inkübasyon durdurun. Mikroskop altında düzenli olarak kontrol edin.
- Damıtılmış su, daha sonra 10 dakika boyunca Tris-HCI slaytlar aktarın ve.
- Öğeleri 3.13 ve 3.14 izleyin.
Not: Kolayca fiksasyon sırasında tahrip olan antijenler için, kültürlerin krio-bölümleme immünohistokimyasal analizi için bir alternatif sunabilir. Bu, aşağıdaki protokol safhaları açıklanmaktadır: - Serum proteinleri uzaklaştırmak için Ringer tuz çözeltisi, 3 ml oturma kültürleri yıkayın.
- Bir cryomicrotome ait soğutulmuş (-16 ° C) numune tutucu orta gömme bir damla ekleyin. Tamamen donmuş önce bu düşüşün üstüne bir cam lamel kenarından kültürlü doku aktarın.
- 6 mikron kalınlığında donmuş bölümleri kesmek, ° C -16 kültürün soğutun ve jelatin kaplı bunları toplamakCam slaytlar.
- 4 ° C'de depolamadan önce, 10 dakika süreyle 4 ° C 'de aseton içerisinde slaytlar düzeltildi.
- Eşyaları 4,5-4,15 izleyin.
Analiz Sonuçlarının Değerlendirilmesi 5.
Not: Bu deneyde, istila karşı karşıya Test hücreleri tarafından PHF ilerleyici işgal olarak tanımlanır. Bir karşı karşıya kültürden tüm ardışık kesitlerinin mikroskop analizi Test hücre agrega ve üç boyutlu PHF'lerin arasındaki etkileşimin yeniden sağlar.
- Etkileşim ve aşağıdaki ölçeğe göre sınıf farklı desenler gözlemleyin (Şekil 5).
Sınıf 0: Sadece PHF gözlendi. Hiçbir karşı karşıya hücreler görülebilir.
Evre I: karşı karşıya test hücreleri PHF bağlı olan, ancak kalp dokusu, hatta en dıştaki fibroblastik hücre tabakaları işgal yoktur.
Sınıf IIa: PHF'nin Meslek dış fibroblast benzeri ve miyoblast ce sınırlıdırll tabakalar.
Sınıf IIb: PHF hücre agrega çevrili ancak işgal hiçbir belirti yoktur.
Evre III: karşı karşıya hücreler PHF işgal etmiş, ancak sağlam kalp dokusunun orijinal miktarının yarısından fazlasını yapmamışlar.
Sınıf IV: karşı karşıya hücreler PHF'nin orijinal hacminin yarısından fazlasını işgal ettiler.
Not: I ve II noninvaziv hücre popülasyonlarının ile gözlenen sınıflar, sınıflarda III ve IV işgali tipik iken. Farklı zaman dilimlerinde içinde ilerlemesini değerlendirmek, histolojik analizler farklı inkübasyon süreleri sonrasında sabit kültürleri karşı karşıya uygulanmalıdır.
Karşı karşıya kanser hücreleri ve PHF'lerin arasındaki etkileşimlerin 5. Örnekler Şekil. Kültürleri karşı karşıya histolojik kesitler boyanmış ya hematoksilen-eozin (sol panel) ya da immunohistochemicall ileCivciv kalp (sağ panel) yönelik bir antikor ile y. Etkileşim sınıflarda protokol metninde tanımlanır. (H: kalp dokusu, T: Tümör hücreleri). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
6. Toksisite Değerlendirmesi İlaç Tedavileri sonra
- Pasteur pipetiyle 24 oyuklu doku kültürü çoklu-bir minimal hacimde karşı karşıya kültürleri aktarın.
- İlaç içermeyen kültür ortamında 500 ul ekleyerek kültürleri yıkayın ve 6 saat sonra yenileyin.
- Bir ters mikroskop (objektif lens 40X) ile eksplantlarından hücre akıbet için günlük bütün kuyuları kontrol edin. Karşı karşıya kültürlerin yaşam endeksi elde etmek Eksplante kültürlerin toplam sayısına göre kültürlerin outgrowing sayısını bölün. Çözücü ile tedavi edilen olanlar ile ilaçla işlenmiş kültürlerden sonuçlarını karşılaştır.
Not: CellProlif için Ki67 immünhistokimyasal kullanımı (birleşmeleri T) ve TÜNEL deneyi (THE) apoptoz toksikliğini ölçmek için eksplant tahlilinde tamamlayıcı teknikler olarak önerilmektedir.
Yüzleşme Kültürlerin 7. Büyüme Değerlendirmesi
- Dijital fotokamera ile donatılmış bir mikroskop kullanılarak, sadece tespitten önce kültürlerin siyah-beyaz-fotoğraflarını olun (objektif lens 50X)
- Mm dikkate alarak büyütme kültürü: (a) daha büyük ve daha küçük (b) çapı ölçülür.
- Formül 16 üzerinden mm 3 yaklaşık hacim (V) hesaplayın
- V = 0.4 xaxb 2
- Çatışma başında PHF ve hücre agrega kombine hacimleri ile bu son hacim karşılaştırarak kültürün büyümesini hesaplayın.
Not: yalnız PHF'ler kültür sırasında sesini azaltmak için eğiliminde olduğu için, karşı karşıya çiftlerinin büyümesi, tümör hücreleri bağlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 5'de gösterildiği gibi, histolojik bölümler başarılı deneylerde, bir dizi sonucunu göstermektedir. kültürlerin ses histoloji canlı hücreleri belirtir ve tümör hücreleri ve normal doku arasındaki etkileşimi yorumlamak için izin verir. Bundan başka, normal doku ile ilgili hiç bir bağışıklık reaksiyonu immün red sisteminin oluşturulması önce, örneğin, kullanılan piliç embriyoları doğru yaş teyit olan gözlenebilir. Kültür döneminde (brüt) kontaminasyon yokluğunu gösterir görünür hiçbir bakteri vardır. Nihayet bölümlerin yuvarlak periferi Erlenmeyer şişesi duvara (geçici) bağlılık belirtisi olmadan askıya kültür onaylar.
Birçok bileşik tahlilinde test edilmiştir. Karşı karşıya PHF / tümör agrega çiftleri küçük Erlenmeyer şişelerinde (adım 2.7) transfer edildiğinde ilaçlar genellikle şu anda kültür ortamına teslim edilir. Bazı bilinen (araç olarak kullanılmıştırönleyicileri de ve aktivatörler), tümör invazyonu sürecinde yolaklarında ve efektör molekülleri çözülmeye. Yapısal olarak ilişkili olduğu diğer bileşikler için, kantitatif yapı-aktivite ilişkisi (QSAR) piliç, kalp yayılması deneyinin sonuçlarına göre kurulmuştur. Bu nedenle, ilgili polifenolik için hesaplama tanımlayıcıların bir dizi deneyde, anti-invasif aktivitesinin tahmini sağlamak için kullanılmıştır. 15 yıllık bir süre içinde, 139 farklı analogları testinde olası bir anti-invasif etkileri bakımından test edildi ve bunların aktiviteleri 4 sınıfa gruplandırılmıştır. Bir eğitim ve 93 sırasıyla bu polifenolik 46 oluşan bir doğrulama kümesi rastgele seçildi. Bir QSAR yapay sinir ağı sayesinde doğrulama kümesi sonuçları (bakınız Şekil 6) tahmin ve deneysel anti-invaziv faaliyetleri 17 arasında açık bir ilişki olduğunu göstermiştir.
veri th sağlamlığını göstermekE civciv kalp işgali tahlil, tahmin ve deneysel sonuçlar arasındaki ilişki 15 yılı aşkın geçerli ve farklı polifenollerden ile son (yayınlanmamış) tahmin çalışmada doğrulanmıştır beri. Şekil 6'da sunulan karışıklık matris zayıflığı ve grafiksel tahlil gücünü özetlemektedir: doğruluk ve tekrarlanabilirlik kaba bir ifade verir. Bu grafiğin yorumlanması dikkate Organ kültürleri yaşayan biyolojik değişkenlik ve işgali sonuçlarının yarı kantitatif puanı almalıdır.
Şekil 6. civciv kalp istilası deneyinde küçük moleküllerin aktivitesi için bir öngörü QSAR modelinde (yapay sinir ağı) dış doğrulama. Bu model çıktısı, bir bileşiğin anti-invasif aktivitesi sınıftır. Dört tür sınıflar tanımlanmış, reprBir molekül, anti-invaziv etkinlik uyguladığı en düşük konsantrasyon esenting (yani işgali notu I veya II) CHI deneyinde: sınıf 4 (aşağı 1 uM aktif), sınıf 3 (10 uM), sınıf 2 (100 uM) ve sınıf 1 (100 uM kadar yüksek konsantrasyonlarda hiçbir anti-invasif aktivitesi). tasvir karışıklık matrisi tahmin ve deneysel doğrulama kümesi bileşiklerin anti-invaziv aktivite sınıfları belirlenmiştir karşılaştırır. doğrulama kümesi eğitimi 93. Model tahminleri sadece moleküler yapısından hesaplanan tanımlayıcıları dayanmaktadır ayarlayın ve böylece varsayımsal bileşikler için elde edilebilir, 46 bileşikleri içerir. Bu şekilde, sentetik çabalar silico aktivitesi vaat moleküllerin odaklanmış olabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PHF'lerin hazırlanması sırasında, fragmanlar süspansiyon kalmak olmayabilir ama damar duvarına yapışır; Bu kültür ortamı hacmini arttırarak aşılabilir. PHF'lerin sayısı çok düşük olduğu ve boyutu çok büyük ise, kültür ortamının düşürür. Bir araya test hücrelerinin hatası sıcaklığında veya mikrobik enfeksiyona dalgalanmalara bağlı olabilir. Alternatif olarak, agrega bir yetersizlik hücrelerinin özgü bir özelliktir olabilir. PHF için agrega bağlanması sırasında, kötü yapışma yarı katı agar ortamı üzerine kuluçka süresini uzatarak veya filtre kağıdı emici vasıtasıyla kültürleri çevresinde en fazla sıvı kültür ortamı kaldırarak aşılabilir. Bu durumda mikrobiyal kontaminasyon açısından da kontrol edin. Kesit sırasında zorluklar parafin bloklar dağılması nedeniyle olabilir: blok depolama süresi (yine parafin eritmek) çok uzun olmuştur bu gerçekleşir. Sanat kesit zamanifacts mikrotom bıçak bütünlüğü ve sabit kültürlerde korpora Aliena yokluğu kontrol edilmelidir, meydana gelir. Kültürlerde nekrotik alanlar kötü kültür koşullarında işaretleridir. Bu alanlarda kültürlerin merkezi ile sınırlı ise, biri çok büyük olması çatışmalar hacmini şüpheli gerekir. PHF ve hücre agrega hacimleri doğru seçimi gerçekten önemli bir faktördür. Ancak, daha uygunsuz pH kontrolü, mikrobiyal kirlenme veya sabitleme eserler karşı nekroz puanı genelleştirilmiş. Bölümler çok karanlık görünür Son olarak, hematoksilin daldırma süresi çok uzun olabilir, ya da bölümleri çok kalın olabilir (> 8 um).
Civciv kalp tahlil üzerinde birçok varyasyon işgali çalışmalarında başarıyla uygulanmıştır. Bu varyasyonlar konak dokuya, karşı karşıya deney hücrelerinin sunumu ve inkübasyon koşulları kökeni ile ilgilidir. Türlerden Kalp fragmanlarıCivciv 18 dışında ve karaciğer 19, akciğer 20 ve beyin 21 gibi dokulardan incelenmiştir. Bunun yerine agrega, biyopsi 22 tek tabaka parçaları 23 ve numune ve hücre süspansiyonları organ kültüründe PHF ile karşılaştırmak için kullanılmıştır. Süspansiyon kültürleri, bazen, bir yarı katı alt-tabaka 24 üzerine sabit kültürler ile ikame edilir, ve serum içermeyen bir çatışma hücreleri 25 belirli türleri ile mümkün olduğu gösterilmiştir. Genel olarak, bir etkileşim, ancak yarı niceliksel ölçekli 26 uygun olarak tarif edilmektedir, bilgisayar destekli, otomatik bir görüntü analiz sistemi de 27,28 geliştirilmiştir. İkinci amaç tümör hücresi invazyonu ölçüde niceliksel bilgi vermek.
Civciv kalp tahlil yaşayan konak doku içerir gibi, kurulum vivo durumu özetlemek için çalışır, ve açıkça o ile karşılaştırıldığında bazı alaka olduğunuin vitro ther sistemleri (giriş bölümüne bakınız). Bununla birlikte, deney, doğal tümörler, örneğin, immünolojik faktörlerin kanser hücrelerinin invaziv davranışını etkileyebilen ortamlarda mevcut microecosystem tüm unsurları kapsaması başarısız olduğu kabul edilmelidir. En az bir çalışmada, deneyde bu faktörlerin olmaması civciv kalp deneyi 29 çıktıları ve bir hayvan modeli 30 arasındaki çakışan sonuçlara yol açmıştır.
Gelecekteki uygulama tahlilde kardiyomiyosit progenitör hücrelerin çalışma olacak. Bu hücreler, kalp hastalarının enfarktüsü bölgeleri içine terapötik enjekte edilebilir, ancak miyokard içine entegre etmek gerekir. Civciv kalp deneyinde progenitör hücrelerin civciv kalp parçaları ile karşı karşıya olacak ve onların göç ve farklılaşma analiz edilecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ringer's salt solution | Braun | CEO123 | |
| Bacto-agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan Analar | VWR | 103157P | |
| BSA : albumin from bovine serum, cohn V fract. | Sigma | A4503-500G | |
| MEM-Rega 3 | Life Technologies | 19993013 | |
| Gyrotory shakers | New Brunswick Scientific | G10 and G33 | |
| Erlenmeyer flasks 50 ml | Novolab | 92717 | |
| Glass Petri dishes | Novolab | 68516 | |
| Iridectomy scissors | Rumex | 11-0625 | |
| Macroscope with calibrated ocular grid | Wild | 157702 | |
| Paraffin wax | International Medical products | 8599956 | |
| Eosin Y | Sigma | 230251-25g | |
| Harris' hematoxylin | Sigma | HHS32-1L | |
| Coverslipping resin (Tissue-Tek) | Sakura | 4494 | |
| Paraffin melting apparatus | GFL | 1052 | |
| Microtome for paraffin sectioning | Reichert | ||
| Stppers for Erlemeyer flasks with gas in- and outlets | Novolab | 2602421 and 260243 | |
| Diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| REAX rocking table | Heidolph | 54131 | |
| 24-well tissue dishes | VWR | NUNC142475 | |
| Ophtalmological enucleation spoon | Rumex | 16-060 | |
| Sharp forceps | Rumex | 4-111T | |
| Blunt forceps | Nickel-Electro LTD | 7112 | |
| Erlenmeyer flasks 5 ml | Novolab | 211901 | |
| Microscope slides washed and degreased | International Medical products | 8613908 |
References
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Van Roy, F. M., de Baetselier, P. Molecular mechanisms of cancer invasion. Encyclopedia of Cancer. JR, B. ertino 2, Academic Press. San Diego. 1072-1083 (1997).
- Mareel, M., Kint, J., Meyvisch, C. Methods of study of the invasion of malignant C3H mouse fibroblasts into embryonic chick heart in vitro. Virchows Arch. B. Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 30 (1), 95-111 (1979).
- Albini, A., Noonan, D. M. The ‘chemoinvasion’ assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr. Opin. Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- De Wever, O., et al. Single cell and spheroid collagen type I invasion assay. Methods Mol. Biol. 1070, 12-35 (2014).
- Wolff, E., Schneider, N. La transplantation prolongée d’un sarcome de souris sur des organes embryonnaires de poulet cultivés in vitro. C.R. Seances Soc. Biol. Fil. 151 (7), 1291-1292 (1957).
- Easty, G. C., Easty, D. M. An organ culture system for the examination of tumor invasion. Nature. 199, 1104-1105 (1963).
- Schleich, A. B., Frick, M., Mayer, A. Patterns of invasive growth in vitro. Human decidua graviditatis confronted with established human cell lines and primary human explants. J. Natl. Cancer Inst. 56 (2), 221-237 (1976).
- Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a Xenograftodel for Sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522 (2013).
- Bracke, M. E., Van Larebeke, N. A., Vyncke, B. M., Mareel, M. M. Retinoic acid modulates both invasion and plasma membrane ruffling of MCF-7 human mammary carcinoma cells in vitro. Br. J. Cancer. 63 (6), 867-872 (1991).
- Vermeulen, S. J., et al. Transition from the noninvasive to the invasive phenotype and loss of alpha-catenin in human colon cancer cells. Cancer Res. 55 (20), 4722-4728 (1995).
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of 3,7-dimethoxyflavone in vitro. J. Pharma. Sci. 83 (9), 1217-1221 (1994).
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of alkaloids and polyphenolics in vitro. Bioorg. Med. Chem. 5 (8), 1609-1619 (1997).
- Gaillard, P. J. Organ culture technique using embryologic watch glasses. Methods in Medical Research. MB, V. isser 2, Year Book Publishers. Chicago. 241-24 (1951).
- Romeis, B. Das mikrotom. Mikroskopische Technik. 15 Verb. Aufl. Kapitel. 7, München: Leibniz. 114-120 (1948).
- Van Marck, V., et al. P-cadherin promotes cell-cell adhesion and counteracts invasion in human melanoma. Cancer Res. 65 (19), 8774-8783 (2005).
- Attia, M. A., Weiss, D. W. Immunology of spontaneous mammary carcinomas in mice. V. Acquired tumor resistance and enhancement in strain A mice infected with mammary tumor virus. Cancer Res. 26 (8), 1787-1800 (1966).
- Katritzky, A. R., et al. QSAR modeling of anti-invasive activity of organic compounds using structural descriptors. Bioorg. Med. Chem. 14 (20), 6933-6939 (2006).
- McKinnell, R. G., Bruyneel, E. A., Mareel, M. M., Seppanen, E. D., Mekala, P. R. Invasion in vitro by explants of Lucke renal carcinoma cocultered with normal tissue is temperature dependent. Clin. Exp. Metastasis. 4 (4), 237-243 (1986).
- Wanson, J. C., de Ridder, L., Mosselmans, R. Invasion of hyperplastic nodule cells from diethylnitrosamine treated cells. Cancer Res. 41 (12 Pt 1), 5162-5175 (1981).
- Mareel, M. M., et al. Effect of temperature on invasion of MO4 mouse fibrosarcoma cells in organ culture. Clin. Exp. Metastasis. 2 (2), 107-125 (1984).
- Laerum, O. D., Steinsvag, S., Bjerkvig, R. Cell and tissue culture of the central nervous system: recent developments and current applications. Acta Neurol. Scand. 72 (6), 529-549 (1985).
- Schroyens, W., Mareel, M. M., Dragonetti, C. In vitro invasiveness of human bladder cancer from cell lines and biopsy specimens. Clin. Exp. Metastasis. 1 (2), 153-162 (1983).
- Mareel, M. M., De Bruyne, G. K., Vandesande, F., Dragonetti, C. Immunohistochemical study of embryonic chick heart invaded by malignant cells in three dimensional culture. Invasion Metastasis. 1 (3), 195-204 (1981).
- Bjerkvig, R., Laerum, O. D., Mella, O. Glioma cell interactions with fetal rat brain aggregates in vitro and with brain tissue in vivo. Cancer Res. 46 (8), 4071-4079 (1986).
- Bracke, M. E., et al. Confrontation of an invasive (MO4) and a non-invasive (MDCK) cell line with embryonic chick heart fragments in serum-free culture media. In Vitro Cell Dev. Biol. 22 (9), 508-514 (1986).
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Storme, G. A. Mechanisms of tumor spread: a brief overview. Cancer Campaign. 9: The Cancer Patient. Grundmann, E. , Gustav Fisher Verlag. Stuttgart and New York. 59-64 (1985).
- De Neve, W. J., Storme, G. A., De Bruyne, G. K., Mareel, M. M. An image analysis system for the quantification of invasion in vitro. Clin. Exp. Metast. 3 (2), 87-101 (1985).
- Smolle, J., et al. Quantitative evaluation of melanoma cell invasion in three-dimensional confrontation cultures in vitro using automated image analysis. J. Invest. Dermatol. 94 (1), 114-119 (1990).
- Bracke, M. E., et al. flavonoid effect on tumor invasion and metastasis. Food Technol. 48 (11), 121-124 (1994).
- Bracke, M. E., et al. The influence of tangeretin on tamoxifen’s therapeutic benefit in mammary cancer. J. Natl. Cancer Inst. 91 (4), 354-359 (1999).
