Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד את הפלישה של תאי גידול לחיים שברי רקמה נורמלים בשלושה ממדים. טכניקת תרבות איבר זה מיושמת בעיקר כדי לבדוק את התרופות שעלולים להיות אנטי-פולשני במבחנה.
Abstract
המטרה של assay לב החומוס היא להציע שיטת תרבות איבר רלוונטית ללמוד פלישת גידול בשלושה ממדים. Assay יכול להבחין בין תאים פולשניים ולא פולשנית, ומאפשר לימוד ההשפעות של תרכובות בדיקה בפלישת גידול. תאים סרטניים - אם כאגרגטים או תאים בודדים - מתמודדים עם שברי לב חומוס עוברי. אחרי תרבות איבר בהשעיה לכמה ימים או שבועות תרבויות התמודדות קבועות ומשובצות בפרפין לניתוח היסטולוגית. האינטראקציה תלת-ממדית בין תאי הסרטן והרקמות נורמליות אז שיחזרה מסעיפי סדרתי מוכתמים hematoxylin-eosin או לאחר מכתים immunohistochemical לאפיטופים ברקמת הלב או תאי סרטן ההתמודדות. Assay עולה בקנה אחד עם התפיסה האחרונה שפלישת הסרטן היא התוצאה של אינטראקציות מולקולריות בין תאי הסרטן ואלמנטי מארח סטרומה השכנה (myofibroblasts, endothתאי elial, רכיבי מטריצה תאיים, וכו '). כאן, סביבת סטרומה זה מוצעת לתאי הסרטן שבר רקמת חיה. היבטי תמיכה לרלוונטיות של assay הם מרובים. פלישה בassay היא בהתאם לקריטריונים של פלישת סרטן: הכיבוש מתקדם והחלפה בזמן ובמרחב של רקמת המארח, והפולשנות ולא הפולשנות vivo של התאים מתעמתים בדרך כלל בקורלציה עם התוצאה של assay. יתר על כן, דפוס הפלישה של תאים בגוף חי, כהגדרתו על ידי פתולוגים, בא לידי ביטוי בתמונות היסטולוגית בassay. ניתוח הכמותי ביחס מבנה-פעילות (QSAR) של התוצאות שהושגו עם תרכובות אורגניות שעלולים להיות אנטי-פולשני רבות משלימה אפשר המחקר של יחסי מבנה-פעילות לפלבנואידים וchalcones, ותרופות אנטי-גרורתי ידועה בשימוש בקליניקה (למשל, מעכבי microtubule ) לעכב פלישה בassay גם כן. However, assay אינו לוקח בחשבון תרומות חיסוניות לפלישת הסרטן.
Introduction
פלישה היא סימן ההיכר של גידולים ממאירים. פעילות זו מובילה לא רק להרס של רקמות הסובבות, אלא גם מעורב בהיווצרות גרורה. מאז חולי הסרטן מתים מפלישה וגרורות, וטיפולים אנטי-פולשני יעילים עדיין מבחני המחקים את הפלישה של תאים סרטניים פותחו נדירים, מעבדה. המטרה של assay לב החומוס היא להציע שיטת תרבות איבר רלוונטית ללמוד פלישת גידול בשלושה ממדים. Assay יכול להבחין בין תאים פולשניים ולא פולשנית, ומאפשר ללמוד את ההשפעות של תרכובות בדיקה בפלישת גידול.
הרציונל מאחורי השימוש של assay הוא המושג הממשי שגידולים הם מערכות אקולוגיות שבו תאי neoplastic רציפות אינטראקציה עם סטרומה (תאי מארח ומטריקס), וכי באמצעות פלישת אינטראקציות המולקולרית אלה הוא 1 מכויל. אז, בassay תאי גידול מתמודדים עם ליווישברי ng עובריים לב חומוס 2, המשמשים לא רק כמצעים לפלישה על ידי התאים הסרטניים, אלא גם כמקור של סוגים שונים של תאי סטרומה ואלמנטי מטריצה של. לב החומוס מכיל myocytes, fibroblasts ותאי האנדותל, ומטריקס מורכב מlaminin, פיברונקטין וסוגים שונים של קולגן. בדרך זו, טכניקת תרבות איבר תלת ממדים מכסה אינטראקציות תאיות ומולקולריות רבות מעורבות בפלישה של גידולי מטופל.
היתרון העיקרי של assay לב החומוס הוא יישום אפקטי סטרומה. היבט זה הוא יותר מלא מאשר במבחני פלישה אחרים במבחנה המבוססים על פלישת תאים סרטנית לג'לי שאינו חי המורכב ממרתף קרום 3 או מטריצת ביניים 4 מולקולות. הרעיון של עימות בין תאי גידול ורקמות מארח חיים נורמלים כפי שנמצא בניסויים תרבות איבר כבר הציג בכמהמחברים כוללים וולף ושניידר בצרפת 5, Easty וEasty בבריטניה 6, וSchleich בגרמניה 7. שני יתרונות טכניים של assay פלישת לב חומוס על השיטות שהובאו הוא שהנפח של שברים יכול בקלות להיות סטנדרטי, ושהם יישארו התכווצות, המאפשרת ניטור שלמות פונקציונלי בתרבות איבר. יתר על כן, עוברי עופות עדיפים, כי הם יכולים בקלות להיות גזור מתוכן סטרילי של הביצה. יש דמיון רעיוני לassay assay קרום chorioallantois החומוס 8 על ידי הצעת סטרומה מורכבת המקיפה את תאי גידול.
Assay בהצלחה יושם להבחין בין גרסאות תא פולשנית ובלתי פולשני מאותה גידולים אנושיים כגון בMCF-7 (החלב) 9 וHCT-8 (מעי הגס) 10 משפחות שורת תאים. הטכניקה זו שימושית כדי לבדוק תרכובות פוטנציאל אנטי-פולשני כמו גם
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
איור 1. סקירה סכמטי של השלבים השונים assay. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
1. הכנה של שברי לב Precultured (PHFs)
- דגירה ביצת אפרוח מופרה על 37 מעלות צלזיוס למשך 9 ימים. השלם דגירה זה עד לתאריך המאפשר ההכנה הבאה של PHFs במהלך 4 ימים (לדוגמא, ביום חמישי) ועימות סופי עם אגרגטים תא גידול (למשל, על קן יום שני).
- לחטא את הקליפה עם 70% (V / V) אתנול במים. לבצע את כל מניפולציות נוספות בקבינט תרבות רקמות באמצעות פתרונות וחומרים סטריליים. פתח את מעטפת בקוטב העוברי באמצעות מלקחיים בוטים.
- לשלוף את העובר על ידי חולדינג הצוואר עם כפית enucleation (איור 2). מניחים את העובר בצלחת פטרי מזכוכית בקוטר של 5 סנטימטר המכיל 5 מ"ל של תמיסת מלח רינגר.
- פתח את עור חזה הגחון על ידי העתקה פתוחה העור באמצעות מלקחיים חדים בשתי הידיים, להסיר את עצם החזה על ידי אותו הסוג של מניפולציה, ולנתח את הלב באמצעות מספריים iridectomy microdissection לנתק את כלי הדם העיקריים שלה. לבצע את כל מניפולציות נוספות תחת macroscope עם רשת עינית מכוילת.
איור 2. הרמת העובר מתוך הביצה עם כף enucleation. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- העבר את הלב בצלחת פטרי מזכוכית עםבקוטר של 5 סנטימטר המכיל 5 מיליליטר של ממ-Rega בינוני 3 תרבות עם 5% בסרום שור עוברי. הסר את הפרוזדורים וכלי נלווים ידי resecting שלישי הגולגולת העליונה של הלב באמצעות מספריים iridectomy microdissection. לנתח את קרום הלב מחדרי הלב עם זוג מלקחיים חדים.
- הפוך hemisection sagittal בחדרי הלב באמצעות microdissection iridectomy מספריים, ולהסיר את הדם בעדינות על ידי טלטול עם מלקחיים חדים.
- העבר את חדרי הלב לעוד צלחת פטרי מזכוכית בקוטר של 5 סנטימטר המכיל 5 מיליליטר של מדיום התרבות טרי 3 ממ-Rega עם 5% בסרום שור עוברי. חותך את חדרי הלב לחתיכות של כ 0.4 מ"מ קוטר באמצעות מספריים iridectomy microdissection. לב אחד יכול להניב כ -100 ברים.
הערה: לב אחת יכול להניב כ -100 שברים - סובב את צלחת פטרי בעדינות לנהוג כל שברי חדרית למרכז הצלחת. הסר את כל aliena corpora עם מחט נירוסטה ידי ספטמברarating מרסיסים של החדר ודוחף אותם לכיוון הפריפריה של צלחת פטרי.
- העבר את שברי לב עם pipet פסטר זכוכית לבקבוק המכיל 50 מיליליטר Erlenmeyer 2-3 מיליליטר של מדיום התרבות (MEM-Rega 3 בתוספת 10% נ / סרום שור עוברי v).
הערה: הנפח הבינוני המדויק תלוי בקימורים התחתון המשתנה של צלוחיות האישיות: המרכז התחתון שלהם צריך להיות מכוסה על ידי שכבה דקה של נוזל בלבד. - גז הבקבוק (ים) בתערובת של 5% CO 2 באוויר באמצעות פקקים, ודגירת הבקבוק (ים) על שייקר gyrotory על 37 מעלות צלזיוס ב 70 מהפכות / דקה (סל"ד) למשך 24 שעות. הרציונל לצעד תרבות השעיה זו הוא להשיג שברי רקמת לב spheroidal מתאימים לעימות הבא עם אגרגטים תא גידול.
- העבר את שברי לב ובינוני התרבות שלהם לצלחת פטרי. בטל aliena corpora, ברי נמקים (כהים), וקונגלומרטים של שברי לב עם מחט.
- דגירה שברי לב שנותרו בעוד 50 מיליליטר ארלנמייר המכיל 6 מיליליטר של מדיום התרבות כמתואר בשלב 1.9 לעוד 60 שעות.
הערה: במהלך תקופת דגירה זה, שברים יהפכו כדוריים. הם מורכבים מליבה של myoblasts ושכבה דקה של תאי fibroblastic בפריפריה. - בחר ברי spheroidal מציגים שכבה דקה ואחיד של תאי fibroblastic (להרכיב כמוסה שקופה) וקוטר של 0.4 מ"מ באמצעות macroscope ומחטים. לב אפרוח אחד יניב כ -20 PHFs המתאים. העבר את PHFs אלה, שרבים מהם יתכווצו בקצב על 37 מעלות צלזיוס, לעוד צלחת פטרי המכילה מדיום תרבות טרי. PHFs אלה מוכנים לעימות עם תאי בדיקה.
2. הכנה ועימות של אגרגטים תא מבחן spheroidal
- הכן בינוני אגר חצי מוצק: להמס של אגר 100 מ"ג ב 15 מיליליטר של תמיסת מלח רינגר ידי רותח שלוש פעמים. מגניבההשעיה ל -40 מעלות צלזיוס ולהוסיף 7.5 מיליליטר של תמיסת מלח רינגר / ביצה לבנה (1: 1) ושל 7.5 מיליליטר של סרום שור עוברי.
- הכן 6 מיליליטר של השעיה המכילה 1 × 10 5 תאים / מיליליטר מבחן במדיום המתאים התרבות שלהם בארלנמייר 50 מיליליטר. האם 3 ימים זה לפני תחילת ההתמודדות עם התרבות מתוכננת. דגירה הבקבוק על שייקר gyrotory על 37 מעלות צלזיוס ב 70 סל"ד במשך 3 ימים. גז צלוחיות עם תערובת של 5% או 10% (V / V) CO 2 באוויר, בהתאם לסוג של מדיום התרבות בשימוש.
- צפה המצרפים תחת macroscope מצויד ברשת עינית מכוילת. בחר (עם מחט) אגרגטים תא spheroidal בקוטר של 0.2 מ"מ.
- השתמש pipet פסטר להעביר שמונה PHFs נבחר (קוטר = 0.4 מ"מ) בסכום מינימאלי של מדיום התרבות לשעון זכוכית עוברית המכילה בינוני אגר מוצק למחצה 13. הזז את PHFs הבודד עם מחט כדי ליצור מעגל. בינוני עודף לשאובבאמצעות חתיכה קטנה של נייר סינון (ראה איור 3).
איור 3. שאיפה של נוזלים עודפים סביב PHFs. שמונה PHFs מונחים על אגר חצי מוצק בזכוכית שעון עוברית, ועודף נוזלים מוסר עם נייר סינון אופ חתיכה משולשת קטן. חצים מצביעים על 8 PHFs הבודד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- להביא עשרה מצרפים נבחרים תא spheroidal (קוטר = 0.2 מ"מ) למעגל באמצעות pipet פסטר. לשאוב בינוני עודף. הזז כולל אחד לכל אחד מPHF עם המחט עד שהם יוצרים קשר אחד עם השני. בינוני עודף לשאוב באמצעות חתיכה קטנה של נייר סינון.
- לאטום את המכסה של שעון זכוכית עם פרפין, וincuבייט ב 37 מעלות צלזיוס למשך 4-24 שעות, תלוי במאפייני ההדבקה של תאי המבחן לPHFs.
- לטבול את הזוגות מתעמתים עם מדיום התרבות מחומם מראש (37 ° C), ולהעביר את כל זוג בודד עם pipet פסטר ל5 מיליליטר ארלנמייר המכיל 1.5 מיליליטר של מדיום התרבות.
- דגירה צלוחיות על שייקר gyrotory על 37 מעלות צלזיוס המותאמת ל120 סל"ד. גז צלוחיות עם 5% או 10% (V / V) CO 2 באוויר, בהתאם לסוג של מדיום התרבות המשמש לתאי המבחן (ראה איור 4).
- כדי למנוע ריכוז של התקשורת, ללחלח את הגזים על ידי עובר אותם באמצעות שתי 5 מיליליטר צלוחיות Erlenmeyer משלימים מלאות 2 מיליליטר של תמיסת מלח רינגר. רענן מדיום התרבות כל 8 ימים.
איור 4. Erlenmeyer הקטן צנצנות על גבי Shak gyrotory. אה צלוחיות עם 1.5 מיליליטר של מדיום התרבות חתומות עם פקקי סיליקון מצוידים בגז ב-- ומחט שקע, ועברו ב 120 סל"ד על 37 מעלות צלזיוס. הגז בראשות צינורות יניקה (1) לבקבוק הגדול יותר Erlenmeyer (2) מלאים בתמיסת מלח רינגר סטרילי, ועוד מופץ (3 ו -4) לצלוחיות קטנות המכילות מדיום תרבות עם זוגות התמודדות אישיים (5 ו -6). לבסוף, גז בילה נאסף בבקבוק גדול יותר עם מלכודת מים סטריליים (7), מהמקום שבו יכול לברוח לאוויר (8). איור מציג שני סטים של סוללות תרבות על גבי צלחת פלטפורמת תוצרת בית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
3. היסטולוגיה של תרבויות ההתמודדות
- הכן פתרון הקיבעון של Bouin-הולנד.
- ממיסים 2.5 גרם של אצטט Cupric (ניטראלי) במים מזוקקים-אחת 100 מיליליטר ולאט להוסיף 4.0 גרם של חומצת picric.
- סנן את הפתרון דרך פילטר נייר. להוסיף 10 מיליליטר של פורמלין ו1 מיליליטר של חומצה אצטית. מערבבים 9 חלקים של פתרון זה עם חלק 1 של פתרון כלוריד כספית רווי במים מזוקקים-אחת.
זהירות: פתרון זה מכיל כמה חומרים רעילים. פורמלין הוא רעיל על ידי שאיפה, במגע עם עור, ואם בלעו. חומצה אצטית היא מאכל לפה ומערכת עיכול לאחר בליעה. חומצת picric היא אלרגני ונפיץ כאשר מהירות מחוממת או על ידי כלי הקשה. כלוריד כספית הוא מאכל מאוד לקרומים ריריים וnefrotoxic. לבש בגדים וכפפות מגן להכנת הפתרון של Bouin-הולנד, ולהתמודד עם זה בשלט רחוק אזור מאוורר היטב מאש. הליך קיבעון חלופי מבוסס על פורמלדהיד 4% בפוספט שנאגרו מלוח.
- תקן את התרבויות בודדות לאחר מספר ימים או שבועות של דגירה כדלקמן. ראשון, להעביר את התרבויות למלח רינגרפתרון לכמה שניות כדי להסיר חלבונים בסרום. בשלב הבא, לטבול בצלחות פטרי בקוטר של 3 סנטימטר המכיל פתרון הקיבעון 3 מיליליטר של Bouin-הולנד לכ 2 שעות.
- יש לשטוף את התרבויות שלוש פעמים ב 3 מיליליטר demineralized מים לפני דוגרים אותם במים למשך 2 שעות כדי להסיר כמה שפתרון קיבעון ככל האפשר. לבסוף, להעביר עד 3 מיליליטר של 70% (V / V) אתנול במים. שמור תרבויות בפתרון זה O / N, אבל זה יכול להיות מורחב למספר הימים.
- מייבש על ידי העברה רציפה בצנצנות המכילות 96% (V / V) אתנול במים, 100% אתנול או 100 isopropanol%, וקסילן 100% 100 מיליליטר לשעה 2 כל אחד.
- העבר את כל תרבות לcoverslip נפרד זכוכית (עם כמות מינימאלית של קסילן), מקום coverslip בתחתית הקפסולה בקבוק יין להטבעת פרפין, ולכסות את החומר הקבוע עם שעוות פרפין נוזלית על 56 מעלות צלזיוס. לדגור על 56 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות, ולאחר מכן לקרר את החומר המוטבע לRT.
זהירות: כקסילן נגזר בנזן עלול להיות רעיל לאחר שאיפה ויש לטפל באזורים מאווררים היטב בלבד.
- העבר את כל תרבות לcoverslip נפרד זכוכית (עם כמות מינימאלית של קסילן), מקום coverslip בתחתית הקפסולה בקבוק יין להטבעת פרפין, ולכסות את החומר הקבוע עם שעוות פרפין נוזלית על 56 מעלות צלזיוס. לדגור על 56 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות, ולאחר מכן לקרר את החומר המוטבע לRT.
- הסר את כמוסת בקבוק היין וcoverslip, ולגזור את בלוק פרפין המכיל את התרבות הקבועה.
- הפוך 8 מיקרומטר סעיפי פרפין עבים של כל זוג ההתמודדות עם שימוש 14 microtome, ולאסוף את כל החלקים על שקופיות זכוכית מיקרוסקופ שלושה משתנים שכבר קודם לכן בפתרון דבק רקמות כסוכן דבק. הימנע ביצה לבנה כסוכן דבק, כי זה עלול להפריע לimmunostaining.
הערה: לפני הטיפול של שקופיות זכוכית מיקרוסקופ נעשה על ידי מתן 1 טיפה קטנה של פתרון דבק רקמות ו -3 טיפות קטנות של מים demineralized עם pipet פסטר, וערבובם כדי לכסות את השקופיות. - הסר את פרפין מהשקופית הראשונה על ידי טבילת פעמיים בצנצנת המכילה 100 מיליליטר קסילן 100% במשך 10 דקות.
- רעננות השקופיות על ידי טבילה למשך 10 של בצנצנות המכילות מהפתרונות הבאים 100 מיליליטר: קסילן / אתנול (1: 1), 100% אתנול, 96% (V / V) אתנול במים, 70% (V / V) אתנול במים, ומים סוף סוף demineralized.
- לפזר גבישי כלוריד כספית על ידי טבילה בצנצנת המכילה 0.5% 100 מיליליטר (w / v) יוד ב -96% (V / V) אתנול במים למשך 2 דקות.
- נקה את החלקים בצנצנת המכילה 5% 100 מיליליטר (w / v) נתרן תיוסולפט במים במשך 10 שניות. לאחר מכן לשטוף את השקופיות ביסודיות במים מזוקקים.
- דגירה השקופיות בצנצנת המכילה 100 מיליליטר hematoxylin 'האריס למשך 2 דקות, לצלול לזמן קצר ב 0.1 M HCl, ולאחר מכן לשטוף במים זורמים ברז במשך 10 דקות.
- דגירה בצנצנת המכילה 100 מיליליטר eosin 0.1% (w / v) במים למשך דק 1.
- ליבש באמצעות טבילה קצרה בצנצנות המכילות הסדרה של פתרונות הבאים 100 מיליליטר: מים demineralized, 70% (V / V) אתנול, 96% (V / V) אתנול, 100% אתנול פעמיים, קסילן-אתנול (1: 1) , וקסילן לבסוף ב -100%.
- הרשקופיות עם ההרכבה בינונית על ידי מתן 2 טיפות נפרדות של המדיום בשקופיות, בואו אלה להרחיב על ידי הצבת coverslip על גבי אותם, ולתת לו להתקשות בRT במשך 24 שעות.
4. אימונוהיסטוכימיה
- הכן נאגר מלוח-טריס (TBS). ממיסים 6.0 גרם של tris- -aminomethane (hydroxymethyl) (בסיס טריס) ו45.0 גרם של NaCl ב4.5 ליטר של מים demineralized. מביא לpH 7.6 עם 1 M HCl (כ -42 מיליליטר). הוסף מים מזוקקים לעשות 5 ל '
- הכן חיץ טריס-HCl. ממיסים 60 גרם של בסיס טריס ב800 מיליליטר של מים demineralized. מביא לpH 7.6 עם 6 M HCl (כ -65 מיליליטר). הוסף מים מזוקקים כדי להפוך 1 ל מדולל 10x עם מים מזוקקים לפני השימוש.
- הכן חיץ 0.1% טריס-BSA. לפזר 12.1 גרם של בסיס טריס ו45.0 גרם של NaCl ב4.5 ליטר של מים demineralized. מביא לpH 8.2 עם 1 M HCl (כ -42 מיליליטר). להוסיף 5.0 גרם של אלבומין בסרום השור (BSA) ו -6.5 G של נאן 3. מוסיף מים demineralized לעשות 5 ל '
זהירות: NaN3 היא מאודמוצר רעיל. לתקשר עם חומצות משחרר גזים רעילים מאוד. ללבוש כפפות ולהימנע מנטילה בכל האמצעים. צורות NaN3 תרכובות נפץ רגישות מאוד עם נחושת, עופרת ומתכות אחרות. כיורי סומק עם כמויות עצומות של מים. חומר משמר חלופי הוא thiomersal 0.01%. - עקוב פריטי 3.2-3.10.
- טובלים את השקופיות בכפות או טריס-0.1% חיץ BSA, ולנגב את הנוזלים עודפים סביב הסעיפים באמצעות מגבת נייר.
- החל 150 μl עז בסרום נורמלי בדילול 01:20 בכפות או 5% (w / v) BSA בטריס-0.1% (w / v) חיץ BSA למשך 30 דקות בתא גבוהה לחות (תיבה סגורה לשיתוף -incubation של השקופיות עם נמען מים פתוח להבטיח לחות גבוהה בפנים). ואז להסיר את נוזלים עודפים במגבת נייר.
- החל 150 antiserum העיקרי μl המדולל בטריס-0.1% (w / v) BSA בתוספת סרום עז נורמלי 1% (V / V) לפחות 2 שעות בתא גבוהה לחות. לקבוע את הדילול האופטימלי של antiserum העיקרי empiriקאלי.
הערה: אימונוהיסטוכימיה יכולה לשמש כדי לזהות אנטיגנים לב חומוס אבל, באמצעות נוגדנים ספציפיים, הטכניקה המתוארת לאנטיגנים לב חומוס יכולה להיות מיושמת על אנטיגנים אחרים (כגון חלבון ניאון ירוק) 15 גם כן. - שטוף את השקופיות פעמיים בטריס-0.1% w / v BSA על שולחן מתנדנד למשך 5-10 דקות.
- הסר את נוזלים עודפים באמצעות מגבת נייר וליישם antiserum נגד ארנב 150 עיזים μl בעודף (למשל., 01:20 בTBS) במשך שעה לפחות 1 בתא גבוהה לחות.
- לשטוף פעמיים עם TBS על שולחן מתנדנד למשך 5-10 דקות.
- הסר את נוזלים עודפים באמצעות מגבת נייר. להחיל את מתחם peroxidase-אנטי-peroxidase דילול 1: 250 בכפות בתוספת 1% (V / V) בסרום עז נורמלי במשך שעה לפחות 1 בתא לחות גבוה. הדילול של המתחם תלוי ביצווה.
- שטוף את השקופיות עם כפות ולהעביר לחיץ pH טריס-HCl 7.6.
- העברת השקופיות לTris-מאגר HCl מכיל 0.25 g / L של diaminobenzidine ו0.01% (V / V) H 2 O 2 לכמה דקות. לעצור את הדגירה כאשר לב החומוס מוכתם. בדקו באופן קבוע מתחת למיקרוסקופ.
- העברת השקופיות לטריס-HCl למשך 10 דקות ולאחר מכן למים מזוקקים.
- עקוב פריטי 3.13 ו3.14.
הערה: אנטיגנים שנהרסים בקלות בקיבעון, cryosectioning של התרבויות יכול להציע חלופה לניתוח immunohistochemical. זו מתוארת בשלבי הפרוטוקול הבאים: - שטוף את תרבויות מגורים עם 3 מיליליטר של תמיסת מלח רינגר להסרת חלבונים בסרום.
- הוסף טיפה אחת של הטבעה בינונית עד precooled (-16 מעלות צלזיוס) דגימת בעל cryomicrotome. להעביר את הרקמה התרבותית מקצה coverslip זכוכית לחלק העליון של ירידה זו לפני שהוא קפוא לגמרי.
- לקרר את התרבות ל-16 מעלות צלזיוס, לחתוך 6 מיקרומטר חלקים קפואים עבים, ולאסוף אותם על ג'לטין מצופהשקופיות זכוכית.
- תקן את השקופיות באצטון על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני האחסון ב 4 מעלות צלזיוס.
- עקוב פריטי 4.5-4.15.
5. הערכת תוצאות Assay
הערה: בassay הנוכחי, פלישה מוגדרת ככיבוש ההדרגתי של PHF על ידי תאי מבחן ההתמודדות. ניתוח מיקרוסקופי של כל הסעיפים ברציפות מתרבות התמודדות מאפשר השחזור של האינטראקציה בין אגרגטים תא הבדיקה וPHFs בשלושה ממדים.
- שים לב לדפוסי אינטראקציה בכיתה על פי הסולם הבא השונים (ראה איור 5).
כיתה 0: רק PHF נצפה. ניתן לצפות לא תאי התמודדות.
הכיתה אני: תאי מבחן ההתמודדות עם מחוברים לPHF, אבל לא לכבוש את רקמת לב, אפילו לא את שכבות תאי fibroblastic החיצוניות ביותר.
הכיתה IIa: מקצוע של PHF מוגבל לספירה כמו פיברובלסטים והיצמדות למנגנון החיצוניתשכבות ll.
הכיתה IIb: PHF הקיף אגרגטים התא אבל אין סימנים של כיבוש.
הכיתה III: תאי ההתמודדות כבש PHF, אבל לא השאיר יותר ממחצית מהסכום המקורי של רקמת לב שלמה.
IV כיתה: תאי ההתמודדות כבשו יותר ממחצית מהנפח המקורי של PHF.
הערה: ציוני I ו- II הם נצפו עם אוכלוסיות תאים לא פולשנית, ואילו בכיתות III ו- IV אופייניות לפלישה. כדי להעריך את ההתקדמות במסגרות זמן שונה, ניתוח היסטולוגית צריך להיות מוחל על התמודדות עם תרבויות קבועות לאחר תקופת דגירה שונה.
איור 5. דוגמאות ליחסי גומלין בין תאי סרטן התמודדות וPHFs. סעיפים היסטולוגית של התמודדות עם תרבויות מוכתמות או עם hematoxylin-eosin (פנלים משמאל) או immunohistochemically עם נוגדן נגד לב חומוס (לוחות מימין). ציוני אינטראקציה מוגדרים בטקסט הפרוטוקול. (H: רקמת לב, T: תאי גידול). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
6. הערכת רעילות לאחר טיפולים תרופתיים
- העבר את תרבויות התמודדות בנפח מינימאלי לmultidishes תרבית רקמת 24 גם עם pipet פסטר.
- שטוף את התרבויות על ידי הוספת 500 μl של מדיום תרבות ללא סמים, ולרענן לאחר 6 שעות.
- בדוק את כל הבארות יומיות לתולדת תא מexplants באמצעות מיקרוסקופ הפוכה (עדשה אובייקטיבית 40X). מחלקים את המספר של התבגרות תרבויות במספר הכולל של תרבויות explanted להשיג מדד הישרדות של תרבויות ההתמודדות. השווה את התוצאות של תרבויות טיפול תרופתיות עם אלה שטופלו ממס.
הערה: השימוש באימונוהיסטוכימיה Ki67 (לprolif תאeration) ושל assay TUNEL (לאפופטוזיס) הם הציעו כטכניקות משלימות לassay explant להערכת רעילות.
7. הערכת צמיחה של תרבויות התמודדות
- הפוך תצלומים בשחורים-לבן של התרבויות רק לפני הקיבעון, באמצעות מיקרוסקופ מצויד במצלמות דיגיטליות (עדשה אובייקטיבית 50X)
- למדוד במ"מ קוטר (א) הגדול יותר וקטן יותר (ב) לתרבות תוך לקיחה בחשבון את ההגדלה.
- חשב את הנפח המשוער (V) במ"מ 3 באמצעות הנוסחה 16
- V = 0.4 xaxb 2
- לחשב את צמיחתה של התרבות על ידי השוואת נפח סופי זה עם הכרכים בשילוב של PHF ומצטבר תא בתחילת העימות.
הערה: מאחר PHFs הבודד נוטה להקטין את נפחן בתרבות, הצמיחה של זוגות ההתמודדות תלויה בתאים הסרטניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הסעיפים היסטולוגית כפי שהוצגו באיור 5 מראים את התוצאה הסופית של מספר מבחני מוצלחים. היסטולוגיה הקול של התרבויות מציינת תאי קיימא ומאפשרת לפרש את האינטראקציה בין תאי גידול ורקמות נורמליות. יתר על כן, ניתן לצפות שום תגובה חיסונית מהרקמה הנורמלית, אשר מאשרת את הגיל הנכון של עובר החומוס משמש דוגמא, לפני שמערכת הדחייה החיסונית מפותחת. אין חיידקים גלויים, המצביע על העדר הזיהום (ברוטו) בתקופת התרבות. לבסוף הפריפריה המעוגלת של הסעיפים מאשרת תרבות בהשעיה ללא סימנים של דבקות (זמנית) לקיר ארלנמייר.
תרכובות רבות נבדקו בassay. תרופות בדרך כלל מועברות למדיום התרבות ברגע שבו הזוגות הכולל PHF / גידול ההתמודדות מועברים לצלוחיות קטנות Erlenmeyer (שלב 2.7). חלקם משמשים ככלים (ידוע במעכבים ומפעילים) לפענח מסלולים ומולקולות מפעיל מעורבים בתהליך של חדירת גידול. לתרכובות אחרות שהיו קשורה מבחינה מבנית, יחסי מבנה-פעילות כמותית (QSAR) הוקם על בסיס התוצאות של assay פלישת לב חומוס. אז, לpolyphenolics קשור מספר המתארים חישובית שימש כדי לאפשר החיזוי של הפעילות אנטי-פולשני בassay. על פני תקופה של 15 שנים 139 תחליפים שונים נבדקו להשפעות אנטי-פולשני האפשריים שלהם בassay, ופעילותם קובצו ל4 כיתות. הכשרה וערכת אימות בהיקף של 93 ו -46 של אלה polyphenolics בהתאמה נבחרו באופן אקראי. באמצעות רשת עצבית מלאכותית QSAR התוצאות של קבוצת האימות הראו מתאם ברור בין הפעילות אנטי-פולשני חזתה וניסיונית 17 (ראה איור 6).
הנתונים מראים על חוסנו של הassay פלישת לב חומוס דואר, מאז המתאם בין תוצאות חזויות וניסיוניות היה בתוקף במשך 15 שנים, ואישר במחקר שנערך לאחרונה (לא פורסם) חיזוי עם polyphenolics שונה. מטריצת הבלבול מוצגת באיור 6 מסכמת את החולשה והחוזק של assay גרפי: זה נותן ביטוי גס של הדיוק והשחזור. הפרשנות של גרף זה צריכה לקחת בחשבון את השונות הביולוגיות של חיים תרבויות איבר, וציון הכמותי למחצה של תוצאות הפלישה.
איור 6. אימות חיצונית של מודל חיזוי QSAR (רשת עצבית מלאכותית) לפעילות של מולקולות קטנות בassay פלישת לב חומוס. הפלט של מודל זה הוא מעמד הפעילות אנטי-פולשני של מתחם. ארבע כיתות כאלה הוגדרו, representing הריכוז הנמוך ביותר שבי מולקולה מפעילה פעילות אנטי-פולשני (כלומר כיתה פלישה, I או II) בassay CHI: כיתה 4 (פעילה עד 1 מיקרומטר), כיתה 3 (10 מיקרומטר), כיתה 2 (100 מיקרומטר) וכיתה 1 (אין פעילות אנטי-פולשני בריכוזים גבוהים ככל 100 מיקרומטר). מטריצת הבלבול המתוארת משווה חזתה ונקבעה באופן ניסיוני כיתות פעילות אנטי-פולשני לתרכובות של סט האימות. סט האימות מכיל 46 תרכובות, ההכשרה להגדיר 93. תחזיות מודל מבוססות אך ורק על מתארים מחושבים ממבנה מולקולרי, ובכך ניתן להשיג עבור תרכובות היפותטי. בדרך זו, יכול להיות ממוקדות במאמצים סינטטיים על מולקולות עם מבטיח בפעילות סיליקון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במהלך תקופת ההכנה של PHFs, שברים לא יכולים להישאר בהשעיה אלא לדבוק בקיר הכלי; זה ניתן להתגבר על ידי הגדלת נפח בינוני התרבות. אם מספר PHFs הוא נמוך מדי והגודל שלהם הוא גדול מדי, להחליש את עוצמת הקול של מדיום התרבות. כישלון של תאי הבדיקה כדי לצבור יכול להיות בגלל תנודות בטמפרטורה או לזיהום חיידקים. לחלופין, חוסר יכולת לצבור עשויה להיות מאפיין של התאים. במהלך ההתקשרות של אגרגטים לPHF, הידבקות עניה ניתן להתגבר על ידי הארכת תקופת הדגירה על גבי המדיום אגר המוצק למחצה או על ידי הסרת מדיום תרבות יותר נוזל סביב התרבויות באמצעות קליטת נייר סינון. בדוק גם לזיהום מיקרוביאלי במקרה זה. קשיים במהלך חתך יכולים להיות בגלל ההתפוררות של בלוקים פרפין: זה מתרחש כאשר תקופת האחסון של בלוקים כבר זמן רב מדי (להמס את פרפין שוב). כאשר חתך אמנותifacts להתרחש, השלמות של סכין microtome והעדר aliena corpora בתרבויות הקבועים צריכה להיבדק. אזורי נמקים בתרבויות סימנים של תנאי תרבות עניים. אם האזורים אלה מוגבלים למרכז התרבויות, יש לחשוד היקף עימותים להיות גדול מדי. בחירה נכונה של הכרכים של אגרגטים PHF ותא היא אכן גורם קריטי. עם זאת, יותר כללי נקודות נמק לקראת שליטה בלתי הולמת pH, זיהום מיקרוביאלי או חפצי קיבעון. לבסוף, כאשר החלקים מופיעים כהים מדי, תקופת הטבילה בhematoxylin עשויה להיות ארוכה מדי, או החלקים עשויים להיות עבים מדי (> 8 מיקרומטר).
וריאציות רבות על assay לב החומוס יושמו בהצלחה בלימודי פלישה. וריאציות אלה מתייחסים למקור של רקמת המארח, המצגת של תאי מבחן ההתמודדות, ותנאי הדגירה. שברי לב ממיניםמלבד חומוס 18, ומרקמות כגון כבד 19, ריאה 20, ומוח 21, נבדק. במקום אגרגטים, ביופסית דגימות 22 ברי monolayer 23, והשעיות תא היו בשימוש להתעמת עם PHF בתרבות איבר. תרבויות השעיה מוחלפות לעתים בתרבויות סטטי על גבי מצע מוצק למחצה 24, ועימותים סרום ללא הוכחו להיות ריאלי עם סוגים מסוימים של תאים 25. בדרך כלל, את האינטראקציה מתוארת בהתאם לסולם כמו חצי 26 לעומת זאת, מערכות ניתוח תמונה אוטומטית בעזרת מחשב גם פותחו 27,28. המטרה האחרונה לספק מידע כמותי על היקף פלישת תאים סרטניים.
כassay לב החומוס כולל רקמת מארח חיים, ההתקנה מנסה לשחזר את המצב in vivo, וברורה היא של כמה רלוונטי לעומת oמערכות יס במבחנה (ראה סעיף מבוא). צריך, עם זאת, יש להכיר כי assay אינו מקיף את כל האלמנטים של microecosystem הנוכחי בגידולים טבעיים, בסביבות שבן לדוגמא גורמים חיסוניים יכולים להשפיע על ההתנהגות פולשנית של התאים הסרטניים. במחקר אחד לפחות, העדר הגורמים כגון בassay הוביל לתוצאות סותרות בין התוצאות של assay לב אפרוח 29 ואלה של מודל חיה 30.
יישום עתידי יהיה המחקר של תאי cardiomyocyte בassay. ניתן להזריק תאים אלה טיפולי לאזורי אוטם של חולי לב, אבל הם צריכים להיות מסוגלים להשתלב בשריר הלב. בassay לב החומוס והתאים יהיו להתמודד עם שברי לב חומוס, וההגירה ובידולם ינותחו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ringer's salt solution | Braun | CEO123 | |
| Bacto-agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan Analar | VWR | 103157P | |
| BSA : albumin from bovine serum, cohn V fract. | Sigma | A4503-500G | |
| MEM-Rega 3 | Life Technologies | 19993013 | |
| Gyrotory shakers | New Brunswick Scientific | G10 and G33 | |
| Erlenmeyer flasks 50 ml | Novolab | 92717 | |
| Glass Petri dishes | Novolab | 68516 | |
| Iridectomy scissors | Rumex | 11-0625 | |
| Macroscope with calibrated ocular grid | Wild | 157702 | |
| Paraffin wax | International Medical products | 8599956 | |
| Eosin Y | Sigma | 230251-25g | |
| Harris' hematoxylin | Sigma | HHS32-1L | |
| Coverslipping resin (Tissue-Tek) | Sakura | 4494 | |
| Paraffin melting apparatus | GFL | 1052 | |
| Microtome for paraffin sectioning | Reichert | ||
| Stppers for Erlemeyer flasks with gas in- and outlets | Novolab | 2602421 and 260243 | |
| Diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| REAX rocking table | Heidolph | 54131 | |
| 24-well tissue dishes | VWR | NUNC142475 | |
| Ophtalmological enucleation spoon | Rumex | 16-060 | |
| Sharp forceps | Rumex | 4-111T | |
| Blunt forceps | Nickel-Electro LTD | 7112 | |
| Erlenmeyer flasks 5 ml | Novolab | 211901 | |
| Microscope slides washed and degreased | International Medical products | 8613908 |
References
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Van Roy, F. M., de Baetselier, P. Molecular mechanisms of cancer invasion. Encyclopedia of Cancer. JR, B. ertino 2, Academic Press. San Diego. 1072-1083 (1997).
- Mareel, M., Kint, J., Meyvisch, C. Methods of study of the invasion of malignant C3H mouse fibroblasts into embryonic chick heart in vitro. Virchows Arch. B. Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 30 (1), 95-111 (1979).
- Albini, A., Noonan, D. M. The ‘chemoinvasion’ assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr. Opin. Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- De Wever, O., et al. Single cell and spheroid collagen type I invasion assay. Methods Mol. Biol. 1070, 12-35 (2014).
- Wolff, E., Schneider, N. La transplantation prolongée d’un sarcome de souris sur des organes embryonnaires de poulet cultivés in vitro. C.R. Seances Soc. Biol. Fil. 151 (7), 1291-1292 (1957).
- Easty, G. C., Easty, D. M. An organ culture system for the examination of tumor invasion. Nature. 199, 1104-1105 (1963).
- Schleich, A. B., Frick, M., Mayer, A. Patterns of invasive growth in vitro. Human decidua graviditatis confronted with established human cell lines and primary human explants. J. Natl. Cancer Inst. 56 (2), 221-237 (1976).
- Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a Xenograftodel for Sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522 (2013).
- Bracke, M. E., Van Larebeke, N. A., Vyncke, B. M., Mareel, M. M. Retinoic acid modulates both invasion and plasma membrane ruffling of MCF-7 human mammary carcinoma cells in vitro. Br. J. Cancer. 63 (6), 867-872 (1991).
- Vermeulen, S. J., et al. Transition from the noninvasive to the invasive phenotype and loss of alpha-catenin in human colon cancer cells. Cancer Res. 55 (20), 4722-4728 (1995).
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of 3,7-dimethoxyflavone in vitro. J. Pharma. Sci. 83 (9), 1217-1221 (1994).
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of alkaloids and polyphenolics in vitro. Bioorg. Med. Chem. 5 (8), 1609-1619 (1997).
- Gaillard, P. J. Organ culture technique using embryologic watch glasses. Methods in Medical Research. MB, V. isser 2, Year Book Publishers. Chicago. 241-24 (1951).
- Romeis, B. Das mikrotom. Mikroskopische Technik. 15 Verb. Aufl. Kapitel. 7, München: Leibniz. 114-120 (1948).
- Van Marck, V., et al. P-cadherin promotes cell-cell adhesion and counteracts invasion in human melanoma. Cancer Res. 65 (19), 8774-8783 (2005).
- Attia, M. A., Weiss, D. W. Immunology of spontaneous mammary carcinomas in mice. V. Acquired tumor resistance and enhancement in strain A mice infected with mammary tumor virus. Cancer Res. 26 (8), 1787-1800 (1966).
- Katritzky, A. R., et al. QSAR modeling of anti-invasive activity of organic compounds using structural descriptors. Bioorg. Med. Chem. 14 (20), 6933-6939 (2006).
- McKinnell, R. G., Bruyneel, E. A., Mareel, M. M., Seppanen, E. D., Mekala, P. R. Invasion in vitro by explants of Lucke renal carcinoma cocultered with normal tissue is temperature dependent. Clin. Exp. Metastasis. 4 (4), 237-243 (1986).
- Wanson, J. C., de Ridder, L., Mosselmans, R. Invasion of hyperplastic nodule cells from diethylnitrosamine treated cells. Cancer Res. 41 (12 Pt 1), 5162-5175 (1981).
- Mareel, M. M., et al. Effect of temperature on invasion of MO4 mouse fibrosarcoma cells in organ culture. Clin. Exp. Metastasis. 2 (2), 107-125 (1984).
- Laerum, O. D., Steinsvag, S., Bjerkvig, R. Cell and tissue culture of the central nervous system: recent developments and current applications. Acta Neurol. Scand. 72 (6), 529-549 (1985).
- Schroyens, W., Mareel, M. M., Dragonetti, C. In vitro invasiveness of human bladder cancer from cell lines and biopsy specimens. Clin. Exp. Metastasis. 1 (2), 153-162 (1983).
- Mareel, M. M., De Bruyne, G. K., Vandesande, F., Dragonetti, C. Immunohistochemical study of embryonic chick heart invaded by malignant cells in three dimensional culture. Invasion Metastasis. 1 (3), 195-204 (1981).
- Bjerkvig, R., Laerum, O. D., Mella, O. Glioma cell interactions with fetal rat brain aggregates in vitro and with brain tissue in vivo. Cancer Res. 46 (8), 4071-4079 (1986).
- Bracke, M. E., et al. Confrontation of an invasive (MO4) and a non-invasive (MDCK) cell line with embryonic chick heart fragments in serum-free culture media. In Vitro Cell Dev. Biol. 22 (9), 508-514 (1986).
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Storme, G. A. Mechanisms of tumor spread: a brief overview. Cancer Campaign. 9: The Cancer Patient. Grundmann, E. , Gustav Fisher Verlag. Stuttgart and New York. 59-64 (1985).
- De Neve, W. J., Storme, G. A., De Bruyne, G. K., Mareel, M. M. An image analysis system for the quantification of invasion in vitro. Clin. Exp. Metast. 3 (2), 87-101 (1985).
- Smolle, J., et al. Quantitative evaluation of melanoma cell invasion in three-dimensional confrontation cultures in vitro using automated image analysis. J. Invest. Dermatol. 94 (1), 114-119 (1990).
- Bracke, M. E., et al. flavonoid effect on tumor invasion and metastasis. Food Technol. 48 (11), 121-124 (1994).
- Bracke, M. E., et al. The influence of tangeretin on tamoxifen’s therapeutic benefit in mammary cancer. J. Natl. Cancer Inst. 91 (4), 354-359 (1999).
