Summary
Her presenterer vi en protokoll for å studere invasjon av tumorceller til normale levende vev fragmenter i tre dimensjoner. Dette organet kultur teknikken er i hovedsak brukt til å teste potensielt anti-invasive medikamenter in vitro.
Abstract
Målet med dama hjertet analysen er å tilby en relevant organ kultur metode for å studere tumorinvasjon i tre dimensjoner. Analysen kan skille mellom invasive og ikke-invasive celler, og muliggjør studium av effekten av testforbindelser på tumorinvasjon. Kreftceller - enten som tilslag eller enkeltceller - blir konfrontert med fragmenter av embryonale chick hjerte. Etter organkultur i suspensjon i noen dager eller uker de motstå kulturene fiksert og innstøpt i parafin for histologisk analyse. Den tredimensjonale interaksjon mellom kreftceller og normale vev blir så rekonstruert fra seriesnitt farget med hematoksylin-eosin eller etter immunohistokjemisk farging for epitoper i hjertevevet, eller de motstående kreftceller. Analysen er i overensstemmelse med den siste konsept som kreft invasjon er et resultat av molekylære interaksjoner mellom kreftceller og deres nabo stromale vertselementer (myofibroblasts, endothelial celler, ekstracellulære matrisekomponenter, etc.). Her er denne stromal miljøet tilbudt kreftcellene som et levende vev fragment. Støtte aspekter til relevansen av analysen er flere. Invasjon i analysen er i overensstemmelse med kriteriene for kreft invasjon: progressiv yrke og utskifting i tid og rom i vertsvevet, og invasivitet og ikke-invasivitet in vivo av de motstående celler korrelerer generelt med resultatet av analysen. Videre invasjonen mønsteret av celler in vivo, som definert av patologer, gjenspeiles i de histologiske bildene i analysen. Kvantitativ struktur-aktivitet-forhold (QSAR) analyse av resultatene oppnådd med en rekke potensielt anti-invasive kongener organiske forbindelser som tillot undersøkelse av struktur-aktivitetsrelasjoner for flavonoider og chalconer, og kjente anti-metastatiske midler som anvendes i klinikken (f.eks mikrotubul-inhibitorer ) hemmer invasjon i analysen også. However, ikke analysen tar ikke hensyn til immunologiske bidrag til kreft invasjon.
Introduction
Invasion er kjennetegnet av ondartede svulster. Denne aktiviteten ikke bare fører til ødeleggelse av omkringliggende vev, men er også implisert i metastasedannelse. Siden kreftpasienter dør av invasjon og metastase, og effektive anti-invasiv behandling er fremdeles sjeldne, laboratorieanalyser som etterligner invasjon av tumorceller har blitt utviklet. Målet med dama hjertet analysen er å tilby en relevant organ kultur metode for å studere tumorinvasjon i tre dimensjoner. Analysen kan skille mellom invasive og ikke-invasive celler, og gjør det mulig å studere effektene av testforbindelser på tumorinvasjon.
Begrunnelsen for bruk av analysen er selve konseptet at svulster er økosystemer der de neoplastiske cellene kontinuerlig samhandler med sine stroma (vertsceller og ekstracellulære matrise), og at vi gjennom disse molekylære interaksjoner invasjon er finjustert 1. Så, i analysen tumorceller blir konfrontert med Living embryoniske kylling hjerte fragmenter 2, som tjener ikke bare som substrater for invasjon av tumorceller, men også som en kilde til forskjellige typer av stromale celler og matriseelementer. Dama hjerte inneholder muskelceller, fibroblaster og endotelceller, og den ekstracellulære matriks består av laminin, fibronektin og forskjellige typer av kollagen. På denne måten, omfatter den tredimensjonale organkultur teknikk mange cellulære og molekylære interaksjoner involvert i invasjon av pasient tumorer.
Den største fordelen med dama hjertet analysen er implementeringen av stromale effekter. Dette aspektet er mer fullstendig enn i andre invasjons analyser in vitro som er basert på tumorcelle-invasjon i ikke-levende geler som består av basalmembran 3 eller interstitial matrise 4 molekyler. Begrepet konfrontasjon mellom tumorceller og normale vertsvev løsning som finnes i organkultur eksperimenter er blitt introdusert av flereForfatterne inkludert Wolff og Schneider i Frankrike 5, easty og easty i Storbritannia 6 og Schleich i Tyskland 7. To tekniske fordeler ved brud hjerte invasjonen assay de siterte fremgangsmåter er at volumet av fragmentene lett kan standardiseres, og at de forblir kontraktile, som tillater funksjonell integritet overvåking under organkultur. Videre er avian embryo foretrukket, fordi de lett kan dissekert fra det sterile innhold av egg. Analysen har konseptuelle likhet med den dama chorioallantois membranen assay 8 ved å tilby et kompleks stromal omgir til tumorcellene.
Analysen har med hell vært anvendt for å skille mellom invasive og ikke-invasive cellevariantene fra de samme humane tumorer slik som i MCF-7 (bryst-) 9 og HCT-8 (kolon) 10 cellelinje familier. Den teknikken er nyttig for å teste potensielle anti-invasive forbindelser, så vel
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figur 1. Skjematisk oversikt over de ulike analysetrinnene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
1. Utarbeidelse av-dyrket Hjerte Fragments (PHFs)
- Inkuber et befruktet chick egg ved 37 ° C i 9 dager. Fylles inkubasjon av en dato som gjør at påfølgende utarbeidelse av PHFs under 4 dager (f.eks, på en torsdag) og endelige konfrontasjon med tumorcelleansamlinger (for eksempel på reiret mandag).
- Desinfisere skallet med 70% (v / v) etanol i vann. Utføre alle ytterligere manipulasjoner i en vev kultur kabinett som bruker sterile løsninger og materialer. Åpne skallet på embryonale polet med butte pinsett.
- Trekk ut embryo av holding halsen med en enucleation skje (figur 2). Plasser embryo i en glasspetriskål med en diameter på 5 cm inneholdende 5 ml Ringers saltoppløsning.
- Åpne ventral thorax huden ved å rippe åpne huden ved hjelp av en skarp tang i begge hender, fjern sternum av samme type manipulasjon, og dissekere ut hjertet ved hjelp mikrodisseksjon iridectomy saks for å koble sine store blodkar. Utføre alle videre manipulasjoner under en macroscope med en kalibrert okulær rutenett.
Figur 2. Løfte embryo ut av egget med en enucleation skje. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Overfør hjerte til et glass petriskål meden diameter på 5 cm inneholdende 5 ml MEM-Rega 3 kulturmedium med 5% føtalt bovint serum. Fjern atriene og tilhørende fartøy ved resecting øvre kranie tredjedel av hjertet ved hjelp mikrodisseksjon iridectomy saks. Dissekere hjerteposen fra ventriklene med et par skarpe tang.
- Lag en sagittal hemisection i ventriklene bruker mikrodisseksjon iridectomy saks, og fjern blodet ved forsiktig risting med en skarp tang.
- Overfør ventriklene i en annen glasspetriskål med en diameter på 5 cm inneholdende 5 ml friskt MEM-Rega 3 kulturmedium med 5% føtalt bovint serum. Skjær ventriklene i biter på ca 0,4 mm i diameter ved hjelp mikrodisseksjon iridectomy saks. Ett hjerte kan gi om lag 100 fragmenter.
Merk: Ett hjerte kan gi om lag 100 fragmenter - Roter petriskål forsiktig for å kjøre alle ventrikulære fragmenter mot midten av fatet. Fjern alle korpus aliena med en rustfritt stål nål av septemberarating dem fra den ventrikulære fragmenter og styre dem mot omkretsen av petriskålen.
- Overfør hjerte fragmenter med en glass Pasteur pipette til en 50 ml Erlenmeyer kolbe inneholdende 2 til 3 ml kulturmedium (MEM-Rega 3 pluss 10% v / v føtalt bovint serum).
Merk: Den eksakte medium volum avhenger av variable bunn konveksiteter av de enkelte kolber: sentrum av deres bunnen skal være dekket av en tynn film av bare væske. - Gass kolben (e) med en blanding av 5% CO2 i luft gjennom proppene, og inkuber kolben (e) på en gyrotory risteapparat ved 37 ° C ved 70 omdreininger / minutt (rpm) i 24 timer. Begrunnelsen for dette suspensjonskultur skritt er å få sferoide hjertet vevfragmenter egnet for påfølgende konfrontasjon med tumorcelle aggregater.
- Overfør hjertet fragmenter og deres kultur medium til en petriskål. Kast korpus aliena, nekrotiske (mørke) fragmenter, og konglomerater av hjerte fragmenter med en nål.
- Inkuber de resterende hjerte-fragmentene i en 50 ml Erlenmeyerkolbe inneholdende 6 ml kulturmedium som beskrevet i trinn 1,9 i ytterligere 60 timer.
Merk: Under denne inkubasjonstiden, vil fragmentene bli sfærisk. De består av en kjerne av myoblaster og et tynt lag av fibrino-blastceller i periferien. - Velg kuleformede fragmenter oppviser et tynt, homogent lag av fibrino-blastceller (som danner en gjennomsiktig kapsel) og en diameter på 0,4 mm ved hjelp av en macroscope og nåler. En chick hjerte vil gi ca 20 egnede PHFs. Overføre disse PHFs, hvorav mange vil kontrakten rytmisk ved 37 ° C, til en annen petriskål inneholdende friskt kulturmedium. Disse PHFs er klar for konfrontasjon med testceller.
2. Utarbeidelse og Konfrontasjon av kuleformede testcelle Aggregater
- Forbered halvfast agarmedium: Løs opp 100 mg agar i 15 ml Ringer-saltoppløsning ved koking tre ganger. Kjøligav suspensjonen til 40 ° C og tilsett 7,5 ml Ringers saltoppløsning / eggehvite (1: 1) og 7,5 ml føtalt bovint serum.
- Forbered 6 ml av en suspensjon inneholdende 1 x 10 5 testceller / ml i deres passende dyrkningsmedium i en 50 ml Erlenmeyer-kolbe. Gjør dette 3 dager før starten av den konfronterende kultur er planlagt. Inkuber i kolben på en gyrotory risteapparat ved 37 ° C ved 70 opm i 3 dager. Gass kolber med en blanding av 5% eller 10% (v / v) CO 2 i luft, avhengig av typen av kulturmedium som brukes.
- Vis aggregatene under en macroscope utstyrt med en kalibrert okulær rutenett. Velg (med en kanyle) sfæroidal celleaggregater med en diameter på 0,2 mm.
- Bruk en Pasteur pipette for å overføre utvalgte åtte PHFs (diameter = 0,4 mm) i en minimal mengde av kulturmedium til en embryologiske klokke-glass inneholdende halvfast agarmedium 13. Flytt de enkelte PHFs med en nål for å danne en sirkel. Aspirer overflødig mediumved hjelp av et lite stykke filterpapir (se figur 3).
Figur 3. Aspirasjon av overflødig væske rundt PHFs. Åtte PHFs er plassert på halvfast agar i en embryologiske urglass, og overskudd av væske fjernes med en liten trekantet stykke op filterpapir. Pilene viser 8 individuelle PHFs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Ta ti utvalgte sfæroidal celleaggregater (diameter = 0,2 mm) i sirkelen ved hjelp av en Pasteur pipette. Aspirer overflødig medium. Bevege en samlet mot hver av de PHF med nålen inntil de får kontakt med hverandre. Aspirer skytende medium ved hjelp av et lite stykke filterpapir.
- Forsegle lokket av se-glass med parafin, og incubate ved 37 ° C i 4-24 timer, avhengig av de klebende egenskaper til testcellene til PHFs.
- Dyppe de motstående parene med forvarmet (37 ° C) kulturmedium, og overføre hver enkelt par med en Pasteur-pipette inn i en 5 ml Erlenmeyer-kolbe inneholdende 1,5 ml av kulturmediet.
- Inkuber kolber på en gyrotory risteapparat ved 37 ° C ble justert til 120 rpm. Gass kolber med 5% eller 10% (v / v) CO 2 i luft, avhengig av typen av kulturmedium som brukes til testcellene (se figur 4).
- For å unngå konsentrasjon av media, fukte gasser ved å føre dem gjennom to tilleggs 5 ml Erlendmeyerkolber fylt med 2 ml Ringer-salt-løsning. Oppdater kulturmediet hver 8 dager.
Figur 4. Small Erlendmeyerkolber på toppen av en gyrotory Shak. er er Flaskene med 1,5 ml kulturmedium forseglet med silikon propper utstyrt med en gass i - og utløp nål, og flyttet på 120 rpm ved 37 ° C. Gassen ledes av en innløpsrøret (1) til den større Erlenmeyer-kolbe (2) fylt med steril Ringers saltoppløsning, og videre fordelt (3 og 4) til mindre kolber inneholdende kulturmedium med individuelle hverandre vendte par (5 og 6). Til slutt blir brukt gass oppsamles i en større kolbe med en steril vannfelle (7), hvorfra den kan slippe ut i luften (8). Figuren viser to sett med kultur batterier på toppen av en hjemmelaget plattform plate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. Histologi av Konfrontere kulturer
- Forbered Bouin-Hollande sin fiksering løsning.
- Oppløs 2,5 g kupriacetat (nøytral) i 100 ml én-destillert vann ogTilsett langsomt 4,0 g pikrinsyre.
- Filtrer løsningen gjennom et papirfilter. Tilsett 10 ml formalin og 1 ml eddiksyre. Bland 9 deler av denne oppløsningen med en del av en mettet merkuri-klorid-oppløsning i enkelt-destillert vann.
ADVARSEL: Denne løsningen inneholder flere giftige stoffer. Formalin er giftig ved innånding, hudkontakt og svelging. Eddiksyre er etsende for munn og tarmkanalen etter inntak. Pikrinsyre er allergifremkallende og eksplosiv når hurtig oppvarming eller ved perkusjon. Kvikk klorid er sterkt etsende på slimhinner og nefrotoxic. Bruk verneklær og vernehansker for å forberede Bouin-Hollande løsning, og håndtere det på et godt ventilert sted fjernt fra brannen. En alternativ fiksering fremgangsmåte er basert på 4% formaldehyd i fosfatbuffret saltløsning.
- Fest de individuelle kulturer etter flere dager eller uker med inkubasjon som følger. Først overføre kulturer å Ringers saltløsningen i noen få sekunder for å fjerne serumproteiner. Deretter senkes i Petri-skåler med en diameter på 3 cm inneholdende 3 ml Bouin-Hollande s fikseringsløsning i ca. 2 timer.
- Skyll kulturene tre ganger i 3 ml demineralisert vann før inkubering av dem i vann i 2 timer for å fjerne så mye som mulig fikseringsløsning. Til slutt, overføre til 3 ml av 70% (v / v) etanol i vann. Hold kulturene i denne løsningen O / N, men dette kan utvides til flere dager.
- Dehydrere ved å overføre sekvensielt gjennom glass inneholdende 100 ml av 96% (v / v) etanol i vann, 100% etanol eller isopropanol 100% og 100% xylen i 2 timer hver.
- Overfør hver kultur til en separat glass dekkglass (med en liten mengde xylen), plasseres dekkglass på bunnen av en vinflaske kapsel for parafin innebygging, og dekker det faste materiale med flytende parafin ved 56 ° C. Inkuber ved 56 ° C i 24 timer, og deretter avkjøle innleiret materiale til RT.
FORSIKTIG: Som en benzenderivat xylen kan være giftig etter innånding og bør håndteres i godt ventilerte områder.
- Overfør hver kultur til en separat glass dekkglass (med en liten mengde xylen), plasseres dekkglass på bunnen av en vinflaske kapsel for parafin innebygging, og dekker det faste materiale med flytende parafin ved 56 ° C. Inkuber ved 56 ° C i 24 timer, og deretter avkjøle innleiret materiale til RT.
- Fjern vinflasken kapselen og dekkglass, og kutte ut parafinblokken som inneholder faste kultur.
- Gjør 8 mikrometer tykke parafinsnitt over hele konfronterende paret bruker en mikrotom 14, og samle alle deler på tre vekslende mikroskop glassplater som er forbehandlet med vevlimløsning som stikker agent. Unngå eggehvite som stikker agent, fordi det kan forstyrre immunfarging.
Merk: Forbehandling av objektglass blir gjort ved å levere en liten dråpe av vevlimløsning og tre små dråper med demineralisert vann med en Pasteur-pipette, og blande dem for å dekke lysbildet. - Fjern parafin fra den første lysbilde ved neddykking to ganger i en krukke inneholdende 100 ml 100% xylen i 10 min.
- Rehydrere lysbildene ved nedsenkning til 10 s ikrukker inneholdende 100 ml av følgende løsninger: xylen / etanol (1: 1), 100% etanol, 96% (v / v) etanol i vann, 70% (v / v) etanol i vann, og til slutt demineralisert vann.
- Oppløs merkuri-klorid-krystaller ved nedsenking i en krukke inneholdende 100 ml 0,5% (w / v) Jod i 96% (v / v) etanol i vann i 2 min.
- Fjerne delene i en krukke inneholdende 100 ml av 5% (w / v) natriumtiosulfat i vann i 10 sek. Vask deretter lysbildene grundig i destillert vann.
- Inkuber lysbilder i en krukke som inneholder 100 ml Harris 'hematoxylin i 2 min, senk kort i 0,1 M HCl, og deretter vaske i rennende vann i 10 minutter.
- Inkuber i en krukke inneholdende 100 ml eosin 0,1% (w / v) i vann i 1 min.
- Dehydrere via kort neddykking i glass som inneholdt 100 ml av den følgende serie av løsninger: demineralisert vann, 70% (v / v) etanol, 96% (v / v) etanol, 100% etanol to ganger, xylen-etanol (1: 1) , og til slutt i 100% xylen.
- Monterlysbilder med montering medium ved å levere to separate dråper mediet på skinnene, la disse ekspandere ved å sette et dekkglass på toppen av dem, og la den stivne ved romtemperatur i 24 timer.
4. Immunohistochemistry
- Forbered Tris-bufret saltvann (TBS). Oppløs 6,0 g tris- (hydroksymetyl) aminometan (Tris-base) og 45,0 g NaCl i 4,5 l demineralisert vann. Bring til pH 7,6 med 1 M HCl (ca. 42 ml). Legg destillert vann for å lage 5 L.
- Forbered Tris-HCl-buffer. Oppløs 60 g Tris-base i 800 ml demineralisert vann. Bring til pH 7,6 med 6 M HCl (ca 65 ml). Legg destillert vann for å lage en L. Tynn 10x med destillert vann før bruk.
- Forbered Tris-BSA 0,1% buffer. Oppløs 12,1 g Tris-base og 45,0 g NaCl i 4,5 l demineralisert vann. Bring til pH 8,2 med 1 M HCl (ca. 42 ml). Legg 5,0 g bovint serumalbumin (BSA) og 6,5 g NaN3. Legg demineralisert vann for å gjøre 5 L.
FORSIKTIG: NaN3 er en sværtgiftig produkt. Ved kontakt med syre utvikles meget giftige gasser. Bruk hansker og unngå inntak av alle midler. NaN3 skjemaer svært sensitive eksplosive blandinger med kobber, bly og andre metaller. Skyll vasker med rikelige mengder vann. Et alternativ konserveringsmiddel er 0,01% tiomersal. - Følg elementer 03.02 til 03.10.
- Dypp lysbilder i TBS eller Tris-0,1% BSA buffer, og tørk av overflødig væske rundt delene med et papirhåndkle.
- Påfør 150 pl normalt geiteserum fortynnet 1:20 i TBS, eller i 5% (w / v) BSA i Tris-0,1% (w / v) BSA-buffer i 30 minutter i en høy-fuktighetskammer (en lukket boks for ko -incubation av lysbildene med et åpent vann mottaker sikrer høy luftfuktighet inne). Deretter fjerne overflødig væske med et papirhåndkle.
- Påfør 150 mL primære antiserum fortynnet i Tris-0,1% (w / v) BSA supplert med 1% (volum / volum) normalt geiteserum i minst 2 timer i en høy fuktighetskammeret. Bestem optimal fortynning av den primære antiserum empiritisk.
Merk: Immunhistokjemi kan brukes til å detektere chick hjerte antigener, men, ved hjelp av spesifikke antistoffer, kan den teknikk som er beskrevet for brud hjerte antigener anvendes for andre antigener (for eksempel grønt fluorescerende protein) 15 i tillegg. - Vask objektglassene to ganger i Tris-0,1% w / v BSA på en gynge bord i 5-10 min.
- Fjerne overskytende væske ved hjelp av et papirhåndkle og anvende 150 pl geite-anti-kanin-antiserum i overskudd (f.eks., 1:20 i TBS) i minst 1 time i en høy fuktighetskammeret.
- Vask to ganger med TBS på en gynge bord i 5-10 min.
- Fjern overflødig væske ved hjelp av et papirhåndkle. Påfør peroksydase-anti-peroksydase kompleks fortynnet 1: 250 i TBS supplert med 1% (volum / volum) normalt geiteserum i minst 1 time i et kammer med høy fuktighet. Fortynningen av komplekset avhenger av batchen.
- Vask objektglassene med TBS og overføre til Tris-HCl-buffer pH 7,6.
- Overfør lysbildene i en Tris-HCl-buffer inneholdende 0,25 g / l av diaminobenzidin og 0,01% (v / v) H 2 O 2 i et par minutter. Stopp inkubasjon når dama hjertet er farget. Kontroller jevnlig under mikroskopet.
- Overfør lysbilder til Tris-HCl i 10 minutter og deretter destillert vann.
- Følg elementer 3,13 og 3,14.
Merk: For antigener som er lett ødelagt under fiksering, kan cryosectioning av kulturer tilby et alternativ for immunhistokjemisk analyse. Dette er beskrevet i følgende protokoll trinn: - Vask de levende kulturer med 3 ml Ringers saltoppløsning for å fjerne serumproteiner.
- Tilsett en dråpe innstøpningsmediet til forkjølt (-16 ° C) prøveholder for en cryomicrotome. Overføre det dyrkede vev fra kanten av en glass dekkglass opp til toppen av denne slipp før den er fullstendig frosset.
- Avkjøl kultur til -16 ° C, kutte 6 mikrometer tykke frosne seksjoner, og samle dem på gelatin-belagteglass.
- Fix lysbildene i aceton ved 4 ° C i 10 min før lagring ved 4 ° C.
- Følg elementer 04.05 til 04.15.
5. Evaluering av analyseresultatene
Merk: I foreliggende analyse, er invasjonen definert som progressiv okkupasjon av PHF av konfrontere testcellene. Mikroskopisk analyse av alle påfølgende seksjoner fra et konfrontere kultur gjør at gjenoppbyggingen av samspillet mellom testcelle aggregater og de PHFs i tre dimensjoner.
- Observere de ulike mønstre av interaksjon og klasse i henhold til den følgende skala (se figur 5).
Klasse 0: Bare PHF observert. Det er ingen motstå cellene kan observeres.
Grade I: De motstående testceller er festet til PHF, men ikke opptar hjertevevet, ikke engang de ytterste fibrino-blastcellelagene.
Klasse IIa: Okkupasjon av PHF er begrenset til den ytre fibroblast-lignende og myoblast cell lag.
Klasse IIb: The PHF har omgitt celleaggregater, men det er ingen tegn til okkupasjonen.
Klasse III: The konfrontere celler har okkupert PHF, men har igjen mer enn halvparten av den opprinnelige mengden av hjertevevet intakt.
Grade IV: De motstående cellene har okkupert mer enn halvparten av det opprinnelige volumet av PHF.
Merk: Karakterer I og II blir observert med ikke-invasiv cellepopulasjoner, mens karakterer III og IV er typisk for invasjonen. For å evaluere progresjon innenfor ulike tidsrammer, bør histologisk analyse brukes til å konfrontere kulturer fast etter ulike inkubasjonsperioder.
Figur 5. Eksempler på interaksjoner mellom konfrontere kreftceller og PHFs. Histologiske snitt av konfrontere kulturer farget enten med hematoxylin-eosin (venstre panel) eller immunohistochemically med et antistoff mot brud heart (høyre panel). Interaksjons karakterene er definert i protokollen teksten. (H: hjertevev, T: tumorceller). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
6. Toxicity Assessment etter medikamentell behandling
- Overfør de motstå kulturene i et minimalt volum til 24-brønners vevskultur multidishes med en Pasteur-pipette.
- Vask kulturer ved å legge 500 mL av stoff-fri kultur medium og oppdatere etter seks timer.
- Inspisere alle brønner daglig for celleutvekst fra eksplantater ved hjelp av et invertert mikroskop (objektivlinse 40X). Dele antall vokse ut av kulturer med det totale antallet av eksplanterte kulturer for å oppnå en indeks av overlevelse av de motstående kulturer. Sammenligne resultatene av narkotika behandlet kulturer med løsemiddel behandlet de.
Merk: Bruken av Ki67 immunhistokjemi (for celle formeringenbeid) og av TUNEL assay (for apoptose) er foreslått som komplementære teknikker for å eksplantatet assay for vurdering av toksisiteten.
7. Vekst Vurdering av Konfrontere kulturer
- Lage svart-hvitt fotografier av kulturer like før fiksering, ved hjelp av et mikroskop utstyrt med en digitalkameraer (objektiv 50X)
- Mål i mm større (a) og mindre (b) diameter av kulturen tar hensyn til forstørrelse.
- Beregn omtrentlig volum (V) i mm 3 via formelen 16
- V = 0,4 xaxb 2
- Beregn veksten av kulturen ved å sammenligne denne sluttvolum med den kombinerte volumer av PHF og celle samlet i starten av konfrontasjon.
Merk: Siden enslig PHFs en tendens til å redusere sitt volum under kultur, er avhengig av tumorcellene vekst av de motstående par.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De histologiske snitt som vist i figur 5 viser sluttresultatet av en rekke vellykkede tester. Lyden histologi av kulturene viser levedyktige celler og gjør det mulig å tolke interaksjonen mellom tumorceller og normale vev. Videre kan noen immunreaksjon fra normalt vev holdes, noe som bekrefter den korrekte alderen på kyllingfoster brukes f.eks, før immunavstøtning Systemet er utviklet. Det er ingen bakterier synlige, noe som indikerer fravær av (brutto) forurensning under kultur perioden. Endelig er den avrundede omkrets av seksjonene bekrefter kultur i suspensjon uten tegn til (midlertidig) tilslutning til Erlenmeyer-kolben veggen.
Mange forbindelser er blitt testet i analysen. Stoffene er generelt leveres til dyrkningsmediet i det øyeblikk når de motstå PHF / tumoraggregatparene blir overført til små Erlenmeyer-kolber (trinn 2.7). Noen ble brukt som verktøy (kjent ihibitors og aktivatorer) for å løse trasé og effektor molekyler involvert i prosessen med tumorinvasjon. For andre forbindelser som var strukturelt beslektet, ble en kvantitativ struktur-aktivitetsforhold (QSAR) fastsatt på grunnlag av resultatene fra kylling hjerte invasjon assay. Så, etter beslektede polyphenolics ble brukt en rekke beregnings deskriptorer for å muliggjøre forutsigelse av deres anti-invasive aktivitet i analysen. I løpet av en periode på 15 år, 139 forskjellige analogene ble testet for deres mulige anti-invasive effekter i analysen, og deres aktiviteter ble gruppert i fire klasser. En trening og en validering sett bestående av 93 og 46 av disse polyphenolics henholdsvis ble tilfeldig valgt. Ved hjelp av en QSAR kunstig nevralt nettverk resultatene av valideringssettet viste en klar korrelasjon mellom de forutsagte og eksperimentelt anti-invasive aktiviteter 17 (se figur 6).
Dataene viser robustheten the chick hjerte invasjon analysen, siden korrelasjonen mellom predikerte og eksperimentelle resultatene var gyldig over 15 år, og bekreftet i en fersk (upublisert) prediksjon studie med forskjellige polyphenolics. Den forvirring matrisen presentert i Figur 6 oppsummerer svakhet og styrken av analysen grafisk: det gir en grov ekspresjon av nøyaktighet og reproduserbarhet. Tolkningen av denne grafen bør ta hensyn til den biologiske variasjonen av levende organkulturer, og det halv kvantitative stillingen av invasjonen resultater.
Figur 6. Ekstern validering av en prediktiv QSAR modell (kunstige nevrale nettverk) for aktiviteten av små molekyler i chick hjertet invasjonen analysen. Utgangen fra denne modellen er den anti-invasiv aktivitet klasse av en forbindelse. Fire slike klasser er definert, representing den laveste konsentrasjonen hvor et molekyl utøver anti-invasiv aktivitet (dvs. invasjon klasse I eller II) i CHI analysen: class 4 (aktiv ned til 1 mm), klasse 3 (10 mm), klasse 2 (100 mm) og klasse 1 (ingen anti-invasiv aktivitet ved konsentrasjoner så høye som 100 uM). Den viste forvirring matrisen sammenlignes sies og eksperimentelt bestemt anti-invasive aktivitet klasser for forbindelsene valideringssettet. Valideringssettet inneholder 46 forbindelser, treningssettet 93. modellprediksjoner utelukkende er basert på beskrivelsene beregnet fra molekylstruktur, og kan dermed oppnås for hypotetiske forbindelser. På denne måten kan syntetiske innsats være fokusert på molekyler med lovende i silico aktivitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under utarbeidelsen av PHFs, kan fragmentene ikke bo i suspensjon, men holder seg til åreveggen; Dette kan overvinnes ved å øke volumet av kulturmediet. Hvis antallet PHFs er for lav, og deres størrelse er for stor, redusere volumet av kulturmediet. Svikt i testcellene til å aggregere kan skyldes variasjoner i temperatur eller for mikrobiell infeksjon. Alternativt kan en manglende evne til å aggregere være en iboende karakteristikk av cellene. Ved festing av aggregatene til PHF, kan dårlig adhesjon overvinnes ved å utvide inkuberingsperioden på toppen av halvfast agar medium, eller ved å fjerne mer væske kulturmedium rundt kulturene ved hjelp av absorberende filterpapir. Sjekk også for mikrobiell forurensning i dette tilfellet. Vanskeligheter under snitting kan skyldes nedbrytning av parafinblokker: dette skjer når lagringsperiode av blokkene har vært for lang (smelte parafin igjen). Når seksjonering artifacts oppstår, integritet mikrotomkniv og fraværet av svamp aliena i de faste kulturer bør sjekkes. Nekrotiske områder i kulturene er tegn på dårlige dyrkningsforhold. Dersom disse områdene er begrenset til midten av kulturene, bør man mistenker at volumet av konfrontasjon blir for stor. Riktig valg av volumene av PHF og celleaggregatene er faktisk en viktig faktor. Men mer generalisert nekrose poeng mot upassende pH kontroll, mikrobiell forurensning eller feste gjenstander. Til slutt, når seksjonene vises for mørkt, kan nedsenking periode i hematoxylin være for lang, eller seksjonene kan være for tykke (> 8 mikrometer).
Mange varianter på dama hjertet analysen har blitt brukt med hell i invasjons studier. Disse variasjonene er knyttet til opprinnelsen til vertsvevet, presentasjonen av de motstående testcellene, og inkuberingsbetingelser. Hjerte fragmenter fra arterannet enn chick 18, og fra vev som lever 19, 20 lunge, hjerne og 21, er kontrollert. I stedet for aggregater, eksemplarer biopsi 22 monolags fragmenter 23, og cellesuspensjoner har blitt brukt til å konfrontere med PHF i organkultur. Suspensjonskulturer er ofte erstattes av statiske kulturer på toppen av en halvfast substrat 24, og serum-frie konfrontasjon har vist seg å være mulig med visse typer celler 25. Vanligvis er samspillet beskrevet i samsvar med en semi kvantitativ skala 26 har imidlertid datamaskin-assistert automatiserte bildeanalysesystemer også blitt utviklet 27,28. Sistnevnte mål å gi kvantitativ informasjon om omfanget av tumorcelle invasjon.
Som dama hjertet analysen inkluderer en levende vert vev, prøver oppsett for å rekapitulere situasjonen in vivo, og tydelig er av noen relevans i forhold til other systemer in vitro (se innledningen avsnitt). Det skal imidlertid forståes at analysen ikke klarer å omfatte alle elementene i den microecosystem tilstede i naturlige miljøer der tumorer, for eksempel immunologiske faktorer kan påvirke oppførselen av invasive kreftceller. I minst én studie, har fraværet av slike faktorer i analysen førte til motstridende resultater mellom resultatene av den dama hjertet analysen 29 og de av en dyremodell 30.
En fremtidig anvendelse vil være studier av cardiomyocyte progenitorceller i analysen. Disse cellene kan injiseres terapeutisk inn infarkt soner av hjertepasienter, men de bør være i stand til å integrere i hjertemuskelen. I chick hjertet analysen progenitorcellene vil bli konfrontert med chick hjerte fragmenter, og deres migrasjon og differensiering vil bli analysert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ringer's salt solution | Braun | CEO123 | |
| Bacto-agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan Analar | VWR | 103157P | |
| BSA : albumin from bovine serum, cohn V fract. | Sigma | A4503-500G | |
| MEM-Rega 3 | Life Technologies | 19993013 | |
| Gyrotory shakers | New Brunswick Scientific | G10 and G33 | |
| Erlenmeyer flasks 50 ml | Novolab | 92717 | |
| Glass Petri dishes | Novolab | 68516 | |
| Iridectomy scissors | Rumex | 11-0625 | |
| Macroscope with calibrated ocular grid | Wild | 157702 | |
| Paraffin wax | International Medical products | 8599956 | |
| Eosin Y | Sigma | 230251-25g | |
| Harris' hematoxylin | Sigma | HHS32-1L | |
| Coverslipping resin (Tissue-Tek) | Sakura | 4494 | |
| Paraffin melting apparatus | GFL | 1052 | |
| Microtome for paraffin sectioning | Reichert | ||
| Stppers for Erlemeyer flasks with gas in- and outlets | Novolab | 2602421 and 260243 | |
| Diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| REAX rocking table | Heidolph | 54131 | |
| 24-well tissue dishes | VWR | NUNC142475 | |
| Ophtalmological enucleation spoon | Rumex | 16-060 | |
| Sharp forceps | Rumex | 4-111T | |
| Blunt forceps | Nickel-Electro LTD | 7112 | |
| Erlenmeyer flasks 5 ml | Novolab | 211901 | |
| Microscope slides washed and degreased | International Medical products | 8613908 |
References
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Van Roy, F. M., de Baetselier, P. Molecular mechanisms of cancer invasion. Encyclopedia of Cancer. JR, B. ertino 2, Academic Press. San Diego. 1072-1083 (1997).
- Mareel, M., Kint, J., Meyvisch, C. Methods of study of the invasion of malignant C3H mouse fibroblasts into embryonic chick heart in vitro. Virchows Arch. B. Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 30 (1), 95-111 (1979).
- Albini, A., Noonan, D. M. The ‘chemoinvasion’ assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr. Opin. Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- De Wever, O., et al. Single cell and spheroid collagen type I invasion assay. Methods Mol. Biol. 1070, 12-35 (2014).
- Wolff, E., Schneider, N. La transplantation prolongée d’un sarcome de souris sur des organes embryonnaires de poulet cultivés in vitro. C.R. Seances Soc. Biol. Fil. 151 (7), 1291-1292 (1957).
- Easty, G. C., Easty, D. M. An organ culture system for the examination of tumor invasion. Nature. 199, 1104-1105 (1963).
- Schleich, A. B., Frick, M., Mayer, A. Patterns of invasive growth in vitro. Human decidua graviditatis confronted with established human cell lines and primary human explants. J. Natl. Cancer Inst. 56 (2), 221-237 (1976).
- Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a Xenograftodel for Sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522 (2013).
- Bracke, M. E., Van Larebeke, N. A., Vyncke, B. M., Mareel, M. M. Retinoic acid modulates both invasion and plasma membrane ruffling of MCF-7 human mammary carcinoma cells in vitro. Br. J. Cancer. 63 (6), 867-872 (1991).
- Vermeulen, S. J., et al. Transition from the noninvasive to the invasive phenotype and loss of alpha-catenin in human colon cancer cells. Cancer Res. 55 (20), 4722-4728 (1995).
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of 3,7-dimethoxyflavone in vitro. J. Pharma. Sci. 83 (9), 1217-1221 (1994).
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of alkaloids and polyphenolics in vitro. Bioorg. Med. Chem. 5 (8), 1609-1619 (1997).
- Gaillard, P. J. Organ culture technique using embryologic watch glasses. Methods in Medical Research. MB, V. isser 2, Year Book Publishers. Chicago. 241-24 (1951).
- Romeis, B. Das mikrotom. Mikroskopische Technik. 15 Verb. Aufl. Kapitel. 7, München: Leibniz. 114-120 (1948).
- Van Marck, V., et al. P-cadherin promotes cell-cell adhesion and counteracts invasion in human melanoma. Cancer Res. 65 (19), 8774-8783 (2005).
- Attia, M. A., Weiss, D. W. Immunology of spontaneous mammary carcinomas in mice. V. Acquired tumor resistance and enhancement in strain A mice infected with mammary tumor virus. Cancer Res. 26 (8), 1787-1800 (1966).
- Katritzky, A. R., et al. QSAR modeling of anti-invasive activity of organic compounds using structural descriptors. Bioorg. Med. Chem. 14 (20), 6933-6939 (2006).
- McKinnell, R. G., Bruyneel, E. A., Mareel, M. M., Seppanen, E. D., Mekala, P. R. Invasion in vitro by explants of Lucke renal carcinoma cocultered with normal tissue is temperature dependent. Clin. Exp. Metastasis. 4 (4), 237-243 (1986).
- Wanson, J. C., de Ridder, L., Mosselmans, R. Invasion of hyperplastic nodule cells from diethylnitrosamine treated cells. Cancer Res. 41 (12 Pt 1), 5162-5175 (1981).
- Mareel, M. M., et al. Effect of temperature on invasion of MO4 mouse fibrosarcoma cells in organ culture. Clin. Exp. Metastasis. 2 (2), 107-125 (1984).
- Laerum, O. D., Steinsvag, S., Bjerkvig, R. Cell and tissue culture of the central nervous system: recent developments and current applications. Acta Neurol. Scand. 72 (6), 529-549 (1985).
- Schroyens, W., Mareel, M. M., Dragonetti, C. In vitro invasiveness of human bladder cancer from cell lines and biopsy specimens. Clin. Exp. Metastasis. 1 (2), 153-162 (1983).
- Mareel, M. M., De Bruyne, G. K., Vandesande, F., Dragonetti, C. Immunohistochemical study of embryonic chick heart invaded by malignant cells in three dimensional culture. Invasion Metastasis. 1 (3), 195-204 (1981).
- Bjerkvig, R., Laerum, O. D., Mella, O. Glioma cell interactions with fetal rat brain aggregates in vitro and with brain tissue in vivo. Cancer Res. 46 (8), 4071-4079 (1986).
- Bracke, M. E., et al. Confrontation of an invasive (MO4) and a non-invasive (MDCK) cell line with embryonic chick heart fragments in serum-free culture media. In Vitro Cell Dev. Biol. 22 (9), 508-514 (1986).
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Storme, G. A. Mechanisms of tumor spread: a brief overview. Cancer Campaign. 9: The Cancer Patient. Grundmann, E. , Gustav Fisher Verlag. Stuttgart and New York. 59-64 (1985).
- De Neve, W. J., Storme, G. A., De Bruyne, G. K., Mareel, M. M. An image analysis system for the quantification of invasion in vitro. Clin. Exp. Metast. 3 (2), 87-101 (1985).
- Smolle, J., et al. Quantitative evaluation of melanoma cell invasion in three-dimensional confrontation cultures in vitro using automated image analysis. J. Invest. Dermatol. 94 (1), 114-119 (1990).
- Bracke, M. E., et al. flavonoid effect on tumor invasion and metastasis. Food Technol. 48 (11), 121-124 (1994).
- Bracke, M. E., et al. The influence of tangeretin on tamoxifen’s therapeutic benefit in mammary cancer. J. Natl. Cancer Inst. 91 (4), 354-359 (1999).
