Summary
Здесь мы приводим протокол для изучения вторжение опухолевых клеток в живых нормальных фрагментов тканей в трех измерениях. Эта техника орган культура в основном применяется для тестирования потенциально анти-инвазивных наркотиков в пробирке.
Abstract
Цель цыпленок сердца анализа является предложить соответствующий метод органной культуре для изучения опухолевой инвазии в трех измерениях. Анализ может различать инвазивных и неинвазивных клеток, и позволяет изучение влияния тестируемых соединений на инвазии опухоли. Раковые клетки - либо в виде агрегатов или отдельных клеток - столкнулись с фрагментами эмбрионального куриного сердца. После органной культуры в суспензии в течение нескольких дней или недель противоборствующие культуры фиксированной и заливали в парафин для гистологического анализа. Трехмерная взаимодействие между раковыми клетками и нормальной ткани затем восстановлены из последовательных срезах, окрашенных гематоксилин-эозином или после иммуногистохимического окрашивания для эпитопов в сердечной ткани или противоборствующих раковых клеток. Анализ согласуется с новой концепцией, что вторжение рак результат молекулярных взаимодействий между раковыми клетками и их элементов принимающих соседних стромы (Миофибробласты, endothelial клетки, компоненты внеклеточного матрикса и т.д.). Вот, это стромальных среда предлагается раковых клеток как фрагмент живой ткани. Поддержка аспекты актуальности анализа являются несколько. Вторжение в анализе в соответствии с критериями вторжения рака: прогрессивная оккупации и запасных во времени и пространстве ткани хозяина, и инвазивности и не инвазивности в естественных условиях из стоящих клеток, как правило, коррелирует с результатами анализа. Кроме того, вторжение образец клеток в живом организме, как это определено патологи, отражается в гистологических изображений в анализе. Количественный структура-активность соотношение (КЗСА) анализ полученных результатов с многочисленными потенциально анти-инвазивных органических соединений этой соединений позволило изучение структура-активность отношений для флавоноидов и халконов и известных антиметастатическую препаратов, используемых в клинике (например, ингибиторы микротрубочек ) ингибировать инвазию в анализе, а также. Howeveг, проба не учитывать иммунологических взносов вторжения рака.
Introduction
Вторжение признаком злокачественных опухолей. Эта активность приводит не только к разрушению окружающих тканей, но также участвует в формировании метастазов. Так как пациенты рака умирают от инвазии и метастазированию, и эффективных анти-инвазивных методов лечения по-прежнему мало, лабораторные анализы, которые имитируют были разработаны вторжение опухолевых клеток. Цель цыпленок сердца анализа является предложить соответствующий метод органной культуре для изучения опухолевой инвазии в трех измерениях. Анализ может различать инвазивных и неинвазивных клеток, и позволяет изучить влияние исследуемых соединений на опухолевой инвазии.
Обоснованием использования анализа является само понятие, что опухоли экосистемы, где опухолевые клетки постоянно взаимодействуют с их стромы (клеток-хозяев и внеклеточной матрицы), и что через эти молекулярные взаимодействия вторжение доработаны 1. Так, в тесте опухолевые клетки сталкиваются с Ливиэмбриональные нг фрагменты куриных сердца 2, которые служат не только в качестве подложек для вторжения опухолевыми клетками, но и в качестве источника различных типов стромальных клеток и матричных элементов. Куриных сердца содержит миоциты, фибробласты и эндотелиальные клетки, а внеклеточный матрикс состоит из ламинин, фибронектин и различные виды коллагена. Таким образом, трехмерная техника орган культура охватывает многие клеточные и молекулярные взаимодействия, замешанных в вторжения опухолей пациентов.
Основным преимуществом куриного сердца анализе является реализация стромальных эффектов. Этот аспект является более полной, чем в других анализах вторжения в пробирке, которые основаны на опухолевой инвазии клеток в гели неживых, состоящих из базальной мембраны 3 или 4 интерстициальной матрице молекул. Концепция конфронтации между опухолевыми клетками и нормальной тканью хозяина гостиной, как найти в органной культуры экспериментов была введена несколькоАвторы включая Вольф Шнайдер и во Франции, 5 Исти и Исти в Великобритании 6 и Schleich в Германии 7. Два технические преимущества куриных сердца вторжения анализа в течение указанных методов является то, что объем фрагментов может легко быть стандартизированы, и что они остаются сократительной, которая позволяет функциональный контроль целостности во органной культуре. Кроме того, предпочтительными являются эмбрионов птиц, потому что они легко могут быть расчленены из стерильной содержания яйца. Анализ имеет концептуальную сходство с куриных хориоаллантоисе мембраны анализа 8, предлагая комплексное стромальные окружающую к опухолевым клеткам.
Анализ был успешно применен для различения инвазивных и неинвазивных вариантов клеток из тех же опухолей человека, например, в клетках линии MCF-7 (молочной) 9 и HCT-8 (ободочной) 10 семейств клеточных линий. Метод полезен для тестирования потенциально анти-инвазивных соединений, а также
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Рисунок 1. Схема обзор различных этапов анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
1. Подготовка предварительно культивируют сердца осколках (пневмо-гидравлическая система подачи)
- Инкубируют в течение 9 дней в куриных оплодотворенной яйцеклетки при 37 ° C. Заполните эту инкубацию по дате, что позволяет последующее подготовку пневмо-гидравлическая система подачи в течение 4 дней (например, в четверг) и окончательной конфронтации с опухолевых клеток агрегатов (например, в гнезде понедельник).
- Дезинфекцию оболочку с 70% (об / об) этанола в воде. Выполняйте все дальнейшие манипуляции в культуре ткани шкафа, используя стерильные растворы и материалы. Откройте оболочку на эмбриональной полюса с использованием тупых щипцы.
- Вытяните эмбрион, холДин шеи с энуклеации ложкой (рис 2). Поместите эмбрион в стеклянную чашку Петри диаметром 5 см, содержащие 5 мл солевого раствора Рингера.
- Откройте брюшной грудной кожу, разрывая открытый кожу, используя острые щипцы в обе руки, удалить грудины того же типа манипуляции, и анализировать из сердца с помощью микродиссекции иридектомия ножницы, чтобы отключить его основные кровеносные сосуды. Выполните все дальнейшие манипуляции под Макроскоп с калиброванной глазной сетки.
Рисунок 2. Подъем эмбриона из яйца с ложкой энуклеации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Перевести сердце в стеклянную чашку Петри сдиаметр 5 см, содержащие 5 мл MEM-Rega 3 культуральной среде с 5% эмбриональной телячьей сыворотки. Удалить из предсердий и связанных с ними сосуды, резекции верхней черепной треть сердца с помощью микродиссекции иридектомия ножницы. Рассеките перикарда из желудочков с парой острых щипцов.
- Сделать сагиттальный Гемисекция в желудочки, используя микродиссекции иридектомия ножницами и удалить кровь, осторожно встряхивая с острыми щипцами.
- Передача желудочки в другую стеклянную чашку Петри диаметром 5 см, содержащие 5 мл свежей MEM-Rega 3 культуральной среде с 5% эмбриональной телячьей сыворотки. Разрежьте желудочки на куски примерно 0,4 мм в диаметре, используя микродиссекции иридектомия ножницы. Одно сердце может дать около 100 фрагментов.
Примечание: Одно сердце может дать около 100 фрагментов - Поверните чашку Петри осторожно, чтобы заставить всех желудочковых фрагменты к центру блюда. Удалить все желтых Aliena с иглой из нержавеющей стали по сентябрьки- их фрагментов желудочковых и вождение их к периферии чашки Петри.
- Передача фрагментов сердца со стеклянной пипетки Пастера в колбу 50 мл Эрленмейера, содержащую от 2 до 3 мл культуральной среды (MEM-Rega 3 плюс 10% об / об эмбриональной бычьей сыворотки).
Примечание: Точный объем среды зависит от переменной нижних выпуклостей отдельных колб: центр их нижней должна быть покрыта тонкой пленкой жидкости только. - Газ колбу (ы) со смесью 5% CO 2 в воздухе с помощью пробок, и инкубируют колбу (ы) на gyrotory шейкере при 37 ° С при 70 об / мин (оборотов в минуту) в течение 24 ч. Основанием для этого шага подвеска культуры является получение сфероидальным фрагменты сердечной ткани, пригодные для последующего противостояния с опухолевых клеток агрегатов.
- Передача фрагментов сердца и их культуральную среду в чашках Петри. Откажитесь корпусов Aliena, некротические (темные) фрагменты, и конгломераты фрагментов сердца с иглой.
- Инкубируйте остальные фрагменты сердце в другой 50 мл колбу Эрленмейера, содержащую 6 мл культуральной среды, как описано в шаге 1.9 еще в течение 60 ч.
Примечание: В течение этого инкубационного периода, фрагменты станут сферическими. Они состоят из ядра миобластов и тонким слоем фибробластов клеток на периферии. - Выбрать сфероидальных фрагменты, проявляющие тонкий однородный слой фибробластов клеток (формирование полупрозрачный капсула) и диаметр 0,4 мм с помощью Макроскоп и иглы. Один цыпленок сердце даст около 20 подходящих пневмо-гидравлическая система подачи. Передача этих пневмо-гидравлическая система подачи, многие из которых будет сокращаться ритмично при 37 ° С, в другую чашку Петри, содержащую свежую культуральную среду. Эти пневмо-гидравлическая система подачи готовы к конфронтации с контрольными клетками.
2. Подготовка и Противостояние с шаровидным испытаний клеточных агрегатов
- Подготовьте полутвердой агаровой среды: растворить 100 мг агара в 15 мл солевого раствора Рингера при кипячении три раза. КрутоСуспензию до 40 ° С и добавляют 7,5 мл раствора соли Рингера / яичный белок (1: 1) и 7,5 мл фетальной бычьей сыворотки.
- Подготовка 6 мл суспензии, содержащей 1 × 10 5 тестовых клеток / мл в их соответствующей культуральной среде в 50 мл колбу Эрленмейера. Сделайте это за 3 дня до начала противоборствующих культуры планируется. Инкубируйте колбы на gyrotory шейкере при 37 ° С при 70 оборотах в минуту в течение 3 дней. Газ колбы со смесью 5% или 10% (об / об) CO 2 в воздухе, в зависимости от типа культуральной среды, используемой.
- Просмотр агрегатов под Макроскоп снабженной калиброванным глазной сетки. Выбрать (с иглой) с шаровидным клеточных агрегатов с диаметром 0,2 мм.
- Использование пипетки Пастера перенести восемь выбранных пневмо-гидравлическая система подачи (диаметр = 0,4 мм) в минимальном количестве питательной среды к эмбрионального часовым стеклом, содержащей полутвердую агаровой среды 13. Перемещение отдельных пневмо-гидравлическая система подачи с иглой, чтобы сформировать круг. Аспирируйте избыток среднегос помощью небольшой кусочек фильтровальной бумаги (рисунок 3).
Рисунок 3. Стремление лишней жидкости вокруг пневмо-гидравлическая система подачи. Восемь пневмо-гидравлическая система подачи размещены на полутвердой агара в эмбриональном часовым стеклом, и избыток жидкости удаляют с помощью небольшой треугольный кусок фильтровальной бумаги оп. Стрелки указывают на 8 индивидуальных пневмо-гидравлическая система подачи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Принесите десять выбранных шаровидным клеточных агрегатов (диаметр = 0,2 мм) в окружности, используя пипетки Пастера. Аспирируйте избыток среду. Перемещение одного агрегата к каждому из PHF с иглой, пока они не вступать в контакт друг с другом. Аспирируйте избыток средних с помощью небольшой кусочек фильтровальной бумаги.
- Закрыть крышку часового стекла с парафином, и INCUБАТЭ при 37 ° С в течение 4 - 24 ч, в зависимости от адгезионных свойств тестовых клеток к пневмо-гидравлическая система подачи.
- Погружают, стоящих пар с подогретого (37 ° С) культуральной среды, и передачи каждого отдельного пару пипеткой Пастера в 5 мл колбу Эрленмейера, содержащую 1,5 мл культуральной среды.
- Инкубируйте колбы на gyrotory шейкере при 37 ° С доводят до 120 оборотов в минуту. Газ колбы с 5% или 10% (об / об) CO 2 в воздухе, в зависимости от типа культуральной среды, используемой для испытаний клеток (смотри рисунок 4).
- Чтобы избежать концентрации средств массовой информации, смочите газов путем пропускания их через два дополнительных 5 мл колб Эрленмейера, заполненных 2 мл солевого раствора Рингера. Обновить культуральной среды каждые 8 дней.
Рисунок 4. Малый колб Эрленмейера объемом в верхней части gyrotory Шак. э Колбы с 1,5 мл культуральной среды уплотнены с силиконовыми пробками, снабженных газа в выходном - и иглой, и перемещается при 120 оборотах в минуту при 37 ° С. Газ под руководством впускного трубопровода (1) к большему колбу Эрленмейера (2), заполненной раствором соли стерильного раствора Рингера и дальнейшее распространение (3 и 4) на более мелкие колбах, содержащих питательную среду с отдельными парами противоборствующими (5 и 6). Наконец, отработанный газ собирают в большей колбу со стерильным ловушку воды (7), откуда он может попадать в воздух (8). На рисунке показано два набора батарей культуры на вершине платформы домашней плите. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
3. Гистология противоборствующих культур
- Подготовка фиксации решение Буэна-Олланда.
- Растворить 2,5 г ацетата меди (нейтральный) в 100 мл дистиллированной одной воде иМедленно добавить 4,0 г пикриновой кислоты.
- Фильтр решение через бумажный фильтр. Добавьте 10 мл формалина и 1 мл уксусной кислоты. Смешайте 9 частей этого раствора с 1 частью насыщенного раствора хлорида ртути в одном дистиллированной воды.
ВНИМАНИЕ: Это решение содержит несколько токсичные вещества. Формалин является токсичным при вдыхании, при контакте с кожей и при проглатывании. Уксусная кислота вызывает коррозию для рта и желудочно-кишечного тракта после приема внутрь. Пикриновая кислота аллергенные и взрывной, когда быстро нагревается или перкуссии. Хлорид ртути чрезвычайно агрессивна слизистых оболочек и nefrotoxic. Носите защитную одежду и перчатки для приготовления раствора Буэна-Олланда, и справиться с ней в хорошо проветриваемом помещении пульта дистанционного управления с огнем. Альтернативная процедура фиксации основан на 4% формальдегидом в забуференном фосфатом физиологическом растворе.
- Закрепите отдельные культуры после нескольких дней или недель инкубации следующим образом. Во-первых, передать культур посолить РингераРаствор в течение нескольких секунд, чтобы удалить сывороточные белки. Далее, погружают в чашках Петри с диаметром 3 см, содержащих фиксирующем растворе 3 мл Буэна-Холланд в течение примерно 2 ч.
- Промыть культур в три раза в 3 мл деминерализованной воды перед инкубацией их в воде в течение 2 ч, чтобы удалить как можно больше фиксирующем растворе, как это возможно. Наконец, передавать в 3 мл 70% (об / об) этанола в воде. Держите культур в этом растворе O / N, но это может быть продлен на количество дней.
- Высушить путем передачи последовательно через банки, содержащие 100 мл 96% (объем / объем) этанола в воде, 100% этанола или изопропанола на 100% и 100% ксилола в течение 2 ч каждый.
- Передача каждого культуру в отдельный покровным стеклом (с минимальным количеством ксилола), разместить покровное на дно бутылки вина капсулы для парафин, и покрыть фиксированный материал с жидким парафином при 56 ° С. Инкубируют при 56 ° С в течение 24 ч, а затем охлаждают встроенный материал до комнатной температуры.
ВНИМАНИЕ: В производное бензола ксилол может быть токсичным при вдыхании и должны быть обработаны в хорошо проветриваемых помещениях только.
- Передача каждого культуру в отдельный покровным стеклом (с минимальным количеством ксилола), разместить покровное на дно бутылки вина капсулы для парафин, и покрыть фиксированный материал с жидким парафином при 56 ° С. Инкубируют при 56 ° С в течение 24 ч, а затем охлаждают встроенный материал до комнатной температуры.
- Удалить капсулу бутылки вина и покровное, и вырезать парафин блок, который содержит фиксированный культуры.
- Сделайте 8 мкм парафиновых срезов всего пару сопрягаемой с использованием микротома 14, и собирать все разделы на три чередующихся микроскоп стеклах, которые были предварительно обработаны с помощью клейкой ткани решения как прилипание агента. Избегайте яичный белок в качестве агента прилипания, потому что это может помешать иммунной окраски.
Примечание: Предварительная обработка стеклах микроскопа осуществляется доставки 1 каплю клея ткань раствором и 3 маленьких капель деминерализованной воды с помощью пипетки Пастера, и смешивая их, чтобы покрыть слайд. - Удалить парафин из первого ползуна путем погружения в два раза в сосуд, содержащий 100 мл 100% ксилола в течение 10 мин.
- Увлажняет слайды от погружения в течение 10-х годов вбанок, содержащих по 100 мл следующих растворов: ксилол / этанол (1: 1), 100% этанола, 96% (об / об) этанола в воде, 70% (об / об) этанола в воде, и, наконец, деминерализованной воды.
- Растворите ртутные кристаллы хлорида путем погружения в сосуд, содержащий 100 мл 0,5% (вес / объем) йода в 96% (объем / объем) этанола в воде в течение 2 мин.
- Очистка секций в банку, содержащую 100 мл 5% (вес / объем) раствором тиосульфата натрия в воде в течение 10 сек. Затем промыть слайды тщательно в дистиллированной воде.
- Инкубируйте слайды в сосуд, содержащий 100 мл гематоксилин Харриса в течение 2 мин, кратко погрузить в 0,1 М HCl, а затем вымыть в проточной воде в течение 10 мин.
- Инкубируют в сосуд, содержащий 100 мл эозином 0,1% (вес / объем) в воде в течение 1 мин.
- Высушить с помощью короткого погружения в банках, содержащих по 100 мл следующих растворов серии: деминерализованной воды, 70% (об / об) этанола, 96% (об / об) этанола, 100% этанола в два раза, ксилол-этанол (1: 1) и, наконец, в 100% ксилола.
- Установитеслайды с монтажа среду, обеспечивая 2 отдельные капли среды на слайдах, пусть это расширить, поставив покровное на них, и дайте затвердеть при комнатной температуре в течение 24 ч.
4. Иммуногистохимия
- Подготовьте Трис-солевом буферном растворе (TBS). Растворить 6,0 г трис- (гидроксиметил) -аминометана (Трис-основание) и 45,0 г NaCl в 4.5 л деминерализованной воды. Довести до рН 7,6 с помощью 1 М HCl (примерно 42 мл). Добавить дистиллированную воду, чтобы сделать 5 L.
- Получают буфер Tris-HCl. Растворить 60 г трис-основани в 800 мл деминерализованной воды. Довести до рН 7,6 с помощью 6 М HCl (примерно 65 мл). Добавить дистиллированную воду, чтобы сделать 1 Л. разбавленной в 10 раз дистиллированной водой перед использованием.
- Подготовка Трис-BSA 0,1% буфер. Растворите 12,1 г Трис базы и 45,0 г NaCl в 4,5 л деминерализованной воды. Довести до рН 8,2 с помощью 1 М HCl (примерно 42 мл). Добавить 5,0 г бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 6,5 г NaN 3. Добавить деминерализованной воды, чтобы сделать 5 L.
ВНИМАНИЕ: NaN 3 является весьматоксичный продукт. Контакт с кислотами высвобождает очень ядовитые газы. Надевайте перчатки и избежать проглатывания всеми средствами. NaN3 формы очень чувствительные взрывчатые составы с меди, свинца и других металлов. Флеш раковины с большим количеством воды. Альтернативный консервант 0,01% тиомерсал. - Следуйте вещи от 3,2 до 3,10.
- Опустите слайдов в TBS или Трис-0,1% BSA буфера, и протрите лишнюю жидкость вокруг участков с использованием бумажное полотенце.
- Применить 150 мкл нормальной козьей сывороткой разбавленный 1:20 в TBS или в 5% (вес / объем) БСА в ТРИС-0,1% (вес / объем) BSA буфера в течение 30 мин в камере с высокой влажностью (закрытую коробку для СО -incubation слайдов с открытой получателя воды, обеспечивая высокую влажность внутри). Затем снимите лишнюю жидкость с бумажным полотенцем.
- Применить 150 мкл антисыворотки первичный разбавленный в Трис-0,1% (вес / объем) БСА с добавлением 1% (об / об) нормальной козьей сывороткой в течение по крайней мере 2 ч в камере с высокой влажностью. Определить оптимальное разведение первичной антисыворотки эмпирикочески.
Примечание: Иммуногистохимическое может быть использован для обнаружения куриных сердечные антигены, но, с использованием специфических антител, способ, описанный в куриных сердечных антигенов могут быть применены к другим антигенам (например, зеленый флуоресцентный белок) 15, а также. - Промыть слайдов дважды в Трис-0,1% вес / объем BSA на качалке таблице в течение 5-10 мин.
- Удалить лишнюю жидкость с помощью бумажного полотенца и применять 150 мкл козьего анти-кроличьей антисыворотки в избытке (например., 1:20 в TBS) в течение по крайней мере 1 ч в камере с высокой влажностью.
- Дважды промывали TBS на качалке таблице в течение 5-10 мин.
- Удалить лишнюю жидкость с помощью бумажного полотенца. Применить пероксидазы-пероксидазой анти-комплекс, разбавленного 1: 250 в TBS с добавлением 1% (об / об) нормальной козьей сывороткой в течение 1 ч в высоком камере влажности. Разбавление комплекса зависит от партии.
- Вымойте слайды с TBS и передать Трис-HCl буфере, рН 7,6.
- Передача слайды в три-Буфер, содержащий HCl 0,25 г / л диаминобензидина и 0,01% (об / об) Н 2 О 2 в течение нескольких минут. Остановить инкубацию при цыпленок сердце окрашивали. Регулярно проверяйте под микроскопом.
- Передача слайды в трис-HCl в течение 10 мин, а затем в дистиллированной воде.
- Следуйте пунктов 3,13 и 3,14.
Примечание: Для антигенов, которые легко разрушаются при фиксации, cryosectioning культур может предложить альтернативу для иммуногистохимического анализа. Это описано в следующих шагах протокола: - Вымойте живых культур с 3 мл раствора соли Рингера для удаления сывороточных белков.
- Добавьте одну каплю вложение среды на предварительно охлажденную (-16 ° C) образца держателем cryomicrotome. Передача культивируемой ткани от края покровным стеклом в верхней части этой капли, прежде чем он полностью заморожена.
- Охлаждают до -16 культуры ° C, вырезать 6 мкм замороженных срезов, и собирать их на желатин покрытиемстеклянные слайды.
- Исправление слайды в ацетоне при температуре 4 ° С в течение 10 мин перед хранением при 4 ° С.
- Следуйте вещи от 4,5 до 4,15.
5. Оценка результатов анализа
Примечание: В настоящем исследовании, вторжение определяется как прогрессивной оккупации PHF по противоборствующих тестируемых клеток. Микроскопический анализ всех подряд участков из стоящей культуры позволяет реконструировать взаимодействия тест клеточных агрегатов и пневмо-гидравлическая система подачи в трех измерениях.
- Соблюдайте различные модели взаимодействия и степени по следующей шкале (рисунок 5).
Оценка 0: только PHF наблюдается. Нет, стоящие клетки не могут быть соблюдены.
Степень I: противоборствующие испытаний клетки прикреплены к PHF, но не занимают ткани сердца, даже наружные слои фибробластические клеток.
Оценка IIa: Оккупация PHF ограничено внешней фибробластоподобных и миобластов CELL слои.
Оценка IIb: PHF окружил клеточных агрегатов, но нет никаких признаков оккупации.
III степень: противоборствующие клетки заняли PHF, но оставили более половины от первоначальной суммы сердечной ткани нетронутыми.
IV степени: противоборствующие клетки заняли более половины первоначального объема PHF.
Примечание: Классы I И II наблюдаются с неинвазивных клеточных популяций, в то время как сорта III и IV типичны вторжения. Для оценки прогрессирования в течение различных временных, гистологический анализ следует применять к конфронтации культур фиксированные после различных инкубационных периодов.
Рисунок 5. Примеры взаимодействия между стоящих раковых клеток и пневмо-гидравлическая система подачи. Гистологические срезы окрашивали противостояния культур либо гематоксилин-эозином (левые панели) или immunohistochemicallу с антителом против куриных сердца (справа панелей). Взаимодействие сортов определены в тексте протокола. (Н: ткань сердца, Т: опухолевые клетки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
6. Оценка токсичности после обработок снадобья
- Перенесите, стоящих культур в минимальном объеме до 24-а мультичашки культуры ткани с помощью пипетки Пастера.
- Вымойте культур, добавив 500 мкл свободной от наркотиков культуральной среде, и освежить после 6 часов.
- Проверить все скважины в день в течение клеточного отросток из эксплантатов использованием инвертированного микроскопа (40X линзы объектива). Разделить количество перерастает культур от общего числа эксплантированных культур, чтобы получить индекс выживания противоборствующих культур. Сравните результаты культур наркотиков лечение с тех растворителей лечение.
Примечание: использование Ki67 иммуногистохимии (для клеток Пролифчество) и TUNEL анализа (апоптоза) предлагаются в качестве дополнительных методов в анализе эксплантата для оценки токсичности.
7. Оценка роста противостояния культур
- Сделайте черно-белые фотографии из культур перед фиксацией, с помощью микроскопа, оснащенного цифровым фотоаппаратом (объектив 50X)
- Измерьте мм больший () и меньшую (б) диаметр культуры с учетом увеличения.
- Рассчитать примерный объем (V) в мм 3 по формуле 16
- V = 0,4 xaxb 2
- Рассчитать рост культуры при сравнении этого конечного объема комбинированных объемов PHF и клеток совокупности в начале противостояния.
Примечание: Из-за одиночные пневмо-гидравлическая система подачи имеют тенденцию к снижению их объема в процессе культивирования, рост противостоящих пар зависит от опухолевых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В гистологических срезов, представленные на рисунке 5 показано конечный результат ряда успешных анализов. Звук гистологии культур показывает жизнеспособных клеток и позволяет интерпретировать взаимодействие между опухолевыми клетками и нормальной тканью. Кроме того, ни иммунная реакция от нормальной ткани не наблюдается, что подтверждает правильный возраст куриных эмбрионов, используемых, например, до системы иммунное отторжение развивается. Там нет видимых бактерий, что указывает отсутствие (брутто) загрязнения во время периода культивирования. Наконец округлые периферия секциях подтверждает культуру в суспензии без признаков (временного) присоединения к колбе Эрленмейера стене.
Многие соединения были протестированы в данном анализе. Препараты, как правило, доставляются в культуральную среду в момент, когда противостоящие PHF / опухолевые совокупные пары передаются небольших колб Эрленмейера (этап 2.7). Некоторые из них были использованы в качестве инструментов (известный вhibitors и активаторы), чтобы распутать пути и эффекторные молекулы, замешанных в процессе опухолевой инвазии. Для других соединений, которые были структурно родственных, было установлено количественное соотношение структура-активность (QSAR) на основе результатов куриных сердца вторжения анализа. Таким образом, для связанных полифенолов число вычислительных дескрипторов были использованы для того, чтобы предсказать их анти-инвазивной активности в тесте. В течение 15 лет 139 различные аналоги были протестированы на их возможных анти-инвазивных эффектов в анализе, и их действия были сгруппированы в 4 классов. Обучение и проверка набор, состоящий из 93 и 46 из этих полифенолов соответственно были выбраны случайным образом. С помощью искусственной нейронной сети QSAR результаты набора проверки показали четкую корреляцию между предсказанными и экспериментальными анти-инвазивных деятельности 17 (рисунок 6).
Данные показывают, надежность гое цыпленок сердце вторжение анализ, так как корреляция между предсказанными и экспериментальными результатами было действительно в течение 15 лет, и подтвердил в недавнем (неопубликованной) предсказания исследования с различными полифенолов. Матрица неточностей представлены на рисунке 6 приведены слабость и силу анализа графически: это дает примерное выражение точности и воспроизводимости. Интерпретация этого графика следует учитывать биологическую вариативность живых культур органов, и полу количественный счет результатов вторжения.
Рисунок 6. Внешний проверка прогнозной модели QSAR (искусственная нейронная сеть) для деятельности малых молекул в куриных сердце вторжения анализа. Выход этой модели является анти-инвазивным класс активность соединения. Четыре такие классы были определены, магнезииesenting самую низкую концентрацию, при которой молекула оказывает анти-инвазивной активности (то есть, инвазия класса I или II), в анализе ОМС: класс 4 (активный до 1 мкМ), класс 3 (10 мкМ), класс 2 (100 мкМ) и 1-го класса (без анти-инвазивным деятельность в концентрациях, достигающих 100 мкМ). Изображен путаница матрица сравнивает предсказано и экспериментально определяется антиинвазивный классы активность соединений множества проверки. Набор содержит 46 проверка соединений, подготовка установить 93. предсказания модели основаны исключительно на дескрипторов, рассчитанных от молекулярной структуры, и, таким образом, быть получены гипотетических соединений. Таким образом, синтетические усилия могут быть направлены на молекулы с перспективным в силикомарганца деятельности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Во время подготовки пневмо-гидравлическая система подачи, фрагменты не могут остаться в суспензии, но придерживаться стенки сосуда; это может быть преодолена путем увеличения объема культуральной среды. Если число пневмо-гидравлическая система подачи слишком низка, а их размер слишком велик, уменьшить объем культуральной среды. Отказ тестовых клеток агрегировать может быть из-за колебаний температуры или микробной инфекции. Кроме того, неспособность к агрегации может быть неотъемлемой характеристикой клеток. Во прикрепления агрегатов в PHF, плохая адгезия может быть преодолена путем расширения инкубационный период в верхней части полутвердой агаровой среде или путем удаления жидкости более культуральную среду вокруг культур посредством поглощающей фильтровальную бумагу. Проверьте также для микробного загрязнения в этом случае. Трудности во время секционирования может быть связано с распадом из парафиновых блоков: это происходит, когда срок хранения блоков была слишком долго (снова расплавить парафин). Когда секционирования искусствоifacts происходят, целостность микротома нож и отсутствие желтых Aliena в основной культур должны быть проверены. Некротические участки в культурах признаки плохих условий культивирования. Если эти участки ограничены в центре культур, следует подозревать, объем столкновений слишком большим. Правильный выбор объемам PHF и агрегатов клеток, действительно критическим фактором. Тем не менее, более обобщенные точки некроза к ненадлежащего контроля рН, микробного загрязнения или фиксации артефактов. Наконец, когда секции слишком темным, период выдерживания в гематоксилином может быть слишком длинным, или секции могут быть слишком толстым (> 8 мкм).
Многие вариации на куриных сердца анализе успешно применяется в исследованиях вторжения. Эти изменения касаются происхождения ткани хозяина, презентации, стоящих тестовых ячеек и условий инкубации. Сердце фрагменты из видовкроме куриных 18, и из тканей, таких как печень, легкие 19 20 и 21 мозга, были рассмотрены. Вместо агрегатов, биоптатах 22 монослойных фрагменты 23, и клеточные суспензии были использованы, чтобы противостоять с PHF в органной культуре. Суспензионные культуры, иногда заменен статическими культур на верхней полутвердой подложке 24, и сыворотки, свободной от столкновения, как было показано, чтобы быть возможным с определенными типами клеток 25. Как правило, взаимодействие описывается в соответствии с полуколичественной шкале 26 Однако системы анализа изображения в автоматическом режиме с помощью компьютера были также разработаны 27,28. Последняя цель, чтобы обеспечить количественную информацию о степени инвазии опухолевых клеток.
Как цыпленок сердце анализ включает в себя гостиную ткани хозяина, установки попытается повторять ситуацию в естественных условиях, и, безусловно, является некоторое отношение по сравнению с OРОЧИЕ системы в пробирке (см введение раздел). Следует, однако, признать, что этот анализ не может охватить все элементы микроэкосистеме присутствуют в природном опухолей, средах, где, например, иммунологические факторы могут влиять на инвазивное поведение раковых клеток. По крайней мере в одном исследовании, отсутствие таких факторов в анализе привело к противоречивым результатам между результатами куриного сердца анализе 29 и тех, животной модели 30.
Будущее приложение будет изучение клеток-предшественников кардиомиоцитов в анализе. Эти клетки могут быть введены терапевтически в зонах миокарда кардиологических больных, но они должны быть в состоянии интегрировать в миокарде. В цыпленка сердца анализа клетки-предшественники, будут сталкиваться с куриных фрагментов сердца, и их миграция и дифференциация будут проанализированы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ringer's salt solution | Braun | CEO123 | |
| Bacto-agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan Analar | VWR | 103157P | |
| BSA : albumin from bovine serum, cohn V fract. | Sigma | A4503-500G | |
| MEM-Rega 3 | Life Technologies | 19993013 | |
| Gyrotory shakers | New Brunswick Scientific | G10 and G33 | |
| Erlenmeyer flasks 50 ml | Novolab | 92717 | |
| Glass Petri dishes | Novolab | 68516 | |
| Iridectomy scissors | Rumex | 11-0625 | |
| Macroscope with calibrated ocular grid | Wild | 157702 | |
| Paraffin wax | International Medical products | 8599956 | |
| Eosin Y | Sigma | 230251-25g | |
| Harris' hematoxylin | Sigma | HHS32-1L | |
| Coverslipping resin (Tissue-Tek) | Sakura | 4494 | |
| Paraffin melting apparatus | GFL | 1052 | |
| Microtome for paraffin sectioning | Reichert | ||
| Stppers for Erlemeyer flasks with gas in- and outlets | Novolab | 2602421 and 260243 | |
| Diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| REAX rocking table | Heidolph | 54131 | |
| 24-well tissue dishes | VWR | NUNC142475 | |
| Ophtalmological enucleation spoon | Rumex | 16-060 | |
| Sharp forceps | Rumex | 4-111T | |
| Blunt forceps | Nickel-Electro LTD | 7112 | |
| Erlenmeyer flasks 5 ml | Novolab | 211901 | |
| Microscope slides washed and degreased | International Medical products | 8613908 |
References
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Van Roy, F. M., de Baetselier, P. Molecular mechanisms of cancer invasion. Encyclopedia of Cancer. JR, B. ertino 2, Academic Press. San Diego. 1072-1083 (1997).
- Mareel, M., Kint, J., Meyvisch, C. Methods of study of the invasion of malignant C3H mouse fibroblasts into embryonic chick heart in vitro. Virchows Arch. B. Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 30 (1), 95-111 (1979).
- Albini, A., Noonan, D. M. The ‘chemoinvasion’ assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr. Opin. Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- De Wever, O., et al. Single cell and spheroid collagen type I invasion assay. Methods Mol. Biol. 1070, 12-35 (2014).
- Wolff, E., Schneider, N. La transplantation prolongée d’un sarcome de souris sur des organes embryonnaires de poulet cultivés in vitro. C.R. Seances Soc. Biol. Fil. 151 (7), 1291-1292 (1957).
- Easty, G. C., Easty, D. M. An organ culture system for the examination of tumor invasion. Nature. 199, 1104-1105 (1963).
- Schleich, A. B., Frick, M., Mayer, A. Patterns of invasive growth in vitro. Human decidua graviditatis confronted with established human cell lines and primary human explants. J. Natl. Cancer Inst. 56 (2), 221-237 (1976).
- Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a Xenograftodel for Sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522 (2013).
- Bracke, M. E., Van Larebeke, N. A., Vyncke, B. M., Mareel, M. M. Retinoic acid modulates both invasion and plasma membrane ruffling of MCF-7 human mammary carcinoma cells in vitro. Br. J. Cancer. 63 (6), 867-872 (1991).
- Vermeulen, S. J., et al. Transition from the noninvasive to the invasive phenotype and loss of alpha-catenin in human colon cancer cells. Cancer Res. 55 (20), 4722-4728 (1995).
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of 3,7-dimethoxyflavone in vitro. J. Pharma. Sci. 83 (9), 1217-1221 (1994).
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of alkaloids and polyphenolics in vitro. Bioorg. Med. Chem. 5 (8), 1609-1619 (1997).
- Gaillard, P. J. Organ culture technique using embryologic watch glasses. Methods in Medical Research. MB, V. isser 2, Year Book Publishers. Chicago. 241-24 (1951).
- Romeis, B. Das mikrotom. Mikroskopische Technik. 15 Verb. Aufl. Kapitel. 7, München: Leibniz. 114-120 (1948).
- Van Marck, V., et al. P-cadherin promotes cell-cell adhesion and counteracts invasion in human melanoma. Cancer Res. 65 (19), 8774-8783 (2005).
- Attia, M. A., Weiss, D. W. Immunology of spontaneous mammary carcinomas in mice. V. Acquired tumor resistance and enhancement in strain A mice infected with mammary tumor virus. Cancer Res. 26 (8), 1787-1800 (1966).
- Katritzky, A. R., et al. QSAR modeling of anti-invasive activity of organic compounds using structural descriptors. Bioorg. Med. Chem. 14 (20), 6933-6939 (2006).
- McKinnell, R. G., Bruyneel, E. A., Mareel, M. M., Seppanen, E. D., Mekala, P. R. Invasion in vitro by explants of Lucke renal carcinoma cocultered with normal tissue is temperature dependent. Clin. Exp. Metastasis. 4 (4), 237-243 (1986).
- Wanson, J. C., de Ridder, L., Mosselmans, R. Invasion of hyperplastic nodule cells from diethylnitrosamine treated cells. Cancer Res. 41 (12 Pt 1), 5162-5175 (1981).
- Mareel, M. M., et al. Effect of temperature on invasion of MO4 mouse fibrosarcoma cells in organ culture. Clin. Exp. Metastasis. 2 (2), 107-125 (1984).
- Laerum, O. D., Steinsvag, S., Bjerkvig, R. Cell and tissue culture of the central nervous system: recent developments and current applications. Acta Neurol. Scand. 72 (6), 529-549 (1985).
- Schroyens, W., Mareel, M. M., Dragonetti, C. In vitro invasiveness of human bladder cancer from cell lines and biopsy specimens. Clin. Exp. Metastasis. 1 (2), 153-162 (1983).
- Mareel, M. M., De Bruyne, G. K., Vandesande, F., Dragonetti, C. Immunohistochemical study of embryonic chick heart invaded by malignant cells in three dimensional culture. Invasion Metastasis. 1 (3), 195-204 (1981).
- Bjerkvig, R., Laerum, O. D., Mella, O. Glioma cell interactions with fetal rat brain aggregates in vitro and with brain tissue in vivo. Cancer Res. 46 (8), 4071-4079 (1986).
- Bracke, M. E., et al. Confrontation of an invasive (MO4) and a non-invasive (MDCK) cell line with embryonic chick heart fragments in serum-free culture media. In Vitro Cell Dev. Biol. 22 (9), 508-514 (1986).
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Storme, G. A. Mechanisms of tumor spread: a brief overview. Cancer Campaign. 9: The Cancer Patient. Grundmann, E. , Gustav Fisher Verlag. Stuttgart and New York. 59-64 (1985).
- De Neve, W. J., Storme, G. A., De Bruyne, G. K., Mareel, M. M. An image analysis system for the quantification of invasion in vitro. Clin. Exp. Metast. 3 (2), 87-101 (1985).
- Smolle, J., et al. Quantitative evaluation of melanoma cell invasion in three-dimensional confrontation cultures in vitro using automated image analysis. J. Invest. Dermatol. 94 (1), 114-119 (1990).
- Bracke, M. E., et al. flavonoid effect on tumor invasion and metastasis. Food Technol. 48 (11), 121-124 (1994).
- Bracke, M. E., et al. The influence of tangeretin on tamoxifen’s therapeutic benefit in mammary cancer. J. Natl. Cancer Inst. 91 (4), 354-359 (1999).
