Abstract
Histologisk evaluering af muskelbiopsier har tjent som et uundværligt redskab i forståelsen af udviklingen og progressionen af patologi af neuromuskulære lidelser. For at gøre det, har brug for ordentlig pleje dog skal tages, når udskæring og bevare væv for at opnå optimal farvning. En fremgangsmåde til vævskonservering involverer fastsættelse væv i formaldehyd og derefter integrere dem med paraffinvoks. Denne metode bevarer morfologi godt og giver mulighed for langtidsopbevaring ved stuetemperatur, men er besværlig og kræver håndtering af giftige kemikalier. Endvidere formaldehyd fiksering resulterer i antigen tværbinding, hvilket nødvendiggør antigengenfinding protokoller til effektiv immunfarvning. Tværtimod betyder frosset sektionering ikke kræver fiksering og dermed bevarer biologisk antigen konformation. Denne metode giver også en klar fordel i hurtig turn-around tid, hvilket gør den særlig nyttig i situationer, der kræver hurtig histologisk evaluering ligesom intraoperative kirurgiske biopsier. Her beskriver vi den mest effektive fremgangsmåde til fremstilling af muskelbiopsier til visualisering med forskellige histologiske og immunologiske pletter.
Introduction
Undersøgelse af muskel histologi spiller en afgørende rolle i forståelsen af forskellige typer af neuromuskulære lidelser 1-4. Når det kombineres med andre teknikker, det giver forskerne at få et bedre indtryk af manifestation og progression af patologi og kan også være afgørende for at vurdere effekten af en terapeutisk intervention 5-10. At være nøjagtig, behøver imidlertid væv, der skal bevares i den rigtige måde for at bevare den fysiologiske tilstand umiddelbart før excision. Det kræver stor omhu under fjernelse, konservering, sektionering og farvning.
Væv kan fremstilles på to forskellige måder for lys mikroskopisk undersøgelse. Den første metode, formalin fikseret paraffinindlejret (FFPE) sektioner, kræver væv, der skal fastsættes i 10% naturlig bufferet formaldehyd, før de indlejret med paraffinvoks 11,12. Fikseringstrinnet bidrager til at bevare morfologien bedre, men også tværbindinger endogene proteins hvilket nødvendiggør indviklede antigen hentning procedurer for immunfarvning og fjerne muligheden for enzymatisk farvning på sådanne sektioner 12. Frosne sektioner, på den anden side, behøver ikke at være pre-fast eller forarbejdes; derfor proteiner kan fastholde native biologiske konformationer 13,14. Yderligere, frosne snit også give mulighed for hurtig ekspeditionstid, som til tider er nødvendigt, for eksempel i intraoperative diagnose af sarcomer og andre kirurgiske biopsier 15. Men hvis det ikke gøres ordentligt, denne metode er tilbøjelige til at fryse skader, der indfører ændringer i muskel arkitektur gør afsnittene uegnet til histologisk undersøgelse. Dette papir vil skitsere den mest effektive metode til at fremstille muskelbiopsier for at opnå optimal farvning for grundig undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tissue Høst og Indefrysning af muskelvæv
- Aflive musen med en overdosis af isofluran (2-chlor-2- (difluormethoxy) -1,1,1-trifluor-ethan). Udfør dette trin i et stinkskab og bruge en sekundær indeslutning metode, såsom en ekssikkator eller en glasklokke, som indeholder en vatpind dyppet i isofluran.
- Bekræft døden ved fast klemme trædepude. Anvende en sekundær fremgangsmåde til eutanasi såsom cervikal dislokation.
- Fugt pelsen med 70% alkohol for at reducere klæbning af løse hår tråde på musklerne. Skræl skindet lemmet med en fin pincet som nr.5.
- Adskil forsigtigt musklen af interesse (tibialis anterior (TA) i dette tilfælde) fra knoglerne nedenunder, startende fra senen og fjern.
- Udskære musklen, dække det i oktober (Optimal Cutting Temperatur forbindelse), og læg det fladt på et mærket til engangsbrug frysning mug. Sørg for, at musklen er på sit normale fysiologiske orientering (hoved til tail) uden strækning. Alternativt fryse musklen på små styrofoam torve og pin det ved hjælp af insekt ben for at sikre den korrekte længde af musklerne.
- Chill 2-methylbutan (isopentan) i et stålbæger anvendelse af flydende nitrogen. Dette tager i gennemsnit 3-5 min. Hold omrøring mellemrum, indtil hvide bundfald begynder at danne på bunden og væggene af bægerglasset.
BEMÆRK: Når dette sker, har isopentan nået optimal frysning temperatur (-150 ° C) - Dyp formene indeholdende muskler i kølede 2-methylbutan. Frys små muskler som mellemgulvet og extensor digitorum longus (EDL) til 6 personer - 12 sek og større muskler ligesom gastrocnemius soleus (GS) og triceps til 15-20 sek. Må ikke fryses musklerne for længe, da det kan føre til revnedannelse.
- Overfør de frosne væv på tøris og lad isopentan fordampe (bemærk, at denne proces tager i gennemsnit omkring 15-20 min). Pak væv i aluminiumsfolie og gemme dem på uLTRA lav temperatur (-70 ° C til -80 ° C) indtil sektionering.
2. Integrering væv i OLT Forbered Tissue Block
- Transport væv på tøris til at cyrostat at forhindre optøning. Overførsel væv til kryostatkammeret (indstillet ved -20 til -24 ° C for at undgå fuld optøning af væv) og lad dem ækvilibrere i 30 min.
- Drej Peltier bugten køling på. Hvis kryostat ikke har denne køling, bruge aerosol køling spray til hurtigt fryse OLT. Lad ikke den muskel tø på ethvert tidspunkt i løbet af indlejring da dette kan resultere i frostskader.
- Tilføj et ensartet tyndt lag af oktober på prøven disken og lad det afkøle. Når de fleste af OLT er frosset på bunden, mens den stadig flydende på toppen, sæt vævet på den korrekte orientering (vinkelret på oktober for tværgående sektioner og parallelt med oktober for langsgående sektioner). Brug aerosol køling spray til hurtigt fryse oktober Tryk på unembeded del af vævet med varme extractor og vent 45 sek.
- Tilføj et andet tyndt lag OLT omkring musklen, spray med aerosol afkøling spray og udtrække varme som i det foregående trin.
- Holde tilføje oktober i små intervaller og hurtigt fryse OLT ved hjælp af en kombination af aerosol kølende spray og varme emhætte, indtil hele musklen er dækket.
- Sætte varmeafledningsblokken på toppen af vævet blok og vent i 5 minutter.
3. Forberedelse Sektioner og Identifikation af afsnit fra Mid-mave region Muskler
- Monter prøven på objekthovedet. Stram knappen for at fastgøre disken. Sørg for, at prøven disken er i god kontakt med modellen hovedet.
- Justere temperaturen kammer til mellem -21 og -24 ° C, og vent, indtil den indstillede temperatur er opnået.
- Justere tykkelsen indstillinger (7 pm); trimme blokken ved at fremme eller trække blokken ved hjælp grove og fine indstillinger.
- Saml afsnittenepå forvarmet positivt ladede objektglas ved at trykke på toppen af slæden på sektionerne, ved hjælp af tiltrækning mellem modsatte ladninger for at lette vedhæftningen af de afskårne sektioner til objektglasset.
- Identificer de mid-mave sektioner ved at måle tværsnitsareal (CSA) af afsnittene. Gøre dette ved hjælp imaging software på den computer, der er sluttet til mikroskopet.
BEMÆRK: Fase kontrast billeder er taget, og omkredsen af hele musklen måles via en sporing funktion softwareprogrammet. Dette vil give både CSA samt minimum ferret diameter (mål for fiber tværsnit størrelse, der er udtrykt som den mindste afstand mellem to parallelle tangenter på modstående sider af en partikel) målinger. Bemærk: Når CSA og minimale ilder diameter målinger begynder at plateau, er midt mave er nået. - Inventory og arkivere dias ved -80 ° C for fremtidig farvning.
BEMÆRK: Okt behøver ikke at fjernes før staining procedurer. Når objektglas med dækglas, de er klar til at blive farves straks.
4. Farvning
BEMÆRK: Mens kan findes detaljerede trin-for-trin procedurer på produktet datablad og bør følges for farvningsprocedurer, kan kræves personlig optimering for at opnå optimal farvning.
- Fordi montering medier (se tabel) ikke er blandbart med vand, dehydrere slides gennem stigende kvaliteter af alkohol (2 min hver i 70%, 95% og 100% ethanol) og klare dem med xylen (100% i 5 minutter) for at sikre slides ikke bliver uigennemsigtig med tiden.
- Coverslip sektioner og lad dem tørre. Billede med mikroskop er udstyret med imaging software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Opstillingen til høst og frysning af væv kan ses i figur 1. Udskårne væv skal opbevares på en gaze gennemvædet i PBS for at undgå tørring (figur 1A). Når der er valgt væv, der skal anvendes til histologisk analyse bør de dyppes i OCT og lagt ud på kryo skimmel i den korrekte orientering og så tæt på fysiologisk længde som muligt for at sikre nøjagtig morfologi (figur 1B). Opslæmning af isopentan egnet til væv frysning kan opnås ved afkøling isopentan i flydende nitrogen og omrøring indtil små hvide bundfald vises nederst. På dette tidspunkt, medierne er egnet til frysning (figur 1C). Væv skal fryses 6-15 sek i afkølet isopentan afhængigt af størrelsen / tykkelsen af vævet (figur 1D). Efter frysning, vil musklen vises kridtagtige hvide på hvilket tidspunkt det skal opbevares på tøris og senere overført til -80 <strong> ° C fryser.
Kryostat indstilling og ingredienser der kræves til fremstilling af musklen blok ved gradvist at indlejre vævet i OCT er vist i figur 2. Kryostaten skal indstilles mellem -20 og -24 ° C (figur 2A). Oktober og Freeze-Det skal være let tilgængelige for at skabe blok egnet til sektionering. Inde i kryostat skal have små pensler til at manipulere og tromle cut afsnit for slide gør samt pincet til håndtering af væv blok fordi det aldrig bør berøres med hænderne for at sikre vævet forbliver frosne (figur 2B). Oktober bør føjes til væv til at skabe sektionering blok, men skal straks fryses med Freeze-It spray og derefter yderligere afkølet med varme-emhætte afbilledet her (figur 2C). For tværsnit bør væv anbringes på prøven hovedet, så den er orienteret vinkelret på bladet (figur 2D). Setillinger bør justeres for at opnå de ønskede snittykkelse (5-10 um afhængigt af væv).
Hvis frosset korrekt vævet ansigt skal være kalkholdig hvid, mens en væv, der blev frosset forkert eller optøet under montering processen vises rød / pink. Figur 3 viser repræsentative væv for forkert håndteret prøver (figur 3A) og korrekt håndteret prøver (figur 3B) .
I midten mave region bestemmes ved måling CSA og mindste diameter fritte under anvendelse af et mikroskop udstyret med fasekontrast optik og billedanalyse-software. Et repræsentativt skærmbillede af analyse software er vist i figur 4. Hematoxylin og eosin farvede billeder af en korrekt frosset og sektioneret biopsi sammen med en fastfrysning beskadiget biopsi af tibialis anterior (TA) muskler er vist i figur 5. Sektioner, der er korrekt forarbejdet vil have konsekvent morphology og endda farvning hele (figur 5A). Uretmæssigt behandlede muskler, der fryse beskadigede eller for tidligt optøede vil synes at have flere pauser i morfologi og har udseende af "strimlet hvede" (figur 5B). Figur 6 viser befugtet kammer for optimal immunfarvning. Slides bør dækkes med parafilm, holdt på en våd køkkenrulle, og forseglet i en lille boks for at undgå udtørring af afsnittene under immunfarvning. Figur 7 viser en stikprøve immunhistokemi dias, der er blevet ordentligt forberedt og farves.
Figur 1. Forberedelse og oprettet for korrekt væv frysning. (A) udskåret væv skal opbevares på gaze dyppet i PBS. (B) Væv selectedfor histologiskeanalyse dyppet i oktober og lagt ud på kryo skimmel i den rigtige retning (fra maven til senen), og så tæt på fysiologisk længde som muligt. (C) opslæmning af isopentan egnet til væv. Bemærk: små hvide bundfald vises nederst. (D) Frosset væv efter dypning i isopentan. Bemærk:. Kalkholdig hvidt udseende Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Kryostat indstillinger og ingredienser, der er nødvendige for skæring. (A) Kryostat indstilles mellem -20 og -24 ° C med oktober og aerosol køling spray let tilgængelige. (B) Inde opsætningen af kryostat komplet med små pensler til at manipulere og tromle cut sections for slide gør samt pincet til håndtering af væv blok. (C) Frosset væv blok klar til at blive afkølet med varmeafledningsblokken (hvid pil). (D) Tissue blok indstillet på montering hovedet klar til at blive skåret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Repræsentative væv af korrekt og ukorrekt bevarede muskler. (A) Forkert frosne eller håndteres (B) Korrekt frosne og håndteres muskler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Bestemmelse af tværsnitsareal af TA muskel hjælp Nikon imaging software. Screenshot af fase kontrast billede af muskel sektion, der er blevet cirkel hjælp forestille software til måling af CSA og min ilder diameter. Klik her for at se en større version af dette figur.
Figur 5. Repræsentative billeder af korrekt og forkert forberedt H & E farvede muskler. (A) Korrekt behandlet sektion. (B) Forkert forarbejdet fryse beskadiget muskel sektion. Venligst click her for et større version af dette tal.
Figur 6. fugtigt kammer egnet til immunfarvning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Eksempel på immunhistokemi dias ordentligt forberedt og farvede dias. Slide er blevet farvet med Fibronectin (grøn) og DAPI (blå). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Histologi og immunhistokemi er blevet anvendt som centrale redskaber til forståelse af manifestation og progression af patologi i forskellige neuromuskulære lidelser. Klassisk, blev muskelbiopsier først fikseret i formaldehyd og derefter indlejret med paraffin. Mens formaldehyd fiksering bevarer vævet arkitektur og giver vævet opbevaring og transport ved RT, det også inaktiverer enzymer og krydsbindinger proteiner nødvendiggør yderligere skridt til at opnå præcis immunfarvning. Dette problem er elimineret med brugen af frosne snit men denne metode giver unikke tekniske udfordringer med at opnå optimale farvningsresultater og præcise fortolkning 14,15.
For det første er det vigtigt, at prøver fryses umiddelbart efter kirurgisk excision som autolyse og nedbrydning begynder snart efter fjernelse fra kroppen. Væv, skal også fryses hurtigt og grundigt for den korrekte mængde tid der varierer afhængigt af størrelsen/ Tykkelse af vævet. Hvis dette ikke sker korrekt, fryse skader vil forekomme rendering vævet ubrugelig for histologisk evaluering. Efter frysning, skal vævene straks lagret på tøris og derefter overført til en ultra lav temperatur (-80 ° C) fryser indtil sektionering. Det er vigtigt at bemærke, at væv ikke bør fjernes fra fryseren uden at være på tøris fordi fryse-tø også vil beskadige væv arkitektur.
En anden note af betydning, når du udfører histologiske analyse er at sørge for at altid at analysere den samme del af vævet af interesse at sikre ensartethed blandt analyse. Dette kan gøres i muskelvæv sektioner ved at udføre analyse af midbelly. Dette er den del af den muskel, der er den tykkeste og derfor vil have den største tværsnitsareal. For at sikre, at du rent faktisk sektionering af midbelly, bør måles CSA af efterfølgende sektioner ved hjælp af histologiske imaging software. Measurements bør fortsat gøres indtil tværsnitsareal begynder at plateau. Når dette sker, har midten mave er nået; kun denne del af vævet bør anvendes til histologisk analyse for at sikre ensartethed blandt sammenligninger.
Efter sektionering er afsluttet og objektglas er blevet fremstillet, bør de lov til at tørre ved stuetemperatur til 1 - 2 timer. Tørring giver mulighed for korrekt vedhæftning af sektionen til objektglasset og forhindrer også overskydende vand at krystallisere efter overførslen til -80 ° C fryser. Det er vigtigt at bemærke, at slides også kun skal håndteres på tøris, når der vælges objektglas til analyse for at forhindre fryse-tø cykler. Når dias er blevet udvalgt til farvning, protokoller følger med pletten skal følges først på forsøgsbasis indtil der er opnået optimale resultater. Ved udførelse immunfarvning, er det vigtigt at sikre slides ikke tørre hele proceduren. Tørring af dias kan resultere i forbigående interaktions til at forblive intakt efter inkubation. Disse interaktioner kan ikke fjernes under vask og resultere i uspecifik farvning. Tørring kan undgås ved at holde objektglas i en fugtig atmosfære. Udførelse inkubationer med sektioner dækket med parafilm og glider på en fugtig papirserviet forseglet i en lille dias boks er tilstrækkelig til at sikre dias vil ikke tørre på noget tidspunkt under proceduren.
Histologi er et vigtigt redskab i at visualisere morfologi og forskellige aspekter af patologi. Mens noget trivielt, er det af største betydning at tage stor omhu i udarbejdelsen af væv, der skal bruges til histologi. Fra excision til frysning, sektionering og farvning, bør væv håndteres på en måde, der vil undgå frostskader og giver de mest præcise billeder muligt. Uden korrekt opbevaring vil farvningen ikke nøjagtigt afspejler fysiologi og derfor føre til fejlfortolkninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., office phone 1-800-248-0123 Alternative: Richard Allen Scientific |
| Microscope | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternative: Olympus |
| Image analysis software | Nikon Imaging Software Basic Research | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternatives: Image J, Metamorph |
| Isoflurane | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | 1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A. |
| OCT | 4583 | Sakura Inc. | Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternative source: Leica Microsystem |
| Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Disposable tissue mold | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Colorfrost plus slides | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Acetone | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Ethyl alcohol | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| 2-methyl butane | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
References
- Bonnemann, C. G., et al. Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies. Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).
- Caughey, J. E., Pachomov, N. The diaphragm in dystrophia myotonica. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).
- Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings. AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).
- Platzer, A. C., Chase, W. H. Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy. The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).
- Mercuri, E., et al. Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine. Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).
- Tasca, G., et al. Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles. PloS one. 7, e38779 (2012).
- Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy. The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).
- Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A. Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).
- Mehuron, T., et al. Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy. Skeletal muscle. 4, 14 (2014).
- Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A. Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).
- Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy. Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).
- Maccarty, W. C. The Diagnostic Reliability of Frozen Sections. The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).
- Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry. Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).
- Turan, T., et al. Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia. Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).
