Abstract
Valutazione istologica delle biopsie muscolari ha servito come uno strumento indispensabile per la comprensione dello sviluppo e la progressione della patologia di malattie neuromuscolari. Tuttavia, al fine di fare ciò, cura adeguata deve essere presa quando asportare e conservare tessuti per ottenere la colorazione ottimale. Un metodo di conservazione del tessuto comporta fissa tessuti in formaldeide e poi incorporare con la cera di paraffina. Questo metodo mantiene la morfologia bene e consente la memorizzazione a lungo termine a temperatura ambiente, ma è pesante e richiede una gestione di sostanze chimiche tossiche. Inoltre, i risultati di fissazione formaldeide in antigene cross-linking, che richiede protocolli di recupero antigene per immunocolorazione efficace. Al contrario, sezionamento congelati non richiede fissazione e mantiene quindi biologica dell'antigene conformazione. Questo metodo fornisce anche un netto vantaggio in breve tempo di girarsi, il che rende particolarmente utile in situazioni che necessitano di una rapida valutazione istologica come intraoperativa biopsie chirurgiche. Qui si descrive il metodo più efficace di preparazione biopsie muscolari per la visualizzazione con diverse macchie istologiche ed immunologiche.
Introduction
L'esame di istologia muscolare gioca un ruolo fondamentale nella comprensione dei diversi tipi di malattie neuromuscolari 1-4. Quando combinato con altre tecniche, permette ai ricercatori di avere una migliore idea della manifestazione e la progressione della patologia e possono anche essere essenziale per valutare l'efficacia di un intervento terapeutico 5-10. Tuttavia, per essere precisi, i tessuti devono essere conservati in modo appropriato in modo da preservare lo stato fisiologico immediatamente prima escissione. Ciò richiede grande attenzione durante la rimozione, la conservazione, il sezionamento, e la colorazione.
I tessuti possono essere preparati in due modi diversi per luce studio microscopico. Il primo metodo, fissati in formalina paraffina (FFPE) sezioni, richiede tessuti da fissare nel 10% naturale formaldeide tamponata prima di essere embedded con paraffina 11,12. La fase di fissazione aiuta a preservare la morfologia meglio, ma anche link incrociati pr endogenooteins e perciò necessitano di procedure di recupero antigene intricato per immunostaining ed eliminando la possibilità di colorazione enzimatica su tali sezioni 12. Sezioni congelate, d'altra parte, non devono essere pre-fisso o trasformati; Pertanto, le proteine sono in grado di trattenere conformazioni biologici nativi 13,14. Inoltre, sezioni congelate consentono anche il tempo di risposta rapido, che a volte è necessario, ad esempio nella diagnosi intraoperatoria di sarcomi e altri biopsie chirurgiche 15. Tuttavia, se non fatto correttamente, questo metodo è soggetto a danni dovuti al ghiaccio, che introduce modifiche all'architettura muscolare rendendo sezioni inadatti per l'esame istologico. Questo documento illustrerà il metodo più efficace per preparare biopsie muscolari per raggiungere colorazione ottimale per un esame adeguato.
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Protocol
1. Tissue Raccolta e congelamento dei tessuti muscolari
- Euthanize il mouse con un sovradosaggio di isoflurano (2-cloro-2- (difluorometossi) -1,1,1-trifluoro-etano). Eseguire questo passaggio in una cappa aspirante e utilizzare un metodo di contenimento secondario, come un essiccatore o una campana di vetro contenente un batuffolo di cotone imbevuto di isoflurano.
- Confermare la morte con fermezza spremitura zampa. Utilizzare un metodo secondario dell'eutanasia come dislocazione cervicale.
- Bagnare il pelo con il 70% di alcool per ridurre l'incollaggio di ciocche di capelli sciolti sui muscoli. Sbucciare la pelle di dosso l'arto utilizzando una pinza sottile come 5 #.
- Separare cautamente il muscolo di interesse (tibiale anteriore (TA) in questo caso) dalle ossa sotto, partendo dal tendine e rimuovere.
- Accise il muscolo, coprire in OCT (Optimum Cutting composto Temperature), e adagiarlo orizzontalmente su uno stampo di congelamento e getta etichettati. Assicurarsi che il muscolo è al suo normale orientamento fisiologico (testa di tail) senza stiramento. In alternativa, congelare il muscolo su piccole piazze di polistirolo e il pin con perni di insetti al fine di garantire la corretta lunghezza dei muscoli.
- Raffreddare 2-metilbutano (isopentano) in un becher di acciaio con azoto liquido. Questo richiede, in media, 3-5 min. Continuate a mescolare intermittenza fino precipitati bianchi cominciano a formarsi sul fondo e sulle pareti del bicchiere.
NOTA: In questo caso, isopentano ha raggiunto la temperatura ottimale di congelamento (-150 ° C) - Immergere gli stampi contenenti muscoli del refrigerata 2-metilbutano. Congelare piccoli muscoli, come il lungo del diaframma e delle dita (EDL) per 6-12 secondi e muscoli più grandi, come il soleo gastrocnemio (GS) e tricipiti per 15 - 20 sec. Non congelare i muscoli troppo a lungo come questo può portare alla rottura.
- Trasferire i tessuti congelati su ghiaccio secco e lasciare evaporare isopentano (notare che questo processo richiede, in media, circa 15 - 20 min). Avvolgere i tessuti in un foglio di alluminio e memorizzarli in ultra bassa temperatura (-70 ° C a -80 ° C) fino sezionamento.
2. Incorporare i tessuti in ottobre preparare Tissue Block
- Tessuti di trasporto su ghiaccio secco per cyrostat per evitare lo scongelamento. Tessuto Trasferimento a criostato camera (impostato a -20 e -24 ° C per evitare la piena scongelamento dei tessuti) e lasciarli equilibrare per 30 min.
- Girare la baia Peltier raffreddamento. Se il criostato non ha questo raffreddamento, utilizzare raffreddamento spray aerosol per congelare rapidamente la Ottobre Non lasciate che il disgelo muscolo in qualsiasi momento durante l'incorporamento come questo può causare danni da congelamento.
- Aggiungere uno strato sottile uniforme ottobre sul disco dei campioni e lasciate raffreddare. Quando la maggior parte della Ottobre è congelato sul fondo mentre ancora liquido sulla parte superiore, inserire il tessuto con l'orientamento corretto (perpendicolare a ottobre per le sezioni trasversali e paralleli a ottobre per le sezioni longitudinali). Usare spruzzi di raffreddamento spray per congelare rapidamente ottobre Toccare la parte unembeded del tessuto con ext caloreRATTORE e attendere 45 secondi.
- Aggiungere un altro strato sottile dell'OCT intorno al muscolo, spruzzare con spray di raffreddamento aerosol ed estrarre il calore nel passaggio precedente.
- Continuare ad aggiungere OCT in piccoli incrementi e rapidamente congelare la OCT utilizzando una combinazione di spray aerosol ed estrattore di calore di raffreddamento fino a quando l'intero muscolo è coperto.
- Mettere l'estrattore di calore sulla parte superiore del blocco di tessuto e attendere per 5 min.
3. Preparazione Sezioni e identificare le sezioni da Mid-pancia Regione dei muscoli
- Montare il campione sulla testa dei campioni. Serrare la manopola per fissare il disco. Assicurarsi che il disco di preparato è in buon contatto con la testa del preparato.
- Regolare la temperatura della camera tra il -21 e -24 ° C e attendere fino al raggiungimento della temperatura impostata.
- Regolare le impostazioni di spessore (7 micron); tagliare il blocco avanzando o ritraendo il blocco utilizzando le impostazioni grossolane e fini.
- Raccogliere sezioniil pre-riscaldato vetrini da microscopio carica positiva premendo la parte superiore della slitta sulle sezioni, utilizzando l'attrazione tra cariche opposte per facilitare l'adesione delle sezioni tagliate alla diapositiva.
- Identificare sezioni metà pancia misurando sezione trasversale (CSA) delle sezioni. Fare questo software di imaging utilizzando il computer collegato al microscopio.
NOTA: le immagini a contrasto di fase sono prese e la circonferenza di tutto il muscolo viene misurata tramite una funzione di traccia sul programma software. Questo produrrà sia CSA nonché diametro minimo ferret (misura della fibra dimensioni trasversali che si esprime come la distanza minima tra due tangenti paralleli sui lati opposti di una particella) misurazioni. Nota: Quando CSA e diametro minimo furetto misure cominciano a stabilizzarsi, a metà pancia è stato raggiunto. - Inventario e archiviare i vetrini a -80 ° C per il futuro colorazione.
NOTA: ottobre non ha bisogno di essere rimosso prima di staininprocedure g. Una volta che le diapositive sono coprioggetto, sono pronti per essere colorati immediatamente.
4. Colorazione
NOTA: Durante le procedure dettagliate passo-passo possono essere trovati sulla scheda tecnica del prodotto e devono essere seguite per le procedure di colorazione, ottimizzazione personale può essere richiesto per ottenere la colorazione ottimale.
- Poiché il montaggio di mezzi (vedi tabella) non è miscibile con acqua, disidratazione diapositive attraverso crescenti gradi di alcool (2 min ciascuno in 70%, 95% e 100% etanolo) e chiaro con xilene (100% per 5 min) per garantire diapositive non diventano opachi nel tempo.
- Coverslip sezioni e lasciarli asciugare. Immagine con il microscopio dotato di software di imaging.
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Representative Results
Il set-up per la raccolta e il congelamento dei tessuti può essere visto in Figura 1. Tessuti asportati devono essere memorizzati su una garza imbevuta di PBS per evitare l'essiccazione (Figura 1A). Quando vengono selezionati i tessuti da utilizzare per l'analisi istologica devono essere immersi in OCT e disposti su stampo crio nell'orientamento corretto e più vicino alla lunghezza fisiologica possibile per garantire morfologia accurata (Figura 1B). Slurry di isopentano adatti per il congelamento del tessuto può essere ottenuto isopentano raffreddamento in azoto liquido e mescolando fino piccoli precipitati bianchi appaiono in fondo. A questo punto, il supporto è adatto per congelamento (Figura 1C). I tessuti devono essere congelati 6-15 sec in isopentano raffreddato a seconda delle dimensioni / spessore del tessuto (Figura 1D). Dopo il congelamento, il muscolo apparirà bianco gessoso a quel punto deve essere conservato in ghiaccio secco e poi trasferito a -80 <strong> ° C freezer.
Impostazione criostato e gli ingredienti necessari per la preparazione del blocco muscolare gradualmente incorporando il tessuto in OCT sono mostrati nella Figura 2. Il criostato deve essere impostato tra -20 e -24 ° C (Figura 2A). Ottobre e Fermo-It dovrebbero essere prontamente disponibili per creare blocco adatto per il sezionamento. All'interno del criostato dovrebbe avere piccole spazzole di manipolare e appiattire sezioni tagliate per rendere scorrevole così come pinzette per la movimentazione di blocco dei tessuti perché dovrebbe mai essere toccata con le mani al fine di garantire il tessuto rimane congelato (Figura 2B). Ottobre dovrebbe essere aggiunto al tessuto per creare blocchi di sezionamento, ma deve essere immediatamente congelata con gelo-It spruzzo e poi ulteriormente raffreddato con il calore-estrattore nella foto qui (Figura 2C). Per sezioni trasversali, tessuto deve essere posizionato sulla testa del preparato in modo che sia orientata perpendicolarmente alla lama (Figura 2D). Seraccordi devono essere regolati per ottenere lo spessore di taglio desiderato (5-10 micron a seconda del tessuto).
Se congelato correttamente il volto tessuto deve essere calcareo bianco, mentre un tessuto che è stato congelato in modo improprio o scongelato durante il processo di montaggio apparirà rosso / rosa. La figura 3 mostra i tessuti rappresentativi dei campioni utilizzati impropriamente (Figura 3a) e di campioni opportunamente trattati (Figura 3B) .
La regione ventre metà è determinata misurando CSA e diametro minimo furetto utilizzando un microscopio dotato di ottica a contrasto di fase e software di analisi di immagine. Una schermata rappresentante di software di analisi è mostrato in Figura 4. Ematossilina ed eosina immagini macchiate di una biopsia correttamente congelato e sezionato con un congelamento biopsia danneggiata del tibiale anteriore (TA) muscoli sono mostrati nella Figura 5. Le sezioni sono adeguatamente trattati avrà morpholo coerentegy e anche la colorazione tutta (Figura 5A). Impropriamente elaborati muscoli che vengono blocco danneggiato o prematuramente sembreranno avere più interruzioni nella morfologia e hanno l'aspetto di "frumento tagliuzzato" (Figura 5B) scongelate. Figura 6 illustra camera umidificata per immunocolorazione ottimale. Diapositive dovrebbe essere coperto con parafilm, tenuti su un tovagliolo di carta bagnata, e sigillato in una piccola scatola per evitare l'essiccamento delle sezioni durante immunocolorazione. La figura 7 illustra una immunoistochimica diapositiva campione che è stato adeguatamente preparato e macchiato.
Figura 1. Preparazione e istituito per una corretta il congelamento dei tessuti. (A) asportati i tessuti dovrebbero essere memorizzati su una garza imbevuta di PBS. (B) I tessuti selectedfor istologicaanalisi immerso in ottobre e sono disposte su stampo crio con l'orientamento corretto (da pancia a tendine), e il più vicino alla lunghezza fisiologica possibile. (C) Slurry di isopentano adatto per il tessuto. Nota: i piccoli precipitati bianchi appaiono in fondo. (D) dei tessuti congelati dopo immersione in isopentano. Nota:. Aspetto bianco gessoso Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Impostazioni criostato e gli ingredienti necessari per il sezionamento. (A) Criostato impostata tra -20 e -24 ° C, con ottobre e spray aerosol raffreddamento prontamente disponibili. (B) All'interno impostazione del criostato completo di piccole spazzole di manipolare e appiattire secti taglioons per vetrino fare così come pinzette per la gestione del blocco dei tessuti. (C) Blocco dei tessuti congelati pronti per essere raffreddato con estrattore di calore (freccia bianca). Blocco (D) Tissue impostato sulla testa pronto per essere tagliato di montaggio. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. tessuti rappresentativi di muscoli in modo corretto e non correttamente conservati. (A) impropriamente congelati o trattati (B) Correttamente congelati e gestiti muscolare. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Determinazione della sezione trasversale del muscolo TA mediante software di imaging Nikon. Screenshot fase di contrasto immagine sezione muscolo che è stato circondato con immaginare software per la misurazione di CSA e diametro del furetto min. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questo figura.
Figura 5. Immagini rappresentative della muscolatura H & E macchiato correttamente e in modo improprio preparati. (A) Correttamente sezione elaborati. (B) freeze danneggiato sezione muscolo Impropriamente elaborato. Si prega di click qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Camera umidificata adatto per immunocolorazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7. Campione immunoistochimica slide adeguatamente preparati e macchiato scivolo. Presentazione è stata macchiata con fibronectina (verde) e DAPI (blu). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Istologia e immunoistochimica sono stati utilizzati come strumenti chiave per comprendere la manifestazione e la progressione della patologia in vari disturbi neuromuscolari. Classicamente, biopsie muscolari sono stati fissati prima di formaldeide e poi integrati con paraffina. Mentre fissazione formaldeide conserva l'architettura dei tessuti e permette lo stoccaggio dei tessuti e il trasporto a temperatura ambiente, è inattiva anche enzimi e proteine legami crociati che richiedono ulteriori misure per raggiungere immunocolorazione accurate. Questo problema viene eliminato con l'uso di sezioni congelate ma questo metodo presenta sfide tecniche uniche nell'ottenere risultati di colorazione ottimali e accurata 14,15 interpretazione.
In primo luogo, è essenziale che i campioni essere congelati immediatamente dopo asportazione chirurgica come autolisi e la decomposizione iniziano subito dopo la rimozione dal corpo. I tessuti devono essere congelati rapidamente e accuratamente per la corretta quantità di tempo che varia a seconda della dimensione/ Spessore del tessuto. Se ciò non viene fatto correttamente, congelare danni avverrà rendendo il tessuto inutile per la valutazione istologica. Dopo congelamento, tessuti devono essere immediatamente conservati in ghiaccio secco e poi trasferito ad una bassa temperatura ultra (-80 ° C) freezer fino sezionamento. È importante notare che i tessuti non devono essere rimossi dal congelatore senza essere in ghiaccio secco perché freeze-thaw sarà anche danneggiare architettura tissutale.
Un'altra nota di importanza quando si eseguono analisi istologica è prendersi cura di analizzare sempre la stessa parte del tessuto di interesse per garantire uniformità tra analisi. Questo può essere fatto per le sezioni muscolari effettuando un'analisi del midbelly. Questa è la parte del muscolo che è più spessa e quindi avrà la grande area della sezione trasversale. Al fine di garantire che si sta effettivamente sezionare il midbelly, CSA delle sezioni successivi deve essere misurata utilizzando software di imaging istologico. MeasuremEnt dovrebbero continuare ad essere fatto fino a quando l'area della sezione trasversale comincia a plateau. Quando questo avviene, la metà pancia è stato raggiunto; solo questa parte del tessuto deve essere usato per l'analisi istologica garantire l'uniformità fra comparazioni.
Dopo sezionamento è stato completato e le diapositive sono stati predisposti, dovrebbero essere lasciate asciugare a temperatura ambiente per 1 - 2 ore. Essiccazione permette la corretta aderenza della sezione per la diapositiva e impedisce anche l'acqua in eccesso cristallizzare seguente trasferimento a -80 ° C freezer. È importante notare che i vetrini dovrebbero essere trattati solo in ghiaccio secco quando si seleziona vetrini per analisi per evitare cicli di congelamento-scongelamento. Una volta che le diapositive sono stati selezionati per la colorazione, i protocolli inclusi con la macchia dovrebbe essere seguita prima in via sperimentale fino a ottimi risultati sono stati raggiunti. Quando si esegue immunoistochimica, è importante assicurarsi che le diapositive non si asciugano durante tutta la procedura. Essiccazione di diapositive può provocare interazioni transientis di rimanere intatto dopo l'incubazione. Queste interazioni non possono essere rimossi durante i lavaggi e causare colorazione aspecifica. L'essiccazione può essere evitata tenendo vetrini in atmosfera umidificata. Esecuzione di incubazione con parti ricoperte con parafilm e scivoli su un tovagliolo di carta umido sigillato in una piccola scatola di scorrimento è sufficiente a garantire i vetrini non si asciughino in qualsiasi momento durante la procedura.
Istologia è uno strumento essenziale per la visualizzazione morfologia e vari aspetti della patologia. Mentre un po 'banale, è della massima importanza fare molta attenzione nella preparazione dei tessuti da utilizzare per l'esame istologico. Da escissione al gelo, sezionamento e colorazione, i tessuti dovrebbero essere trattati in maniera tale da evitare danni da congelamento e la resa delle immagini più accurate possibile. Senza una buona conservazione, la colorazione non riflettere accuratamente la fisiologia e quindi portare a interpretazioni errate.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., office phone 1-800-248-0123 Alternative: Richard Allen Scientific |
| Microscope | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternative: Olympus |
| Image analysis software | Nikon Imaging Software Basic Research | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternatives: Image J, Metamorph |
| Isoflurane | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | 1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A. |
| OCT | 4583 | Sakura Inc. | Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternative source: Leica Microsystem |
| Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Disposable tissue mold | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Colorfrost plus slides | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Acetone | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Ethyl alcohol | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| 2-methyl butane | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
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