Abstract
筋肉生検の組織学的評価は、神経筋疾患の病態の発症および進行の理解に不可欠なツールを務めています。しかし、そうするためには、適切なケアは、最適な染色を達成するための組織を切除し、保存するときに注意が必要です。組織保存する一つの方法は、ホルムアルデヒドで組織を固定し、その後パラフィンワックスでそれらを埋め込むことを含みます。この方法は、よく形態を保持し、室温で長期保存を可能にしますが、面倒であり、有害な化学物質の取り扱いが必要です。また、効果的な免疫染色のための抗原回復プロトコルを必要と抗原架橋、ホルムアルデヒド固定をもたらします。逆に、凍結切片は、固定を必要とし、したがって、生物学的な抗原の立体構造を保持しません。この方法は、intraoperaような迅速な組織学的評価を必要とする状況で、それは特に有用なもの、時間の周りクイックターンで明確な利点を提供します外科的生検を的。ここでは、異なる組織学的および免疫学的汚れによる可視化のための筋肉生検を調製する最も効果的な方法を説明します。
Introduction
筋肉組織学の検討は、神経筋障害1-4の異なるタイプの理解に重要な役割を果たしています。他の技術と組み合わせると、それは研究者が病状の症状および進行のより良いアイデアを得ることができ、また、治療的介入5-10の有効性を評価するために不可欠であることができます。しかし、正確に、組織を直ちに切除前の生理的状態を維持するように適切な方法で保存する必要があります。これは、除去、保存、切片、および染色の際に細心の注意が必要です。
組織を光学顕微鏡研究のため、2つの異なる方法で調製することができます。 （FFPE）のセクション、埋め込 まれた第1の方法、ホルマリン固定パラフィンは、組織はパラフィンワックス11,12に埋め込 まれる前に、10％の自然緩衝ホルムアルデヒド中に固定することが必要です。固定工程は、より良い形態を維持するのに役立つだけでなく、クロスリンク内因性のPRoteinsは、このように免疫染色のための複雑な抗原回復手順を必要とし、このようなセクション12の酵素染色の可能性を排除します。凍結切片を、一方、予め固定または処理する必要はありません。したがって、タンパク質は、天然の生物学的な立体配座13,14を保持することができます。また、凍結切片はまた、時間に肉腫および他の外科的生検15の術中診断で、たとえば、必要である、迅速なターンアラウンドタイムを可能にします。適切に行われていない場合は、この方法は、組織学的検査のためのセクションでは、不向き作る筋肉のアーキテクチャの変更を紹介しダメージを、凍結する傾向があります。本稿では、適切な検査のために最適な染色を達成するために、筋肉生検を準備するための最も効果的な方法を概説します。
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Protocol
1.組織の収穫と筋組織の凍結
- イソフルラン（2-クロロ-2-（ジフルオロメトキシ）-1,1,1-トリフルオロエタン）の過剰摂取で、マウスを安楽死させます。ヒュームフードで、このステップを実行し、そのようなデシケーターやイソフルランに浸した綿棒を含むベルジャー等の二次封じ込めメソッドを使用します。
- しっかりとフットパッドを絞ることによって死を確認してください。このような頸椎脱臼などの安楽死の二次メソッドを使用します。
- 筋肉の緩み髪の毛の付着を低減するために、70％のアルコールで毛を濡らします。このような＃5のように微細な鉗子を使用して、四肢切断、皮膚の皮をむきます。
- 慎重に、下骨から（この場合は前脛骨筋（TA））、目的の筋肉を分離腱から開始して削除します。
- 、筋肉を切除10月（最適切断温度化合物）でそれをカバーし、標識された使い捨ての凍結金型の上に平らに横たわっていました。筋肉は、その正常な生理的姿勢であることを確認してください（TAIにヘッド延伸することなくL）。あるいは、小さな発泡スチロールの正方形の筋肉を凍結し、筋肉の正しい長さを確保するために昆虫ピンを使用してピン。
- 液体窒素を用いた鋼ビーカーに2-メチルブタン（イソペンタン）を冷やします。 5分 - これは、平均3になります。白い沈殿物をビーカーの底と壁に形成し始めるまで、断続的に攪拌してください。
注：この場合、イソペンタン、最適な凍結温度に到達した（-150°C） - チルド2-メチルブタンの筋肉を含む金型を浸し。 12秒と腓腹筋ヒラメ筋（GS）と15上腕三頭筋などの大きな筋肉 - - 20秒かかる6ダイアフラムと長指伸筋（EDL）などの小さな筋肉をフリーズします。あまりにも長い間、この亀裂につながる可能性としてのための筋肉を凍結しないでください。
- ドライアイスの上で凍結組織を移し、（このプロセスは15の周りの平均をとることに注意してください - 20分）イソペンタンを蒸発させて。アルミ箔で組織をラップとuでそれらを格納切片までLTRA低温（-70℃〜-80℃）。
2.組織ブロックを準備するために10月に組織を埋め込みます
- ドライアイス上で輸送組織が融解を防ぐためにcyrostatします。 （組織の完全融解を回避するために、C°-24、-20に設定）チャンバをクライオスタットし、それらを30分間平衡化させるために組織を転送します。
- の冷却ペルチェベイの電源を入れます。クライオスタットは、この冷却を持っていない場合は、すぐに10月を凍結するエアロゾル冷却スプレーを使用しています。このような埋め込み中の任意の時点での筋融解は、凍結損傷を与えることができないようにしてください。
- 試料ディスク上の10月の均一な薄層を追加し、冷まします。上にまだ液体ながら10月のほとんどが底に凍結されている場合には、（横断面と縦断のための10月に平行のため10月に垂直な方向）正しい向きで組織を挿入します。すぐにOCTを凍結するエアロゾル冷却スプレーを使用してください。熱EXTと組織のunembeded部分に触れてractor、45秒間待ちます。
- 、筋肉の周りに10月の別の薄い層を追加し、エアロゾル冷却スプレーで噴霧し、前のステップと熱を抽出。
- 少しずつで10月を追加し続けると、すぐに全体の筋肉がカバーされるまでエアロゾル冷却スプレーおよび熱抽出器の組み合わせを使用して、10月にフリーズ。
- 組織ブロックの上に熱抽出を入れ、5分間待ちます。
3.切片を作製し、筋肉のミッド腹領域からのセクションを識別する
- 試料ヘッドの上に試料をマウントします。ディスクを右に回して、締め付けます。試料ディスクを試料ヘッドとの良好な接触状態にあることを確認します。
- °-21の間および-24℃に室内温度を調整し、設定温度が達成されるまで待ちます。
- 厚さの設定（7μm）を調整します。粗微動の設定を使用してブロックを前進または後退させることにより、ブロックをトリミング。
- セクションを収集上のスライドに切断面の付着を容易にするために、反対の電荷間の引力を使用して、セクションの上にスライドの上部を押して、正に荷電した顕微鏡スライドを予熱しました。
- セクションの断面積（CSA）を測定することにより、ミッドベリーセクションを識別します。顕微鏡に接続されているコンピュータにこの使用してイメージングソフトウェアを実行してください。
注：ソフトウェアプログラムのトレース機能を介して位相コントラスト画像が取得され、筋肉全体の円周を測定します。これは、CSA、ならびに最小フェレット直径（粒子の反対側にある2つの平行な接線の間の最小距離として表現される繊維断面サイズの測定）測定の両方が得られます。注：CSAと最小フェレット直径測定値がプラトーに開始すると、半ば腹に達しました。 - 将来の染色のために-80℃でスライドをインベントリおよびアーカイブします。
注：10月前staininに削除する必要はありません。G手順。スライドをカバーガラスをされると、彼らはすぐに染色される準備ができています。
4.染色
注：詳細なステップバイステップの手順は、製品データシートに記載されていますし、染色手順のために従うべきであるが、個人の最適化は、最適な染色を得るために必要とされ得ます。
- メディアは（表を参照）の取付は、水と混和しないので、（70％、95％、および100％エタノールに2分間ずつ）アルコールの増加グレードを通してスライドを脱水し、キシレン（5分間、100％）を確保するためにそれらをクリアスライドは、時間をかけて不透明になることはありません。
- セクションをカバースリップし、それらが乾燥してみましょう。イメージングソフトウェアを備えた顕微鏡を用いた画像。
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Representative Results
収穫および組織の凍結のためのセットアップを図1に見ることができる。切除した組織を乾燥する（ 図1A）を回避するために、PBSに浸したガーゼ上に格納されるべきです。組織を組織学的分析のために使用されるように選択される場合、それらは、OCT中に浸漬し、適切な向きでクライオモールド上に配置し、正確な形態（ 図1B）を確保することができるような生理学的長さに近いべきです。組織を凍結するのに適したイソペンタンのスラリーを液体窒素で冷却したイソペンタンを小さな白い析出物が下部に表示されるまで撹拌することにより達成することができます。この時点で、メディアが（ 図1C）を凍結するのに適しています。組織は、組織（ 図1D）のサイズ/厚さに応じて冷却したイソペンタン中で6-15秒から凍結されるべきです。凍結後、筋肉はそれを、その時点で白はドライアイス上に保存され、後に-80 <に転送する必要がありますチョークのように表示されます強い>℃の冷凍庫。
徐々にOCTで組織を埋め込 むことにより、筋ブロックを製造するために必要なクライオスタットの設定及び成分は、図2に示されている。クライオスタットは、-20と-24°C（ 図2A）との間に設定されるべきです。 10月、凍結は切片に適したブロックを作成するために容易に利用可能であるべきです。それは、組織が （ 図2B）冷凍のまま確実にするために手で触れてはいけませんので、クライオスタットの内部にスライドすることだけでなく、組織ブロックの処理のためのピンセットのカットのセクションを操作し、平坦化するために小さなブラシを持っている必要があります。 10月には、切片ブロックを作成するために、組織に追加する必要がありますが、すぐにスプレー凍結これで凍結し、さらに（ 図2C）、ここでは画像の熱抽出器で冷却する必要があります。横断面では、組織は、それは、ブレード（ 図2D）に垂直に配向されるように、試料ヘッドに配置する必要があります。 SEttingsは、所望の部分の厚さ（組織に応じて5〜10μm）を達成するように調整されるべきです。
正しく凍結した場合は、組織面が実装工程中に不適切に凍結または解凍した組織は、赤/ピンクに見えますが。白い粉を吹いたことが3の取り扱いが不適切なサンプルのための代表的な組織（ 図3A）と適切に処理サンプルを示します（ 図3B） 。
中間腹領域は、位相差光学系および画像解析ソフトウェアを装備した顕微鏡を使用してCSAおよび最小フェレット直径を測定することによって決定されます。解析ソフトウェアの代表的なスクリーンショットを図4に示されている。ヘマトキシリン及び前脛骨筋の凍結損傷した生検と共に、適切に凍結し、切片に生検の染色像をエオシン（TA）筋肉を図5に示されている。適切に処理されているセクションがあります一貫morpholoGY、さらには全体の染色（ 図5A）。凍結破損または途中で解凍し、不適切に処理筋肉が形態に複数のブレークを持っているように見えますし、「細切り小麦」（ 図5B）の外観を持つことになります。最適な免疫染色のためにチャンバを加湿6に示す図 。スライドをパラフィルムでカバーされるべきである、湿った紙タオル上に保持し、免疫染色切片中の乾燥を避けるために、小さなボックスで密封した。 図7は、適切に調製され、染色されたサンプルの免疫組織化学スライドを示しています。
図1.準備し、適切な組織凍結のために設定します。（A）切除した組織をPBSに浸したガーゼに格納する必要があります。 （B）組織学的selectedfor分析では、10月中に浸漬し、（腹から腱に）適切な方向にクライオモールド上に配置し、できるだけ生理的長さに近いです。組織に適したイソペンタン（C）スラリー。注：小さな白い沈殿物が下部に表示されます。 （D）イソペンタンに浸漬後凍結組織。注：チョークのような白い外観この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2.クライオスタット設定と切片のために必要な成分 。 （A）クライオスタットは-20〜-24°Cで10月エアゾールスプレー冷却、容易に入手可能な間に設定してください。小さ なブラシとの完全なクライオスタットのセットアップインサイド（B）は、操作し、カットsectiを平坦化しますスライドすることだけでなく、組織ブロックの処理のためのピンセットのためのアドオン。 （C）熱抽出（白矢印）で冷却される準備ができて凍結組織ブロック。 （D）を切断する準備ができて装着ヘッドに設定された組織ブロックは、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図正しく間違って保存され、筋肉の3代表組織。（A）不適切凍結または取り扱う（B）が適切に凍結させ、筋肉を処理していました。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
ニコンイメージングソフトウェアを使用してTA筋の断面積の図4.決意。CSAと分フェレット径の測定のための想像のソフトウェアを使用して、丸で囲まれている筋肉の部分の位相コントラスト画像のスクリーンショット。 これの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください図。
適切および不適切な準備のH＆E染色された筋肉の図5.代表的な画像。（A）が正しくセクションを処理しました。 （B）不適切に処理し、凍結損傷した筋肉部分。 くださいCLIこの図の拡大版を表示するには、こちらのCK。
図6.免疫染色に適した加湿室。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
適切に調製され、染色されたスライドの図7.サンプル·免疫組織化学スライド。スライドは、フィブロネクチン（緑）、DAPI（青）で染色されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
組織学および免疫組織化学は、様々な神経筋障害で病状の症状および進行を理解する上で重要なツールとして使用されています。古典的には、筋肉生検は、最初のホルムアルデヒドで固定し、その後パラフィンワックスで包埋しました。ホルムアルデヒド固定は、組織構造を保持し、室温で組織保存および輸送を可能にするが、それはまた、正確な免疫染色を達成するためのさらなるステップを必要とする酵素架橋するタンパク質を不活性化します。この問題は、凍結切片を用いて除去されるが、この方法は、最適な染色結果と正確な解釈14,15を得るためにユニークな技術的な課題を提示します。
第一に、自己分解と分解が身体から除去した後にすぐに開始するとサンプルは外科的切除直後に凍結することが必須です。組織はまた、サイズに応じて変化する時間の適切な量のために迅速かつ完全に凍結されなければなりません/組織の厚さ。これが正しく行われていない場合は、組織学的評価のために無駄な組織をレンダリング発生するダメージを凍結します。凍結後、組織を直ちにドライアイス上に保存されている必要があり、その後、切片までの超低温（-80℃）の冷凍庫に移しました。凍結融解はまた、組織構造が損傷しますので、組織はドライアイスの上にされずに冷凍庫から除去されるべきではないことに留意することが重要です。
組織学的分析を行う重要性を別のノートは、常に分析の中での均一性を確保するために、目的の組織の同じ部分を分析するために世話をすることです。これはmidbellyの分析を行うことにより、筋肉切片のために行うことができます。これは、最も厚いので、最大の断面積を有することになるであり、筋肉の一部です。もし実際にmidbellyを区画していることを確実にするために、次のセクションのCSAは、組織学的イメージングソフトウェアを使用して測定されるべきです。 Measurem断面積がプラトーに始めるまでエントを行うことを継続する必要があります。これが発生すると、半ば腹に達しています。唯一の組織のこの部分は、比較の間の均一性を確保するために、組織学的分析のために使用されるべきです。
2時間 - 切片が完了し、スライドを調製した後、それらは、1を室温で乾燥させるべきです。乾燥は、スライドにセクションの適切な接着性を可能にし、また、℃の冷凍庫-80への転送次結晶化し、過剰の水を防ぐことができます。これは、凍結融解サイクルを防止するための分析のためのスライドを選択する際に、スライドはまた、唯一のドライアイスで処理されるべきであることに留意することが重要です。スライドを染色するために選択されると、最適な結果が達成されるまで、汚れに含まれているプロトコルは、試験的に最初に従うべきです。免疫染色を行う際には、スライドを処置を通して乾燥させないことを確認することが重要です。スライドの乾燥は一過性の相互作用をもたらすことができますインキュベーション後の無傷のままにするのです。これらの相互作用は、非特異的な染色の洗浄および結果の間に除去することはできません。乾燥は、加湿雰囲気中でスライドを保持することによって回避することができます。小さなスライドボックス内に密封湿ったペーパータオルの上にパラフィルムやスライドで覆われたセクションでのインキュベーションを実行すると、手順の間の任意の時点で意志乾燥していないスライドを確保するのに十分です。
組織学は形態および病理学のさまざまな側面を可視化に不可欠なツールです。ちょっとしているが、それは組織の製造に組織学のために使用されるように細心の注意を取るために最も重要です。切除から、凍結切片および染色のために、組織を凍結損傷を回避し、可能な最も正確な画像が得られるようにして処理する必要があります。適切な保存せずに、染色は正確に生理を反映しませんので、誤解につながります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., office phone 1-800-248-0123 Alternative: Richard Allen Scientific |
| Microscope | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternative: Olympus |
| Image analysis software | Nikon Imaging Software Basic Research | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternatives: Image J, Metamorph |
| Isoflurane | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | 1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A. |
| OCT | 4583 | Sakura Inc. | Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternative source: Leica Microsystem |
| Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Disposable tissue mold | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Colorfrost plus slides | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Acetone | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Ethyl alcohol | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| 2-methyl butane | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
References
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