Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Konfokal Optik Görüntüleme ile Rose Bengal Fototromboz Published: June 23, 2015 doi: 10.3791/52794

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hemen Gül Bengal indüksiyon aşağıdaki vivo hücresel yanıtları tekniği tarif izin görselleştirme sağlam bir fare Fototromboz. Rose Bengal (4,5,6,7-tetrakloro-2 ', 4', 5 ', 7'-tetraiodofluorescein) hayvan modellerinde, iskemik inme (fare ve sıçan) ikna etmek için kullanılan ışığa boyadır. Bir 564 nm lazer ışığı ile inceltilmiş kafatası yoluyla kuyruk damarından ve daha sonra aydınlatma aracılığıyla RB bir bolus enjeksiyonunu takiben, trombüs fizyolojik inme 1 neden indüklenir. yöntem aslen 1977 yılında Rosenblum ve El-Sabban'ın tarafından tarif edilmiştir ve daha sonra orta 1980'ler 1,2 Watson tarafından uyarlanmıştır. Kısaca, Rose Bengal, daha sonra, doku faktörü, pıhtılaşma kaskadının bir başlatıcı aktive reaktif oksijen türlerinin üretimi üretir yeşil uyarma ışık (bizim örneğimizde 561 nm lazer) ile ışınlanır. koagülasyon kaskad indüksiyon les iskemik üretirKlinik inme 3 patolojik alakalı iyon.

İnme nöronlar, glia, endotel ve bağışıklık sistemi de dahil olmak üzere birçok farklı hücre tiplerinin etkileşimi nedeniyle karmaşık bir patofizyolojisi vardır. En iyi tekniği seçimi, belirli bir hücresel süreç birden hususlar gerektirir incelemek. Deneysel teknikler üç kategoriden birine genel olarak düşmek: in vitro, her biri avantaj ve dezavantajları ile in vivo ve siliko in vitro çalışmalar, doğal ortamdan hücrelerin çıkarılması birincil dezavantajı vardır ve bu nedenle sağlam bir görülen etkileri yeniden olmayabilir. hayvan yaşam. in vivo teknikler artmış öteleme öneme sahip hastalık durumlarının geliştirilmiş deneysel çoğaltma sağlamak. silico olarak genellikle bir hastalık veya hücresel sürecin bilgisayar modelleme anlamına gelir ve giderek sınava potansiyel ilaç etkileşimleri incelemek için kullanılan süreple, toplanan herhangi bir bilgi hala hücreleri veya canlı doku test edilmelidir.

laboratuar ortamında inme ideal bir model insan popülasyonunda görülen benzer patolojik özellikleri göstermelidir. Insan nüfusunun inme ortak fizyolojik özellikleri varken, deneyimli yaralanma türüne bağlı olarak pek çok farklılıklar vardır. Insan nüfusunun İnme çeşitli enfarktüs hacimleri yanı sıra her patoloji ile ilgili mekanizmalar farklılıklara neden olarak küçük veya büyük damar oklüzyonlarını, hemorajik lezyonlar ve arter veya kardiyo-embolisine arter-oluşur. Hayvan inme modelleri kullanan avantajı, insan inme özelliklerini taklit eden tekrarlanabilir infarktlar üretilmesidir. orta serebral arter tıkanıklığı (emboli veya endovasküler filament yöntemleri) hangi modeller uzak MCAO ve fototromboz modeli: En yaygın hayvan inme modelleri kullanarak arter tıkanıklığı sayılabilir. Avantajları BirHer modelin d dezavantajları (4 ve 5) başka bir yerde gözden geçirilmiştir. Küresel iskemik modelleri (MCAO), gerçekleştirmek için nispeten kolay odak inme modelleri daha insan inme daha az alakalı iken. Buna ek olarak, bu yöntemler, yeniden üretilebilir, beyin enfarktüsü lezyonlara neden olan oldukça değişkendir. deneyci MCAO modeller üzerinde açık bir avantaj sağlayarak, onların deneylerini kontrol olarak fototromboz modeli uzun gibi son derece tekrarlanabilir. Bununla birlikte, mikrovasküler hasara modeli asgari penumbra, hücre 6,7 kurtarılabilen olduğu düşünülmektedir alan görüntülemek için tarif edilmiştir. Buna ek olarak, vazojenik ödem ve sitotoksik ödem oluşumu, aynı zamanda görüntüleme alanında aşağıdaki ışınlama indüklenebilir. Bu kısıtlamalara rağmen tekniği inme 8, 9, 10, 11 aşağıdaki birçok fizyolojik süreçlere yeni bir bakış açısı sağlamıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Not: Tüm hayvan prosedürleri Teksas Sağlık Bilim Merkezi San Antonio Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve GELİYORUM kurallar ile uyumlu idi.

1. Kortikal Hazırlama anestezi

  1. Anestezi ikna etmek için oksijen ile karıştırılır% 2-3 isofluorane bir indüksiyon odasında fare yerleştirin. Fare kaynaklı olarak solunum hızı azalma gözlemleyin. Fare burun konisi taşınmaya hazır olup olmadığını belirlemek için fare pençe sıkıştırın. Not: Anestezi seviyesi herhangi in vivo hazırlanmasında önemli bir adımdır ve bakım küresel iskemi neden olacak bir düzeye ikna etmek değil alınmalıdır.
  2. Fare yeterince uyuşturulduktan sonra, cerrahi / görüntüleme platformu hayvan transferi ve burun konisi farenin burnunu yerleştirin ve bir anestezi durumunu korumak için 1-1.2% isofluorane uygulayın. Fare sıcaklık co yatarken olduğundan emin olunntrolled ısıtma yastığı kalan prosedürlerin boyunca vücut ısısını (37 ° C +/- 0.5 ° C) muhafaza etmek. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri üzerine veteriner merhem yerleştirin.
  3. Sistemiyle birlikte sağlanan kuyruk veya ayak klibi kullanarak bir pulse oksimetre sistemini kullanarak fare fizyolojisini izleyin. Solunum hızı 50-65 nefesler / dk arasında muhafaza olup olmadığını kontrol edin. Hayvanın uzun vadeli hayatta kalmasını sağlamak için 97-98% arasında muhafaza edilir bpm ve oksijen doygunluğu 300-450 arasında kalp hızı kalmasını kontrol ediniz.
  4. Fare yeterince uyuşturulduktan sonra, elektrikli makası kullanarak kafatası üzerinde saç tıraş etanol bez ardından kalan saç ve betadin temiz, kaldırın. Steril cerrahi ortamı sağlamak için üç kez bu prosedürü tekrarlayın.

2. Cerrahi Prosedür

  1. Tamamen temizlenmiş ve traşlı kafa derisi ile kranial fissu ortaya çıkarmak için fare kafa derisi 5 mm kesi yapmakres ve bregma bulmak için.
  2. Kafatası örten kalan fasya kaldırmak için steril bir pamuk aplikatör kullanın.
  3. Bregmadan stereotaksik koordinatlarını kullanarak parietal korteks örten kemik doku yapıştırıcı ile bir özel yapılmış paslanmaz çelik yüzük (Şekil 1) Tutkal: yanal -1 -3 mm ve: 2-4 mm. Not: tutkal, genellikle kemik üzerine halka yerleştirilmesinden sonra 2 dakika içinde ayarlar.
  4. Fareyi stabilize etmek ve görüntüleme sırasında hareket etmesini önlemek için bir stereotaksik tutucu (Şekil 2) halkayı yapıştırın.
  5. Cerrahi dereceli mikroskop altında yavaş yavaş bir hız kontrollü dremel benzeri aracını (Meisinger 3.9 mm matkap ucu) o delinmiş gibi alan seviyede tutmak için emin olun kullanarak kafatası içinde 1-2 mm'lik bölümü matkap. Zigzag deseni kullanarak bunu başarmak. Isı önlemek için inşa, düşüğe matkap hızını ayarlamak ve sık sık ara verin.
  6. Kranial kafatası görünüm tırmanmak olduğunda, inceltme devaminceltilmiş yüzey seviyede tutmak için aynı zig zag deseni kullanan bir neşter bıçak kullanarak kafatası kafatası ince tabakalar düzgün çıkarılmasını kolaylaştırmak için. Bir seferde kemik ince tabakalar kaldırmak için hafif bir baskı ile küçük doğrusal vuruş yapmak neşter bıçak ucunu kullanarak. Damar açıkça mikroskop aracılığıyla görülebilir oluncaya kadar bu devam edin.
  7. Deneyci ile deler veya inceltme işlemi sırasında kafatası kırarsan, altta yatan korteks olası hasar hayvan euthanize.
    Not: Fare kafatası yaklaşık 300 um kalınlığında ve iki ince, kompakt kemik tabakaları (dış ve bir iç tabakası) ve kompakt kemik iki tabaka arasına sıkıştırılmış süngersi kemik tabakası oluşur. dış yoğun kemik tabakası ve süngersi kemiğin en geriye kalan küçük kemik yaklaşık 50 um tabaka içinde elde edilen 5 mm delik alanı içinde çıkarılır (Şekil 2B). Visualizdamarsal tirme son bozulmamış inceltilmiş kafatası yaklaşık 50 mikron kalınlığında olmasını sağlayacaktır. Bu kalınlığa inceltilerek zaman kafatası hala nedenle mevcut.

3. Mikroskop Set-up

  1. Objektif İnverter sahip bir ters mikroskop sistemi (konvansiyonel, konfokal veya iki foton sistemleri) kullanın. Not: Bu standart dik mikroskop kullanılması da mümkündür. sınırlayıcı faktör evre ve hedefleri arasındaki boşluk olacak. Sahneye Değişiklikler bu kurulum gerçekleştirmek için gerekli olabilir.
  2. Kenara mikroskop tabanını bulunan bir ölçüye sahneye cerrahi / görüntüleme platformu sabitleyin. Not: Platform hedefi altında, cerrahi / görüntüleme platformu dikey hareketini sağlamak için bir laboratuvar jack kullanılarak yapılır. laboratuar jakı dört silindirik kutup yapıştırılmış bir plakaya monte edilir. (Bakınız Şekil 2).
  3. 20x içeren objektif İnverter yerleştirinkranial pencere üzerinde objektif. Mikroskop okülerlerinde bakarak kranial pencere bulmak ve görüntüleme alanındaki hedefi konumlandırmak için harici bir ışık kaynağı kullanın. Not: Görüntüleme alanı damarsal varlığı ile ifade edilecektir.
  4. Su bazlı hedefleri için, yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) kullanan orta vadesi potansiyeli (; 30 mM KCI; 130 mM NaCl 200 mM NaHCO 3,,, 30 mM HEPES ve 100 mM glukoz KH 2 PO 4 12 mM) görüntüleme sırasında kafatası boşluğuna kaçağı (Şekil 3).

4. Rose Bengal Boya hazırlanması, Yönetim ve İnme İndüksiyon

  1. Yapay beyin omurilik sıvısı (CSF), Rose Bengal, bir taze 20 mg / ml solüsyon hazırlamak; filtre ve uygulamadan önce sterilize edin. Yeniden ya da karışık edildikten sonra Gül Bengal tutmayın. Her bir deney için taze bir çözüm olun.
  2. Rose Bengal s ise bir 0.1 mi kuyruk damarı enjeksiyonuBir 561 nm lazer ile kranial pencere konserve çözümün yeterli enjeksiyonu sağlamak. Not: Rose Bengal, beyin damar sisteminde, enjeksiyondan sonra 5 saniye içinde görselleştirilecektir. Tüm gemi Gül Bengal ile doldurulmalıdır.
  3. Rose Bengal boya yeterli enjeksiyonunu takiben, belirli bir lezyon hacminin yeniden üretilebilirlik sağlamak için damar çapı (40-80 um) göre tromboz için uygun bir kap seçin. Kan akış yönü bakarak arterler ve venler arasında ayrım: arterler küçük çaplı damarları büyük çaplı hareket edecek, damarlar büyük çaplı damarları daha küçük hareket. Rose Bengal enjekte edildiğinde bu, kolayca görselleştirme ile gerçekleştirilir.
  4. Aşağıdaki gibi mikroskop ayarını değiştirin:
    1. Bekleme süresini artırın. Not: Bu kullanılmaktadır mikroskop sistemine bağlı olarak değişir.
    2. % 100 lazer gücünü artırın.
    3. Kullanarak 1 kare / sn zaman dizisi görüntüleri toplayınMaksimum tarama hızı.
  5. Istikrarlı bir pıhtı damar içinde oluşana dek fareyi tarayın. Not: Bu genellikle sürekli tarama 5 dakika içinde ulaşılır (Bakınız Şekil 4).
  6. Gül Bengal kullanarak pıhtı oluşumu indüksiyon sonrasında, geri mikroskop Görüntüleme alanından fareyi çıkarın. Dikkatle kranial kafatası paslanmaz çelik halkasını çıkartın. Herhangi bir kanama kranial pencereyi inceleyin. Kanama oluşursa, deney sonlandırın.
  7. Kafatası üzerinde insizyon kapatmak için 6.0 monofilament sütür kullanın. Enfeksiyonu önlemek için dikiş hattı boyunca antibiyotik merhem yerleştirin. Buprenex (0.05 mg / kg), ağrı yönetimi için üç gün boyunca deri altından her 12 saatte enjekte edilir.
  8. Tamamen uyanık ve serbestçe hareket kadar anestezi çıkarıldıktan sonra bir kurtarma odasına fare dönün.
  9. Daha sonra daha fazla araştırma için temiz bir kafes fare dönün.

5. Daha sonraki Günlerinde Boyuna Görüntüleme

  1. Sonraki gün sonrası Fototromboz boyuna görüntüleme gerçekleştirmek için aşağıdaki yöntemleri kullanır.
    1. Yöntemlerin Bölüm 1'de açıklandığı gibi fare anestezisi.
    2. Yeterli anestezi sırasında önceden delinmiş görüntüleme alanını örten cilt yeniden açmak için herhangi bir kalıntı sütür kaldırarak saç derisini yeniden açın.
    3. Kafatası örten kalan fasya kaldırmak için steril bir pamuk aplikatör kullanın.
    4. Önceki görüntüleme alanını örten kemik doku yapıştırıcı ile bir özel yapılmış paslanmaz çelik yüzük (Şekil 1) Tutkal.
    5. Fareyi stabilize etmek ve görüntüleme sırasında hareket etmesini önlemek için bir stereotaksik tutucu (Şekil 2) halkayı yapıştırın.
    6. Daha önce inceltilmiş kafatası altında yatan damar bulun. Daha önce neden pıhtı varlığını doğrulamak için, FITC-dekstran kuyruk damarı enjeksiyonu kullanın.
    7. In kapatmak için 6.0 monofilament sütür kullanınKafatasının üzerinde eksizyondur. Enfeksiyonu önlemek için dikiş hattı boyunca antibiyotik merhem yerleştirin. Buprenex (0.05 mg / kg), ağrı yönetimi için üç gün boyunca deri altından her 12 saat enjekte edilir.
    8. Tamamen uyanık ve serbestçe hareket kadar anestezi çıkarıldıktan sonra bir kurtarma odasına fare dönün.

İnme indüksiyon 6. Doğrulama (Post-mortem)

  1. Bir çalışmanın bitiminde, Şekil 5'te gösterildiği gibi 2,3,5-trifeniltetrazolyum klorür (TTC) boyama kullanarak strok hacmini doğrulayın. Tam bir yöntem 12'de bulunabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu yöntemin amacı, bir 561 nm lazer ışığı ile inceltilerek kafatası kuyruk damarından ve daha sonra aydınlatma aracılığıyla RB bir bolus enjeksiyonu takiben hayvan modellerinde, bir iskemik inme (fare ve sıçan) neden oldu. Şekil 4 'de resim olarak 0, 1, 1.5 ve 2 dk'da alanının ışınlanması sonra tek bir tekne içinde pıhtı oluşumunun ilerlemesini göstermektedir. Pıhtı oluşumu öncesinde, tüm geminin Rose Bengal serbest akan nedeniyle beyazdır. Kabın ışınlama indüksiyonu şu var kabın kısımlar halinde açık bir koyulaşma ve pıhtı oluşumu (kare 1 ile 1.5 dakika) indüksiyonunu gösterir. Tam tıkanıklığı sonrasında geminin içinde pıhtı (siyah alan) önceki Rose Bengal boya (beyaz alan) belirgin bir birikimi var. 2 dakikalık çerçeve arterin tam tıkalı göstermektedir.

Iskemik inme TTC boyanma varlığı kullanılabilir doğrulamak için. TTC bir eşmmonly sağlıklı dokunun kırmızı formazan TTC ürünlerin oluşumu ile serebral enfarktüs tespiti için leke kullanılır. formazan üretimi (beyaz doku) eksikliği infarkt alanını belirtir. Şekil 5'te kutuları ile gösterilen alanlar bir kap çapı yaklaşık 80mm içinde üretilen bir pıhtı aşağıdaki iki ayrı hayvanlardan 1 ile 5 gün elde edilen tipik lezyon boyutları göstermektedir. Görüntü analizi, düz yataklı tarayıcı ve ImageJ yazılım kullanımı ile gerçekleştirilir. Ilgi alanları her bir beyin için strok hacmi alanı ölçmek için ImageJ olan çizilebilir.

Şekil 1
Şekil 1:. Paslanmaz Çelik Yüzük Üç Defa (üst, yan ve alt Görüntülendi) stereotaksik sahibine bunu tutturmak için fare kafatasına uygulanan paslanmaz çelik halka sahibinin gösterilmektedir.


Şekil 2:. RB Fototromboz için Mikroskop görüntüleme platformu Kur / cerrahi görüntüleme platformu roket ucu konisi ile anestezi tüp ve sırasında hayvanın hareketini azaltmak için hayvanın kafatasına yapıştırılmıştır paslanmaz çelik halka için bir stereotaksik tutucu bir tutucu içerir görüntüleme. platformu üzerine yerleştirilmiş ve mikroskop objektif altında fare konumlandırılması için dikey hareketine izin vermek üzere laboratuar jakı sabitlenmiştir. laboratuar jakı daha sonra yatay hareketi sağlayan bir mikroskop aşamasında, takılır. mikroskop kademesi üzerine yerleştirilmiştir ve dört adet silindirik kutup sabitlenmektedir.

Şekil 3,
Şekil 3: nesnel inv altında görüntüleme / cerrahi bir platform tasarımı ve yönlendirme resmierter. (A) soldaki paneli bir anestezi fare (anestezi burun konisi resmini çekmek için kısaca kaldırıldı) konumlandırma temsili bir görüntüsünü gösterir. Görüntüleme prosedürleri boyunca eserler nefes katkısını azaltmak için fare kafatası takmak için özel bir çelik halka kullanımına dikkat edin. sağdaki görüntü bir mikroskop altında kortikal pencere görüntüsünü gösterir. Dura mater ve tam kafatası kalınlığına göre inceltilmiş bölgenin kalınlığına göre kafatasının katmanları gösteren koronal görünüm ince kafatası hazırlanması (B) taslağı.

Şekil 4,
Şekil 4: Rose Bengal Pıhtı oluşumu resmi kuyruk vei yoluyla enjekte edildi Rose Bengal boya içeren tek bir geminin Temsilcisi görüntüler.fare n. Fotoğraflar, 0, 1, 1.5 ve 2 dk'da alanının irradyasyonu takiben kap içindeki pıhtı oluşumunun ilerlemesini göstermektedir. Arterin tam tıkanıklığı gösteren 2 dk çerçevesindeki pıhtı (siyah) önceki Rose Bengal boya (beyaz) birikimini unutmayın.

Şekil 5,
Şekil 5: RB bağlı lezyonun 2,3,5-trifeniltetrazolyum klorür (TTC) görüntü Örnek görüntüler Gün 1 ve 5 sonrası fototromboz indüksiyonu gösterilmektedir.. farenin kurban edilmiş ve beyinleri hızlı bir şekilde, standart yöntemlere uygun olarak çıkarılır ve 1 mm koronal kesitler halinde dilimlenir ve TTC ile boyandı. TTC sağlıklı dokunun kırmızı formazan TTC ürünlerin oluşumu ile serebral enfarktüs saptanması için yaygın olarak kullanılan bir leke. formazan üretimi (beyaz doku) eksikliği infarkt alanını belirtir.kutular ile gösterilen alanlar çapı yaklaşık 80 mikron bir gemi içinde üretilen bir pıhtı takiben elde edilen tipik lezyon boyutları göstermektedir.

Şekil 6,
Şekil 6: Rose Bengal Fototrombotik prosedürün şematik gösterimi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

İnsan uygulamaya hayvandan deneysel inme patofizyoloji çevirmek için yetenek yetersizliği ile rahatsız olmuştur. Ancak, bu tür fototromboz modeli olarak hayvan modellerinde, kullanımı gelişmiş inme patofizyolojisi anlayış ve inme sonrası nöro sağlamak için yeni tedavi yaklaşımları keşif için izin verir. Küçük kortikal vuruş ve Fototrombotik modeli tarafından üretilen microinfarctions yüksek oranda görüldüğü ve Amerika Birleşik Devletleri nüfusunun (yaklaşık 11 milyon kişi) her yıl 16 yaklaşık yüzde 4 etkileyen subklinik ya da "sessiz" inme 13-15, klinik olarak alakalı. Sessiz inme orta serebral arter (MCA) oklüzyonu veya geçici iskemik atak (TIA), 17 görüldüğü gibi felç, duyu kaybı ve zorluk olarak daha geniş bir inme mevcut klasik inme belirtileri, böyle bir konuşma yok. Ayrıca, sessiz inme laküner inme, farklı olanderin beyin yapılarında veya beyin sapı içinde tek delici arterin tıkanması nedeniyle ve aynı zamanda klinik olarak motor, duyusal veya karışık açıkları 18 tezahür edilir. Subklinik ya da "sessiz" inmeli hastalar genellikle herhangi dışa belirtileri gösterir ve hatta felç geçirdi var genellikle habersiz değildir. Hafıza problemleri, karar verme ve davranış değişiklikleri ile sergilenen bilişsel işlev subklinik azalma Sessiz inme sonuçları. Zaman içinde, birden fazla sessiz vuruş vasküler ya da multi-infarkt demans olarak bilinen hafıza kaybı klinik olarak önemli işaretler yol açar. Ancak, sessiz inme beyin hasarı nörogörüntüleme kullanılarak tespit ve gelecek 19 yılında TIA riski ve önemli inme bir hastayı yerleştirir edilebilir.

fototromboz modeli Kombine ışığa renklendirici madde, Rose Bengal (RB) kullanarak bir hareketsiz, anestezi uygulanmış farelerde tromboz bir in vivo model tekrarlanabilir üretimine olanak sağlarkonfokal mikroskobu ile ulus. In vivo fototromboz modelinin pek çok avantajı vardır. Bu yöntemin bir avantajı, stereotaksik koordinatlar kullanılarak inme konumunu önceden tanımlamak için yeteneği; tek hayvanlar arasında belirli hücre popülasyonlarının çalışma izin. Ayrıca, lezyon büyüklüğü ve hacmi tekrarlanabilirliği de lazer ışığının şiddeti değişen ve 20 ışınlanmış olan damar boyutu için kontrol ederek bu yöntemi kullanan kontrol edilir. Bu yöntem aynı zamanda detaylı peri-infarkt nörotransmisyonun değişikliklerin çalışma ve kontralateral korteks 4 tekabül sağlar. Tek bir sessiz kontur az açıkları neden olsa da, bu modelde tekrarlanabilirliği vasküler demans gibi çeşitli beyin bozuklukları taklit etmek için kullanılabilecek özel alanlarda çok sessiz vuruş indükleme yeteneği sağlar. Birden fazla sessiz vuruşları ve klinik olarak belirgin açıkları arasında bir eşik gelişmesi spesifik tespit edilebilirfic Bu yöntemin kullanımı ile beyin bölgeleri de. Son olarak, model, akut hem de kronik etkileri dikkat edilmesi için izin aynı hayvanda uzunlamasına çalışmalar sağlar.

Fototromboz modeli kullanılarak bazı dezavantajları, ancak vardır. Tek dezavantajı fokal inme 4 diğer modelleri ile kıyaslandığında küçük bir iskemik penumbra sahip olarak belirtildiği bir lezyonun üretimini kapsamaktadır. İkinci olarak, vazojenik ve sitotoksik ödem oluşumu nedeniyle daha yakından fokal inme 4'ten travmatik beyin yaralanması benzer fototromboz indüksiyonu sırasında meydana gelebilecek zararlardan mümkündür.

Fototromboz modeli kullanıldığında deney boyunca izlenmelidir bir dizi faktör vardır. Bu hayvanın fizyolojik durumu tüm görüntüleme prosedürleri boyunca izlenmesi önemlidir. İyi Anestezi düzeyi, fizyolojik st etkileyebilir bilinmektediranestezi üzerinde neden olan hayvanın, ATUS hayvana kalp hızı ve oksijen sunumunu azalmıştır. Bu global iskemiye sonuçlanan beyne giden oksijeni kullanılabilirliğini azaltacağını gibi bu önemli bir husustur. Bu nedenle, bir sistemin kullanılması eşzamanlı non-invaziv kayıt için izin verecektir hayvanın fizyolojik durumunu izlemek için: arteriyel oksijen satürasyonu (SpO2); Kalp Atışı; Nefes Hızı; Darbe Distansiyon (yerel kan akımı ve sinyal kalitesi göstergesi); Nefes şişme (intraplueral basınç taşıyıcı); Fare ve sıçanlarda ve çekirdek sıcaklığı. Klinik stoke yardımlara deneysel sonuçları çeviri beklenmedik boşa azaltmak için herhangi bir hayvan modeli ile çalışırken anestezi kontrol etmek için giderek önem kazanmaktadır boşa. seçim, süresi ve anestezi derinliği deneysel inme hayvan modelinde ciddi bir etkisi olabilir. Çalışmalar anestezik ajanlar infarkt si azaltabileceğini göstermiştirze ve hatta serebral iskemi 21-23,24 bazı koruma sağlayabilir. Buna ek olarak, reaktif oksijen türlerinin üretimi değişiklikleri de halotan ve propofol 25 kullanımı ile kıyaslandığında çalışmada gösterilmiştir. Felç ile ilişkili nöronal ölüm birincil hipotez bir reaktif oksijen türlerinin üretimi olduğu gibi bu Karıştırma önemlidir.

Bir inme beyin yanıtı incelemek için in vivo mikroskopi kullanılarak biri komplikasyon ulaşılabilir görüntüleme derinliği sınırlandırılmasıdır. Bir iki-fotonlu mikroskop kullanılarak um 400-500 arasındaki bu derinliği artırabilir olsa konfokal mikroskopi kullanılarak laboratuvarımızda olarak elde edilebilir görüntüleme derinliği, 100-200 um aralığındadır. Bu boşa artan çalışma mesafeleri ile ve boyutunu azaltarak hedeflerinin geliştirilmesi ile azaltılmaktadır. Örneğin, degrade refraktif indeks (GRIN) mikro lensler mikroendoskopların zekâ vardır35-1,000 um arasında saat çapları ve bugüne kadar en küçük bulunmaktadır. Prob Bu tip invaziv zarar ve düşük sayısal deliklere sahip olmadan doku içine eklenemez. Düşük olması nedeniyle NA çözünürlüklü geleneksel optik mikroskop hedefleri 26 oranla düşüktür.

Özet olarak, Rose Bengal fototromboz model, küçük boyutlu bir enfarktüs neden olur ve iyi tanımlanmış bir hücre popülasyonunda akut ve kronik aşamaları hem bir infarkt hücresel cevap üzerinde çalışma yapılması için yararlıdır. Bu model, fokal iskemi, aşağıdaki MCAO görülen temel hücresel özellikleri gösterir ve bu nedenle nörorejeneratif / nöro-koruyucu terapilerin değerlendirilmesinde yararlıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Rose Bengal Sigma 330000
Isoflurane Anesthetic MWI Veterinary Supply 088-076
Vetbond 1469SB 1469SB
aCSF  126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4).
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Dissecting Scissors Bioindustrial Products 500-410
Operating scissors 14 cm Bioindustrial Products 12-055
Forceps Dumont High Tech #5 style, straight Bioindustrial Products TWZ-301.22
LabJack 132X80 Optosigma Co 123-6670
Platform for Labjack 8X 8 Optosigma Co 145-1110
Ear bar holder from stereotaxic setup Stoelting/Cyborg 51654
Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine DRE, Inc. 15001
Tech IV Isoflurane vaporizer DRE, Inc. 34001
F Air Canister DRE, Inc 80120
Bain circuit breathing tube DRE, Inc 86111B
Rodent adapter for bain tube DRE, Inc 891000
O2 regulator for oxygen tanks DRE, Inc CE001E
Rodent induction chamber DRE, Inc 15004C
Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle Suture Express 1639G
Objective inverter Optical Adapter LSM technologies
Foredom drill Dual voltage 110/120 Foredom 134.53
Meisinger 3.9 mm drill bit Meisinger (Ref#310 104 001 001 009)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17, 497-504 (1985).
  2. Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circulation Research. 40, 320-328 (1977).
  3. Owens, A. P. 3rd, Mackman, N. Sources of tissue factor that contribute to thrombosis after rupture of an atherosclerotic plaque. Thrombosis Research. 129, Suppl 2. S30-S33 (2012).
  4. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2, 396-409 (2005).
  5. Manual of stroke models in rats. 332 CRC Press. (2009).
  6. Herz, R. C., Kasbergen, C. M., Hillen, B., Versteeg, D. H., de Wildt, D. J. Rat middle cerebral artery occlusion by an intraluminal thread compromises collateral blood flow. Brain Research. 791, 223-228 (1998).
  7. Brint, S., Jacewicz, M., Kiessling, M., Tanabe, J., Pulsinelli, W. Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism : Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 8, 474-485 (1988).
  8. Zheng, W., et al. Purinergic receptor stimulation reduces cytotoxic edema and brain infarcts in mouse induced by photothrombosis by energizing glial mitochondria. PloS One. 5, e14401 (2010).
  9. Zheng, D. M., Wewer, J., Lechleiter, J. P. 2Y. 1R. -initiated IP3R-dependent stimulation of astrocyte mitochondrial metabolism reduces and partially reverses ischemic neuronal damage in mouse. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 600-611 (2013).
  10. Witte, O. W., Stoll, G. Delayed and remote effects of focal cortical infarctions: secondary damage and reactive plasticity. Advances in Neurology. 73, 207-227 (1997).
  11. Hagemann, G., Redecker, C., Neumann-Haefelin, T., Freund, H. J., Witte, O. W. Increased long-term potentiation in the surround of experimentally induced focal cortical infarction. Annals of Neurology. 44, 255-258 (1998).
  12. Kramer, M., et al. TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses. Journal of Neuroscience Methods. 187, 84-89 (2010).
  13. Blinder, P., Shih, A. Y., Rafie, C., Kleinfeld, D. Topological basis for the robust distribution of blood to rodent neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 12670-12675 (2010).
  14. Nishimura, N., Rosidi, N. L., Iadecola, C., Schaffer, C. B. Limitations of collateral flow after occlusion of a single cortical penetrating arteriole. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 30, 1914-1927 (2010).
  15. Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 365 (2007).
  16. Blum, S., et al. Memory after silent stroke: Hippocampus and infarcts both matter. Neurology. 78, 38-46 (2012).
  17. Heinsius, T., Bogousslavsky, J., Van Melle, G. Large infarcts in the middle cerebral artery territory Etiology and outcome patterns. Neurology. 50, 341-350 (1998).
  18. Wardlaw, J. What causes lacunar stroke. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 76, 617-619 (2005).
  19. Inoue, Y., et al. Ischemic stroke under anticoagulant therapy]. Rinsho shinkeigaku. Clinical Neurology. 50, 455-460 (2010).
  20. Tiannan Wang, W. C., Xie, Y., Zhang, W., Ding, S. Controlling the Volume of the Focal Cerebral Ischemic Lesion through Photothrombosis. American Journal of Biomedical Sciences. 2, 33-42 (2009).
  21. Head, B. P., Patel, P. Anesthetics and brain protection. Current Opinion in Anaesthesiology. 20, 395-399 (2007).
  22. Kirsch, J. R., Traystman, R. J., Hurn, P. D. Anesthetics and cerebroprotection: experimental aspects. International Anesthesiology Clinics. 34, 73-93 (1996).
  23. Koerner, I. P., Brambrink, A. M. Brain protection by anesthetic agents. Current Opinion in Anaesthesiology. 19, 481-486 (2006).
  24. Gelb, A. W., Bayona, N. A., Wilson, J. X., Cechetto, D. F. Propofol anesthesia compared to awake reduces infarct size in rats. Anesthesiology. 96, 1183-1190 (2002).
  25. Bhardwaj, A., Castro, I. A., Alkayed, N. J., Hurn, P. D., Kirsch, J. R. Anesthetic choice of halothane versus propofol: impact on experimental perioperative stroke. Stroke; A Journal Of Cerebral Circulation. 32, 1920-1925 (2001).
  26. Barretto, R. P., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses. Nature Methods. 6, 511-512 (2009).
Konfokal Optik Görüntüleme ile Rose Bengal Fototromboz<em&gt; In Vivo</em&gt;: Tek Gemi İnme Bir Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Talley Watts, L., Zheng, W., Garling, R. J., Frohlich, V. C., Lechleiter, J. D. Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke. J. Vis. Exp. (100), e52794, doi:10.3791/52794 (2015).More

Talley Watts, L., Zheng, W., Garling, R. J., Frohlich, V. C., Lechleiter, J. D. Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke. J. Vis. Exp. (100), e52794, doi:10.3791/52794 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter