Introduction
De techniek beschreven vergunningen visualisatie van in vivo cellulaire reacties onmiddellijk na inductie van Rose Bengal photothrombosis in een intacte muis. Rose Bengal (4,5,6,7-tetrachloor-2 ', 4', 5 ', 7'-tetraiodofluorescein) een fotogevoelige gebruikt om ischemische beroerte in diermodellen (muis en rat) induceren. Na een bolus injectie van RB door de staartader en de daaropvolgende verlichting door middel van een uitgedund schedel met een 564 nm laserlicht, is een trombus inductiestroom het veroorzaken van een fysiologische slag 1. De methode werd oorspronkelijk beschreven door Rosenblum en El-Sabban in 1977, en werd later aangepast door Watson in het midden van de jaren 1980 1,2. In het kort, wordt Rose Bengal bestraald met groene excitatielicht (561 nm laser in ons geval), die de productie van reactieve zuurstof species, die vervolgens activeert weefselfactor, een initiator van de stollingscascade gegenereerd. De inductie van de stollingscascade produceert een ischemisch lesion dat pathologisch relevant klinische beroerte 3.
Beroerte heeft een complexe pathofysiologie gevolg van de invloed van vele verschillende celtypen waaronder neuronen, glia, endotheel en het immuunsysteem. Het kiezen van de beste techniek te bestuderen van een bepaald cellulair proces vereist meerdere overwegingen. Experimentele technieken vallen ruwweg in drie categorieën: in vitro, in vivo en in silico met elk voor- en nadelen In vitro studies hebben de primaire nadeel van het verwijderen van cellen uit hun natuurlijke omgeving en daarom mag geen effecten gezien in een intacte reproduceren. levend dier. In vivo technieken zorgen voor een verbeterde experimentele replicatie van ziektebeelden met een verhoogde translatie betekenis. In silico algemeen verwijst naar computermodellen van een ziekte of een cellulair proces, en terwijl in toenemende mate gebruikt om mogelijke interacties tussen geneesmiddelen voor examen studerenple, alle informatie die verkregen moet nog getest worden in levende cellen of weefsels.
Het ideale model van een beroerte in het laboratorium instelling moet aantonen vergelijkbaar pathologische kenmerken met die in de menselijke populatie. Hoewel er gemeenschappelijke fysiologische kenmerken van een beroerte in de humane populatie, zijn er ook veel verschillen afhankelijk van het type schade voor. Stroke in de humane populatie voorkomt als klein of groot vat occlusies, hemorrhagische laesies en slagader te slagader of cardio-embolieën die resulteren in verschillende infarct volumes en de verschillen in mechanismen die verantwoordelijk elke pathologie. Het voordeel van het gebruik van dierlijke tweetaktmodellen is het genereren van reproduceerbare infarcten die karakteristieken van menselijke beroerte nabootsen. De meest voorkomende dier beroerte modellen omvatten slagader occlusie met: midden cerebrale slagader occlusie (embolische of endovasculaire filament methoden), die modellen distale MCAO en de photothrombosis model. De voordelen van eend nadelen van elk model zijn elders beoordeeld (zie 4 en 5). Global ischemische modellen (MCAO), terwijl het relatief eenvoudig uit te voeren zijn minder relevant voor de menselijke beroerte dan zijn brandpunt takt modellen. Bovendien zijn deze werkwijzen zeer variabel in induceren reproduceerbare herseninfarct laesies. Het photothrombosis model is zeer reproduceerbaar zolang de experimentator regelt hun experimenten goed, een duidelijk voordeel ten opzichte MCAO modellen. Vanwege microvasculatuur insult model is beschreven een minimale ischemische penumbra, het gebied waar de cellen worden verondersteld redden 6,7 te geven. Bovendien kunnen vasogeen oedeem en cytotoxische oedeemvorming worden geïnduceerd na bestraling van het beeldgebied. Ondanks deze beperkingen techniek nieuwe inzichten voorziet in vele fysiologische processen na beroerte 8, 9, 10, 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Texas Health Science Center in San Antonio en waren in overeenstemming met de richtlijnen KOMEN.
1. verlamming voor Cortical Voorbereiding
- Plaats de muis in een inductie kamer met 2-3% isofluorane gemengd met zuurstof om anesthesie. Let op de ademhaling daling als de muis wordt geïnduceerd. Knijp de poot van de muis te bepalen of de muis is klaar om te verhuizen naar de neuskegel. Opmerking: Anesthesie-niveau is een cruciale stap in een in vivo voorbereiding en de zorg moeten worden genomen een niveau dat globale ischemie zal leiden tot niet te induceren.
- Zodra de muis voldoende verdoofd Breng het dier de operatie / imaging platform en plaats neus van de muis in de neuskegel en toepassing 1-1,2% isofluorane een verdoofde toestand te houden. Zorg ervoor dat de muis is liggend op een temperatuur controlled verwarmingskussen de lichaamstemperatuur (37 ° C +/- 0,5 ° C) gedurende de gehele verdere procedures. Plaats dierenarts zalf over de ogen tot droog voorkomen terwijl onder narcose.
- Bewaken van de fysiologie van de muis met een pulsoximetrie systeem met de staart of voet clip die bij het systeem. Controleer of de ademhaling wordt gehandhaafd tussen 50-65 ademhalingen / min. Controleer of de hartslag blijft tussen 300-450 bpm en zuurstofverzadiging wordt gehandhaafd tussen de 97-98% op de lange-termijn overleving van het dier te waarborgen.
- Wanneer de muis voldoende is verdoofd, scheren de haren over de schedel met elektrische tondeuse, verwijder resterende haren en schoon met betadine, gevolgd door een ethanol wattenstaafje. Herhaal deze procedure tot driemaal een steriele chirurgische milieu.
2. Chirurgische Procedure
- Met de hoofdhuid volledig gereinigd en geschoren, maak een 5 mm incisie in de hoofdhuid van de muis om de schedel fissu onthullenres en bregma lokaliseren.
- Gebruik een steriele katoenen applicator om eventuele resterende fascia bovenop de schedel te verwijderen.
- Lijm een maat roestvrij stalen ring (figuur 1) met weefsellijm het bot ligt over de pariëtale cortex met de stereotactische coördinaten van Bregma: -1 tot -3 mm en zijdelings: 2-4 mm. Opmerking: De lijm bevat meestal binnen 2 minuten na de plaatsing van de ring op het bot.
- Bevestig de ring een stereotaxische houder (figuur 2) aan de muis te stabiliseren en om beweging te voorkomen tijdens de beeldvorming.
- Onder een chirurgische kwaliteit dissectiemicroscoop langzaam boren een sectie 1-2 mm in de schedel met een snelheid gecontroleerd dremel-achtige tool (Meisinger 3.9 mm boor) en zorg ervoor dat het gebied niveau te houden als het wordt geboord. Dit te bereiken met behulp van een zig-zag patroon. Om te voorkomen dat de warmte opbouwen, stelt de boor snelheid te laag en neem regelmatig pauze.
- Als de schedel schedel wordt shinny in verschijning, blijven het dunnervan de schedel met een scalpel die dezelfde zigzagpatroon op het dun maaiveld houden vlotte verwijdering van dunne lagen craniale schedel vergemakkelijken. De tip van de scalpel te kleine lineaire slagen met lichte druk om dunne lagen been per keer verwijderen. Herhaal dit totdat het vaatstelsel is duidelijk zichtbaar door de dissectiemicroscoop.
- Wanneer de experimentator prikt met of breken schedel tijdens de verdunningswerkwijze, inslapen het dier wegens waarschijnlijk schade aan de onderliggende cortex.
Opmerking: De muis schedel is ongeveer 300 urn dik en bestaat uit twee dunne lagen compacta (een externe en een interne laag) en een laag sponsachtig bot ingeklemd tussen twee lagen compacta. De deklaag van compacta en het merendeel van het sponsachtige bot verwijderd in de 5 mm boring zone resulteert in een ongeveer 50 pm laag van compacta resterende (zie figuur 2B). Visualizatie van de vasculatuur zal ervoor zorgen dat de uiteindelijke intact verdunde schedel is ongeveer 50 urn dik. De schedel is dus nog steeds aanwezig is wanneer verdund tot deze dikte.
3. Microscoop Set-up
- Gebruik een omgekeerde microscoop systeem (conventioneel, confocale of twee-foton systemen) die een doel omvormer heeft. Opmerking: Het is ook mogelijk een standaard microscoop rechtop gebruiken. De beperkende factor is de ruimte tussen de trap en de doelstellingen. Wijzigingen aan het podium kan nodig zijn om deze opstelling te verwezenlijken.
- Zet de chirurgische / imaging platform een maat fase die zich terzijde de onderkant van de microscoop. Opmerking: Het platform wordt gedaan met een klinisch aansluiting om verticale beweging van de chirurgische / imaging platform van de doelstelling mogelijk. Het laboratorium aansluiting is gemonteerd op een plaat bevestigd aan vier cilindrische palen. (Zie Figuur 2).
- Plaats de doelstelling omvormer met een 20Xobjectieve over de schedel raam. Gebruik een externe lichtbron op de schedel raam te vinden door te kijken door de oculairs van de microscoop en plaats de doelstelling in het beeldgebied. Opmerking: Het opnamegebied wordt aangeduid door de aanwezigheid van de vasculatuur.
- Voor watergedragen doelstellingen nog kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) (130 mM NaCl, 30 mM KCI, 12 mM KH 2PO 4; 200 mM NaHCO 3; 30 mM HEPES en 100 mM glucose) als medium vanwege mogelijke lekkage in de schedelholte tijdens beeldvorming (figuur 3).
4. Rose Bengal Dye Voorbereiding, Administratie en Inductie van Stroke
- Bereid een frisse 20 mg / ml oplossing van Rose Bengal in kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF); filteren en steriliseren vóór toediening. Niet hergebruiken of bewaar de Bengaals als het eenmaal is gemengd. Maak een verse oplossing voor elk experiment.
- Geef een 0,1 ml staartader injectie van Rose Bengal, terwijl scanning de craniale raam met een 561 nm laser voldoende injectie van de oplossing te waarborgen. Opmerking: Rose Bengal wordt gevisualiseerd binnen 5 seconden na injectie in het vaatstelsel van de hersenen. Het gehele schip moet worden gevuld met Rose Bengal.
- Na een adequate injectie van kleurstof Rose Bengal kiezen een geschikt schip voor trombose op basis van diameter vat (40-80 micrometer) om de reproduceerbaarheid van een bepaalde laesie volume zorgen. Onderscheid tussen slagaders en aders door te kijken naar de richting van de bloedstroom: slagaders zal verhuizen van grotere diameter tot schepen kleinere diameter, aders verplaatsen van kleinere schepen tot grotere diameter. Dit is eenvoudig te realiseren door visualisatie keer Rose Bengal wordt geïnjecteerd.
- Wijzig de microscoop instelling als volgt:
- Verhoog de verblijftijd. Opmerking: Dit is afhankelijk van de microscoop systeem wordt gebruikt.
- Verhoog het laservermogen tot 100%.
- Verzamel tijdsequentie beelden op 1 beeld / sec met behulp van demaximale scansnelheid.
- Scan de muis tot een stabiele stolsel gevormd in het vat. Opmerking: Dit wordt typisch bereikt binnen 5 min continu scannen (zie figuur 4).
- Na de inductie van stolselvorming met Rose Bengal, verwijdert u de muis van de beeldvorming gebied terug naar de dissectiemicroscoop. Verwijder de roestvrij stalen ring voorzichtig uit de schedel schedel. Onderzoek de craniale venster voor bloeden. Als bloeden optreedt, beëindigen het experiment.
- Gebruik 6.0 monofilament hechtdraad om de incisie te sluiten over de schedel. Plaats antibiotische zalf langs de hechtdraad lijn om infectie te voorkomen. Injecteer Buprenex (0,05 mg / kg) subcutaan om de 12 uur gedurende drie dagen voor pijnbestrijding.
- Zet de muis op een herstel kamer na verwijdering uit de narcose tot helemaal wakker en vrij bewegen.
- Breng de muis een schone kooi voor verder onderzoek op een later tijdstip.
5. Longitudinale Imaging op volgende dagen
- Maken gebruik van de volgende methoden om longitudinale beeldvorming uit te voeren op de volgende dagen na de photothrombosis.
- Verdoven van de muis, zoals beschreven in artikel 1 van de methoden.
- Bij voldoende verdoving opnieuw te openen op de hoofdhuid door het verwijderen van alle resterende hechtingen aan de huid bovenop de eerder geboorde imaging gebied te heropenen.
- Gebruik een steriele katoenen applicator om eventuele resterende fascia bovenop de schedel te verwijderen.
- Lijm een maat roestvrij stalen ring (figuur 1) met weefsellijm het bot ligt over het vorige veld imaging.
- Bevestig de ring een stereotaxische houder (figuur 2) aan de muis te stabiliseren en om beweging te voorkomen tijdens de beeldvorming.
- Zoek het vaatstelsel grondslag liggen aan de eerder uitgedund schedel. Gebruik staartader injectie van FITC-dextran aan de aanwezigheid van de eerder opgewekte stolsel verifiëren.
- Gebruik 6.0 monofilament hechtdraad aan de in te sluitenCision over de schedel. Plaats antibiotische zalf langs de hechtdraad lijn om infectie te voorkomen. Injecteren Buprenex (0,05 mg / kg) subcutaan om de 12 uur gedurende drie dagen voor pijnbestrijding.
- Zet de muis op een herstel kamer na verwijdering uit de narcose tot helemaal wakker en vrij bewegen.
6. Keuring van Stroke Inductie (Post-mortem)
- Bij de conclusie van een studie, controleren slagvolume met 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (TTC) vlekken zoals weergegeven in figuur 5. De volledige methode kan worden gevonden in 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het doel van deze werkwijze was een ischemische beroerte in diermodellen (muis en rat) na een bolus injectie van RB met de staartader en daaropvolgende belichting van een schedel verdund met 561 nm laserlicht induceren. De afbeeldingen in figuur 4 tonen de voortgang van stolselvorming in een enkel vat na bestraling van het gebied van 0, 1, 1,5 en 2 minuten. Voorafgaand aan de vorming van een stolsel het hele schip is wit te wijten aan vrij stromende Rose Bengal. Na de inductie van bestraling van het vat is duidelijk donkerder in gedeelten van het vat en geeft de inductie van stolselvorming (frames 1 en 1,5 min). Na volledige afsluiting is er een duidelijke accumulatie van de kleurstof Rose Bengal (wit gebied) voorafgaand aan het stolsel (zwart gebied) in het vat. De 2 minuten kader toont de volledige occlusie van de slagader.
Om te controleren op de aanwezigheid van een ischemische beroerte TTC kleuring kan worden benut. TTC is een commonly gebruikt kleuring voor het detecteren van herseninfarct door de vorming van rode formazan TTC producten in gezond weefsel. Het ontbreken van formazan productie (wit weefsel) geeft het infarct gebied. De door de boxen in Figuur 5 gebieden tonen de typische letsel maten verkregen 1 en 5 dagen twee afzonderlijke dieren na een stolsel bereid in een vat van ongeveer 80 mm in diameter. Beeldanalyse is uitgevoerd op een vlak bed scanner en het gebruik van ImageJ software. Interessante gebieden worden getrokken in ImageJ op het gebied van het slagvolume van elke hersenen te meten.
Figuur 1:. Edelstaal Drie weergaven (boven-, zij- en onderaanzichten) getoond van de roestvrij stalen ring houder die wordt toegepast op de schedel van de muis om het te bevestigen aan de stereotaxische houder.
Figuur 2:. Microscope imaging platform opstart RB photothrombosis Chirurgische / beeldbewerkingplatform bevat een houder anesthesie buis met neuskegel en een stereotaxische houder roestvrij stalen ring die is bevestigd aan de schedel van het dier bewegen van de dieren tijdens verlagen imaging. Het platform is bovenop geplaatst en naar het laboratorium aansluiting om verticale verplaatsing mogelijk maken voor het positioneren van de muis onder het microscoopobjectief. Het laboratorium aansluiting is dan een microscoop podium, die zorgt voor de horizontale beweging bevestigd. De microscooptafel wordt bovenop geplaatst en vier cilindrische palen.
Figuur 3: Beeld van imaging / chirurgische platform ontwerp en oriëntatie onder de doelstelling inverter. (A) Het paneel aan de linkerkant toont een representatief beeld van de positionering van een verdoofde muis (anesthesie neuskegel werd kort verwijderd voor het nemen van de foto). Let op het gebruik van een aangepaste stalen ring om de muis schedel hechten aan de bijdrage van de ademhaling artefacten gedurende het beeldvormende procedures te verminderen. De afbeelding rechts toont een beeld van de corticale venster onder een dissectie microscoop. (B) Schets van de dunne schedel bereiding van een coronale aanzicht waaruit de lagen van de schedel ten opzichte van de dura mater en de dikte van het dun gebied in relatie tot de volledige dikte schedel.
Figuur 4: Beeld van Rose Bengal Stolselvorming Vertegenwoordiger beelden van een enkel vat met kleurstof Rose Bengal die werd geïnjecteerd door de staart vei.n van de muis. De beelden tonen de voortgang van stolselvorming in het vat na bestraling van het gebied van 0, 1, 1,5 en 2 minuten. Let op de accumulatie van de kleurstof Rose Bengal (wit) voorafgaand aan het stolsel (zwart) in de 2 min kader aantonen van de volledige occlusie van de slagader.
Figuur 5: 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (TTC) beeld van RB veroorzaakte letsel Vertegenwoordiger beelden worden getoond op dag 1 en 5 post-photothrombosis inductie.. De muizen werden opgeofferd en de hersenen snel verwijderd en gesneden in 1 mm coronale secties en gekleurd met TTC volgens standaardmethoden. TTC is een veelgebruikte kleuring voor het detecteren van herseninfarct door de vorming van rode formazan TTC producten in gezond weefsel. Het ontbreken van formazan productie (wit weefsel) geeft het infarct gebied. Degebieden aangegeven door de vakjes aan te tonen de typische letsel maten verkregen na een stolsel geproduceerd in een vat van ongeveer 80 micrometer in diameter.
Figuur 6: Schematische weergave van de Bengaals fototrombotisch procedure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mogelijkheid om experimentele beroerte pathofysiologie vertalen van dier op mens applicatie is geplaagd door mislukking. Het gebruik van diermodellen, zoals photothrombosis model zorgt voor beter begrip van beroerte pathofysiologie en de exploratie van nieuwe therapeutische benaderingen voor neurobescherming na een beroerte. Kleine corticale beroertes en microinfarctions door de fototrombotisch model is klinisch relevant subklinische of "stille" stroke 13-15, die een hoge prevalentie en treft ongeveer 4 procent van de Amerikaanse bevolking (ongeveer 11 miljoen mensen) jaarlijks 16. Stille beroerte heeft niet de klassieke symptomen van een beroerte aanwezig in een grotere slag, zoals verlamming, gevoelsverlies en bemoeilijkt spreken zoals gezien in de middelste cerebrale arterie (MCA) occlusie of transient ischemic attack (TIA) 17. Ook stille beroerte verschilt van lacunaire beroerte, diewordt veroorzaakt door occlusie van een enkele doordringende slagader in diepere hersenstructuren of in de hersenstam en ook klinisch manifesteert door motorische, sensorische of gemengde problemen 18. Patiënten met subklinische of "stille" beroerte meestal geen uiterlijke symptomen geven en zijn vaak niet op de hoogte dat ze hebben zelfs een beroerte. Silent beroerte resulteert in een subklinische afname van cognitieve functie tentoongesteld door tekorten in het geheugen, besluitvorming, en veranderingen in het gedrag. Na verloop van tijd meerdere stille beroertes leiden tot klinisch significante tekenen van geheugenverlies bekend als vasculaire of multi-infarct dementie. Echter, stille beroerte hersenschade worden gedetecteerd met behulp van neuroimaging, en plaatst een patiënt het risico op TIA en de grote slag in de toekomst 19.
Het photothrombosis model maakt de productie van reproduceerbare in vivo model van thrombose in een intacte, verdoofde muis met de fotogevoelige kleurstof Rose Bengal (RB) in combinatie met confocale microscopie. Er zijn vele voordelen van de in vivo photothrombosis model. Een voordeel van deze werkwijze is de mogelijkheid om de locatie van de lijn met behulp stereotaxische coördinaten vooraf definiëren; zodat men bepaalde celpopulaties te bestuderen tegenover dieren. Bovendien is de reproduceerbaarheid van laesiegrootte en volume goed gecontroleerde toepassing van deze werkwijze door het variëren van de intensiteit van het laserlicht en het regelen van de grootte vaartuig bestraald 20. Deze methode maakt het ook mogelijk voor een gedetailleerde studie van de veranderingen in de peri-infarct neurotransmissie en overeenkomstige contralaterale cortex 4. Hoewel een enkele stil beroerte veroorzaakt minimale tekorten, de reproduceerbaarheid van dit model maakt de mogelijkheid om meerdere stille beroertes veroorzaken in bepaalde gebieden, die kunnen worden gebruikt om verschillende hersenendysfuncties zoals vasculaire dementie nabootsen. Ontwikkeling van een drempel tussen meerdere stille beroertes en klinisch evidente tekorten kon speci worden bepaaldfic hersengebieden door het gebruik van deze werkwijze ook. Tenslotte model maakt longitudinale studies in hetzelfde dier waardoor zowel acute als chronische effecten worden waargenomen.
Er zijn echter enkele nadelen bij het gebruik van de photothrombosis model. Een nadeel omvat de productie van een laesie die wordt genoteerd als een kleine ischemische penumbra in vergelijking met andere modellen van focale beroerte 4. Ten tweede vasogeen en cytotoxisch oedeem vorming mogelijk vanwege de schade die kan optreden tijdens de inductie van photothrombosis, die meer lijkt op traumatisch hersenletsel dan focale beroerte 4.
Bij gebruik van de photothrombosis model zijn er een aantal factoren die moeten worden gevolgd gedurende het experiment. Het is essentieel dat de fysiologische toestand van het dier worden gevolgd door alle beeldvormende procedures. Het is bekend dat narcose niveau invloed hebben op de fysiologische stAtus van het dier, met meer verlamming veroorzaakt verlaagde hartslag en zuurstoftoevoer aan het dier. Dit is een belangrijke overweging, omdat dit de beschikbaarheid van zuurstof zou afnemen naar de hersenen resulteert in globale ischemie. Daarom is het gebruik van een systeem om de fysiologische toestand van het dier te meten zal zorgen voor een gelijktijdige niet-invasief registreren van: arteriële zuurstofsaturatie (SpO 2); Hartslag; Breath Rate; Pulse Uitzetting (indicator van de lokale doorbloeding en kwaliteit van het signaal); Breath distensietestresultaten (surrogaat voor intraplueral druk); en kerntemperatuur bij muizen en ratten. Het wordt steeds belangrijker om te controleren voor anesthesie verwart bij het werken met elke diermodel om onverwachte verwart te verminderen in het vertalen van experimentele resultaten aan voordelen in klinische stoke. De keuze, de duur en de diepte van de anesthesie kan een drastische invloed in diermodel van experimentele beroerte. Studies hebben aangetoond dat anesthetica si infarct kan verminderenZE en kan zelfs enige bescherming van cerebrale ischemie 21-23,24. Daarnaast heeft wijzigingen in de productie van reactieve zuurstofdeeltjes ook aangetoond in een studie waarbij het gebruik van halothaan en propofol 25. Dit verwarren is belangrijk omdat een van de belangrijkste hypothesen neuronale dood geassocieerd met beroerte is de productie van reactieve zuurstofsoorten.
Een complicatie van het gebruik in vivo microscopie om de respons van de hersenen een beroerte onderzoek is de beperking van de beeldvormende diepte haalbaar. In ons laboratorium met behulp van confocale microscopie de beeldvormende diepte die kan worden bereikt in het gebied van 100-200 urn, bij gebruik van een twee-foton microscoop deze diepte kan oplopen tot tussen 400-500 pm. Deze verwart worden verlicht door de ontwikkeling van doelstellingen verhoogde werkafstanden en afnemende grootte. Bijvoorbeeld, de gradiënt in de brekingsindex (GRIN) microlenzen zijn microendoscopes with diameters tussen 35-1,000 micrometer en zijn de kleinste beschikbaar tot op heden. Dit type van sonde kan niet in het weefsel worden ingebracht zonder dat invasieve schade en hebben een lage numerieke openingen. Door de lage NA de resolutie inferieur in vergelijking met traditionele optische microscopie doelstellingen 26.
Samengevat, het Rose Bengal photothrombosis model veroorzaakt een infarct van kleine afmetingen en is nuttig bij het bestuderen van de cellulaire reactie op een infarct in zowel de acute als chronische fasen in een goed gedefinieerde celpopulatie. Dit model demonstreert essentiële cellulaire kenmerken waargenomen bij focale ischemie na MCAO en is daarom nuttig om neurobeschermende / neuroregeneratieve therapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Rose Bengal | Sigma | 330000 | |
| Isoflurane Anesthetic | MWI Veterinary Supply | 088-076 | |
| Vetbond | 1469SB | 1469SB | |
| aCSF | 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4). | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissecting Scissors | Bioindustrial Products | 500-410 | |
| Operating scissors 14 cm | Bioindustrial Products | 12-055 | |
| Forceps Dumont High Tech #5 style, straight | Bioindustrial Products | TWZ-301.22 | |
| LabJack 132X80 | Optosigma Co | 123-6670 | |
| Platform for Labjack 8X 8 | Optosigma Co | 145-1110 | |
| Ear bar holder from stereotaxic setup | Stoelting/Cyborg | 51654 | |
| Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine | DRE, Inc. | 15001 | |
| Tech IV Isoflurane vaporizer | DRE, Inc. | 34001 | |
| F Air Canister | DRE, Inc | 80120 | |
| Bain circuit breathing tube | DRE, Inc | 86111B | |
| Rodent adapter for bain tube | DRE, Inc | 891000 | |
| O2 regulator for oxygen tanks | DRE, Inc | CE001E | |
| Rodent induction chamber | DRE, Inc | 15004C | |
| Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle | Suture Express | 1639G | |
| Objective inverter Optical Adapter | LSM technologies | ||
| Foredom drill Dual voltage 110/120 | Foredom | 134.53 | |
| Meisinger 3.9 mm drill bit | Meisinger | (Ref#310 104 001 001 009) | |
References
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17, 497-504 (1985).
- Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circulation Research. 40, 320-328 (1977).
- Owens, A. P. 3rd, Mackman, N. Sources of tissue factor that contribute to thrombosis after rupture of an atherosclerotic plaque. Thrombosis Research. 129, Suppl 2. S30-S33 (2012).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2, 396-409 (2005).
- Manual of stroke models in rats. , 332 CRC Press. (2009).
- Herz, R. C., Kasbergen, C. M., Hillen, B., Versteeg, D. H., de Wildt, D. J. Rat middle cerebral artery occlusion by an intraluminal thread compromises collateral blood flow. Brain Research. 791, 223-228 (1998).
- Brint, S., Jacewicz, M., Kiessling, M., Tanabe, J., Pulsinelli, W. Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism : Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 8, 474-485 (1988).
- Zheng, W., et al. Purinergic receptor stimulation reduces cytotoxic edema and brain infarcts in mouse induced by photothrombosis by energizing glial mitochondria. PloS One. 5, e14401 (2010).
- Zheng, D. M., Wewer, J., Lechleiter, J. P. 2Y. 1R. -initiated IP3R-dependent stimulation of astrocyte mitochondrial metabolism reduces and partially reverses ischemic neuronal damage in mouse. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 600-611 (2013).
- Witte, O. W., Stoll, G. Delayed and remote effects of focal cortical infarctions: secondary damage and reactive plasticity. Advances in Neurology. 73, 207-227 (1997).
- Hagemann, G., Redecker, C., Neumann-Haefelin, T., Freund, H. J., Witte, O. W. Increased long-term potentiation in the surround of experimentally induced focal cortical infarction. Annals of Neurology. 44, 255-258 (1998).
- Kramer, M., et al. TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses. Journal of Neuroscience Methods. 187, 84-89 (2010).
- Blinder, P., Shih, A. Y., Rafie, C., Kleinfeld, D. Topological basis for the robust distribution of blood to rodent neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 12670-12675 (2010).
- Nishimura, N., Rosidi, N. L., Iadecola, C., Schaffer, C. B. Limitations of collateral flow after occlusion of a single cortical penetrating arteriole. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 30, 1914-1927 (2010).
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 365 (2007).
- Blum, S., et al. Memory after silent stroke: Hippocampus and infarcts both matter. Neurology. 78, 38-46 (2012).
- Heinsius, T., Bogousslavsky, J., Van Melle, G. Large infarcts in the middle cerebral artery territory Etiology and outcome patterns. Neurology. 50, 341-350 (1998).
- Wardlaw, J. What causes lacunar stroke. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 76, 617-619 (2005).
- Inoue, Y., et al. Ischemic stroke under anticoagulant therapy]. Rinsho shinkeigaku. Clinical Neurology. 50, 455-460 (2010).
- Tiannan Wang, W. C., Xie, Y., Zhang, W., Ding, S. Controlling the Volume of the Focal Cerebral Ischemic Lesion through Photothrombosis. American Journal of Biomedical Sciences. 2, 33-42 (2009).
- Head, B. P., Patel, P. Anesthetics and brain protection. Current Opinion in Anaesthesiology. 20, 395-399 (2007).
- Kirsch, J. R., Traystman, R. J., Hurn, P. D. Anesthetics and cerebroprotection: experimental aspects. International Anesthesiology Clinics. 34, 73-93 (1996).
- Koerner, I. P., Brambrink, A. M. Brain protection by anesthetic agents. Current Opinion in Anaesthesiology. 19, 481-486 (2006).
- Gelb, A. W., Bayona, N. A., Wilson, J. X., Cechetto, D. F. Propofol anesthesia compared to awake reduces infarct size in rats. Anesthesiology. 96, 1183-1190 (2002).
- Bhardwaj, A., Castro, I. A., Alkayed, N. J., Hurn, P. D., Kirsch, J. R. Anesthetic choice of halothane versus propofol: impact on experimental perioperative stroke. Stroke; A Journal Of Cerebral Circulation. 32, 1920-1925 (2001).
- Barretto, R. P., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses. Nature Methods. 6, 511-512 (2009).
