Introduction
Die beschriebene Technik ermöglicht die Visualisierung der in vivo zellulären Reaktionen unmittelbar nach der Induktion von Rose Bengal photothrombosis in einer intakten Maus. Rose Bengal (4,5,6,7-Tetrachlor-2 ', 4', 5 ', 7'-tetraiodofluorescein) ist eine lichtempfindliche Farbstoff verwendet werden, um einen ischämischen Schlaganfall bei Tiermodellen (Maus und Ratte) induzieren. Nach einer Bolus-Injektion von RB durch die Schwanzvene und anschließender Bestrahlung durch einen ausgedünnten Schädel mit einem 564 nm-Laserlicht wird ein Thrombus induzierte verursacht eine physiologische Takt 1. Das Verfahren wurde ursprünglich von Rosenblum und El-Sabban 1977 beschrieben ist, und wurde später von Watson in der Mitte der 1980er Jahre 1,2 angepasst. Kurz gesagt wird Rose Bengal mit grünen Anregungslicht (561 nm-Laser in unserem Fall), welche die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, die anschließend aktiviert Gewebefaktor, einen Initiator der Gerinnungskaskade generiert bestrahlt. Die Induktion der Koagulationskaskade erzeugt eine ischämische lesIonen, die pathologisch relevanten klinischen Schlaganfall 3 ist.
Hub hat eine komplexe Pathophysiologie aufgrund des Zusammenspiels von vielen verschiedenen Zelltypen, einschließlich Neuronen, Glia, Endothel und das Immunsystem. Die Auswahl der besten Technik zu studieren, ein bestimmter zellulärer Prozess erfordert mehrere Überlegungen. Experimentelle Techniken fallen grob in eine von drei Kategorien: in vitro, in vivo und in silico mit mit jeweils Vor- und Nachteile In-vitro-Studien haben den Hauptnachteil Entfernung von Zellen aus ihrer natürlichen Umgebung und daher nicht Effekte in einer intakten gesehen reproduzieren. lebenden Tier. In-vivo-Techniken für eine verbesserte experimentelle Replikation von Krankheitszuständen mit erhöhter Translations Bedeutung. In silico bezieht sich allgemein auf Computermodellierung von einer Erkrankung oder eines zellulären Prozess, und während zunehmend genutzt, um potenzielle Wechselwirkungen für die Prüfung lernenweise alle Informationen zusammengetragen sind immer noch in lebenden Zellen oder Gewebe getestet werden.
Das ideale Modell für Schlaganfall in der Laborumgebung sollte ähnlich pathologischen Merkmale mit den in der menschlichen Bevölkerung gesehen zeigen. Zwar gibt es gemeinsame physiologische Eigenschaften von Schlaganfall in der menschlichen Bevölkerung, gibt es auch viele Unterschiede in Abhängigkeit von der Art der Verletzung erfahren. Stroke in der menschlichen Bevölkerung tritt als kleine oder große Gefäßverschlüssen, hämorrhagische Läsionen und Arterie zu Arterie oder Herz-Kreislauf-Embolien, die in vielfältigen Infarktvolumen als auch Unterschiede in Mechanismen, um jede Pathologie führen. Der Vorteil der Verwendung von Tiermodellen Schlaganfall ist die Erzeugung von reproduzierbaren Infarkten, die Eigenschaften des menschlichen Schlaganfall zu imitieren. Die häufigsten Tiertaktmodelle umfassen Arterienverschluss mit: A. cerebri media Okklusion (Embolie oder endovaskuläre Filament-Verfahren), welche Modelle distalen MCAO und die photothrombosis Modell. Die Vorteile einerd Nachteile der einzelnen Modelle wurden an anderer Stelle (siehe 4 und 5). Globale ischämischen Modellen (MCAO), während relativ einfach durchzuführen sind weniger relevant für die menschliche Schlaganfall sind als Brenntaktmodelle. Darüber hinaus sind diese Verfahren sehr variabel zu induzieren reproduzierbare Hirninfarkt Läsionen. Die photothrombosis Modell ist sehr gut reproduzierbar, solange der Experimentator steuert ihre Experimente gut und bietet einen klaren Vorteil gegenüber MCAO-Modelle. Aufgrund Mikrovaskulatur Beleidigung das Modell ist beschrieben worden, um eine minimale ischämischen Penumbra, das Gebiet, in dem Zellen dachte salvageable 6,7 zu sein anzuzeigen. Zusätzlich kann ein vasogenes Ödem und zytotoxische Ödembildung auch nach einer Bestrahlung der Bildfläche induziert werden. Trotz dieser Einschränkungen ist die Technik neue Einblicke in vielen physiologischen Prozessen nach Schlaganfall 8, 9, 10, 11 vorgesehen.
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Protocol
Hinweis: Alle tierischen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of Texas Health Science Center in San Antonio genehmigt und wurden im Einklang mit den Leitlinien ANKOMMEN.
1. Anästhesie für Cortical Vorbereitung
- Platzieren Sie die Maus in eine Induktionskammer mit 2-3% Isofluran mit Sauerstoff gemischt, um Anästhesie zu induzieren. Beachten Sie die Atemfrequenz ab, wenn die Maus induziert. Klemmen Sie die Pfote der Maus, um festzustellen, ob die Maus ist bereit, an den Nasenkegel bewegen. Hinweis: Anesthesia Ebene ist ein entscheidender Schritt in einer in vivo-Erstellung und darauf zu achten, nicht auf ein Niveau, das globale Ischämie verursachen induzieren.
- Sobald die Maus ausreichend betäubt, übertragen Sie die Tier der Operation / Imaging-Plattform und legen Sie mit der Maus die Nase in der Nasenkegel und gelten 1-1,2% Isofluran, einen betäubten Zustand zu halten. Sicherzustellen, dass die Maus auf eine Temperatur co liegendenntrolled Heizkissen um die Körpertemperatur (37 ° C +/- 0,5 ° C) während der restlichen Verfahren, aufrechtzuerhalten. Zeigen vet Salbe über die Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
- Überwachen Sie die Physiologie der Maus mit einer Pulsoximetrie-System mit dem Schwanz oder Fuß-Clip mit dem System zur Verfügung gestellt. Überprüfen Sie, ob die Atemfrequenz zwischen 50-65 Atemzüge / min gehalten. Überprüfen Sie, ob die Herzfrequenz bleibt zwischen 300 bis 450 bpm und Sauerstoffsättigung wird zwischen 97-98% gehalten, um langfristige Überleben des Tieres zu gewährleisten.
- Wenn die Maus ausreichend betäubt, rasieren die Haare über der Schädeldecke mit elektrischen Haarschneider, entfernen Sie restlichen Haare und sauber und mit Betadin, gefolgt von einer Ethanol-Tupfer. Wiederholen Sie diesen Vorgang bis zu dreimal, um eine sterile OP-Umgebung zu gewährleisten.
2. Chirurgisches Verfahren
- Mit der Kopfhaut vollständig gereinigt und rasiert, einen 5 mm Einschnitt in die Kopfhaut der Maus, um die Schädel fissu zeigenres und Bregma finden.
- Verwenden Sie eine sterile Baumwoll-Applikator, um alle verbleibenden Faszie über dem Schädel zu entfernen.
- Kleben Sie eine maßgeschneiderte Edelstahlring (Abbildung 1) mit Gewebekleber auf den Knochen der über dem parietalen Kortex mit den stereotaktischen Koordinaten Bregma: -1 bis -3 mm und Quer: 2-4 mm. Hinweis: Der Leim bindet normalerweise innerhalb von 2 min nach dem Aufsetzen des Ringes auf den Knochen.
- Das Anbringen der Ring zu einer stereotaktischen Halter (2), um die Maus zu stabilisieren und um eine Bewegung während der Bilderzeugung zu verhindern.
- Unter einem chirurgischer Qualität Binokular, langsam bohren Sie ein 1-2 mm Abschnitt in der Schädeldecke mit einem drehzahlgeregelten dremel artiges Werkzeug (Meisinger 3,9 mm Bohrer) und achten Sie auf den Bereich zu halten, wie es gebohrt wird. Erreichen dies unter Verwendung eines Zick-Zack-Muster. Um Hitze zu vermeiden aufzubauen, setzen Sie den Bohrer Geschwindigkeit niedrig und machen Sie regelmäßig Pausen.
- Wenn der Hirnschädel wird shinny in Erscheinung, auch weiterhin die Ausdünnungdes Schädels mit einer Skalpellklinge unter Verwendung der gleichen Zickzack-Muster, um den ausgedünnten Oberflächen Niveau zu halten, um glatte Entfernung von dünnen Schichten der Hirnschädel zu erleichtern. Mit der Spitze der Skalpellklinge machen kleine lineare Hübe mit leichtem Druck, um dünne Schichten von Knochen zu einer Zeit, zu entfernen. Fahren Sie diese bis zum Gefäßsystem ist eindeutig durch das Binokular sichtbar.
- Wenn der Experimentator durchsticht oder brechen durch den Schädel in der Ausdünnungsverfahren, das Tier einschläfern aufgrund wahrscheinlich Beschädigung des darunterliegenden Kortex.
Die Maus-Schädel ist etwa 300 um dick und besteht aus zwei dünnen Schichten von kompakten Knochen (eine äußere und eine innere Schicht) und eine Schicht aus Spongiosa zwischen den zwei Schichten aus kompaktem Knochen besteht, sandwichartig angeordnet. Die äußere Schicht kompakten Knochens und die meisten der Spongiosa innerhalb des 5 mm Bohrbereich was zu einer ungefähr 50 & mgr; m-Schicht kompakten Knochens verbleibenden entfernt (siehe 2B). Visualization des Gefäßsystems wird sichergestellt, dass die endgültige verdünnte intakten Schädel ist etwa 50 & mgr; m in der Dicke. Der Schädel ist also noch vorhanden ist, wenn diese Dicke ausgedünnt.
3. Mikroskop Set-up
- Verwenden Sie ein umgekehrtes Mikroskop-System (konventionelle konfokale oder Zwei-Photonen-Systeme), die eine Objektivwechselrichter. Anmerkung: Es ist auch möglich, einen Standard aufrechten Mikroskop zu verwenden. Der begrenzende Faktor wird der Raum zwischen der Stufe und den Zielen. Modifikationen an der Bühne kann notwendig sein, um diese Einstellung durchzuführen.
- Sichern Sie die chirurgische / Imaging-Plattform, um eine maßgeschneiderte Bühne, die abgesehen von der Basis des Mikroskops befindet. Anmerkung: Die Plattform ist mit einer Laborbuchse eine Vertikalbewegung des chirurgischen / Imaging Plattform unter dem Ziel ermöglichen gemacht. Die Laborhebebühne ist mit einer Platte, um vier zylindrische Stangen befestigt montiert. (Siehe Abbildung 2).
- Positionieren Sie den Ziel-Wechselrichter, die eine 20-fachZiel im Laufe des Schädelfenster. Verwenden Sie eine externe Lichtquelle, um die Schädelfenster, indem Sie durch die Okulare des Mikroskops zu finden und positionieren Sie das Ziel in der Imaging-Bereich. Hinweis: Der Abbildungsbereich wird durch die Anwesenheit des Gefäßsystems bezeichnet werden.
- Für wasserbasierende Ziele künstliche Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF) (130 mM NaCl; 30 mM KCl; 12 mM KH 2 PO 4, 200 mM NaHCO 3, 30 mM HEPES und 100 mM Glucose) als das Medium durch Potential Leckage in die Schädelhöhle während der Abbildung (Abbildung 3).
4. Rose Bengal Dye Vorbereitung, Verwaltung und Induktion von Stroke
- Eine frische 20 mg / ml Lösung von Rose Bengal in künstliche Rückenmarksflüssigkeit (aCSF); zu filtern und zu sterilisieren vor der Verabreichung. Nicht wiederverwenden oder lagern Sie das Rose Bengal, sobald sie gemischt hat. Machen Sie eine frische Lösung für jedes Experiment.
- Geben Sie eine 0,1 ml Schwanzveneninjektion von Rose Bengal sKonserven die Schädelfenster mit einem 561-nm-Laser, um eine ausreichende Injektion der Lösung zu gewährleisten. Anmerkung: Bengalrosa wird innerhalb von 5 Sekunden nach Injektion in das Gefäßsystem des Gehirns sichtbar gemacht werden. Der gesamte Behälter sollten mit Rose Bengal gefüllt werden.
- Nach ausreichender Injektion von Rose Bengal-Farbstoff wählen einen geeigneten Behälter für Thrombose basierend auf Gefäßdurchmesser (40-80 um), um die Reproduzierbarkeit einer bestimmten Läsion Volumen zu gewährleisten. Differenzieren zwischen Arterien und Venen, indem man die Richtung des Blutflusses: Arterien von größerem Durchmesser zu kleinerem Durchmesser Schiffe bewegen, bewegen Adern auf einen größeren Durchmesser Gefäße. Dies wird einfach durch Visualisierung bewerkstelligt einmal Rose Bengal eingespritzt wird.
- Ändern Sie den Mikroskop-Einstellung wie folgt:
- Erhöhen Sie die Verweildauer. Anmerkung: Diese wird in Abhängigkeit von der Mikroskopsystems ausgenutzt variieren.
- Erhöhung der Laserleistung auf 100%.
- Sammeln zeitliche Abfolge Bilder auf 1 Bild / s unter Verwendung dermaximale Scangeschwindigkeit.
- Scannen der Maus, bis eine stabile Gerinnsel innerhalb des Behälters gebildet wird. Hinweis: Diese Regel wird innerhalb von 5 min der kontinuierliche Abtastung erreicht (siehe Abbildung 4).
- Im Anschluss an die Induktion der Gerinnselbildung unter Verwendung von Bengalrosa, entfernen Sie die Maus von der Bildfläche zurück in die Binokular. Die Edelstahlring vorsichtig aus der Hirnschädel zu entfernen. Untersuchen Sie die Schädelfenster für jede Blutung. Wenn die Blutung auftritt, beenden das Experiment.
- Verwenden Sie 6,0 Monofilamentnahtmaterial, um den Einschnitt über den Schädel zu schließen. Zeigen antibiotische Salbe entlang der Nahtlinie, um eine Infektion zu verhindern. Injizieren Buprenex (0,05 mg / kg) subkutan alle 12 Stunden für drei Tage für die Schmerztherapie.
- Gibt die Maus auf eine Wiedergewinnungskammer nach der Entfernung aus der Narkose bis zum vollständigen Aufwachen und frei bewegen.
- Gibt die Maus auf eine saubere Käfig für weitere Untersuchungen zu einem späteren Zeitpunkt.
5. Längs Imaging an den folgenden Tagen
- Verwenden Sie die folgenden Methoden, um eine Längs Bildgebung bei zukünftigen Tage nach photothrombosis durchzuführen.
- Betäuben die Maus, wie in Abschnitt 1 der Methoden beschrieben.
- Auf ausreichende Betäubung wieder zu öffnen, die Kopfhaut durch Entfernen alle restlichen Nähte, um die Haut über dem zuvor gebohrten Abbildungsfeld erneut zu öffnen.
- Verwenden Sie eine sterile Baumwoll-Applikator, um alle verbleibenden Faszie über dem Schädel zu entfernen.
- Kleben Sie eine maßgeschneiderte Edelstahlring (Abbildung 1) mit Gewebekleber auf den Knochen, die über der früheren Bildfeld.
- Das Anbringen der Ring zu einer stereotaktischen Halter (2), um die Maus zu stabilisieren und um eine Bewegung während der Bilderzeugung zu verhindern.
- Suchen Sie das Gefäßsystem des zuvor ausgedünnten Schädel zugrunde. Verwenden Schwanzveneninjektion von FITC-Dextran, das Vorhandensein der vorher induzierten Gerinnsel verifizieren.
- Verwenden Sie 6,0 Monofilamentnahtmaterial die in zu schließenscheidung über den Schädel. Zeigen antibiotische Salbe entlang der Nahtlinie, um eine Infektion zu verhindern. Injizieren Buprenex (0,05 mg / kg) subkutan alle 12 Stunden für drei Tage für die Schmerztherapie.
- Gibt die Maus auf eine Wiedergewinnungskammer nach der Entfernung aus der Narkose bis zum vollständigen Aufwachen und frei bewegen.
6. Prüfung von Stroke Induction (Post-mortem)
- Am Ende der Studie, überprüfen Schlagvolumen mit 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Färbung wie in Abbildung 5 dargestellt. Die vollständige Methode kann in 12 gefunden werden.
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Representative Results
Das Ziel dieses Verfahrens war es, ein Schlaganfall in Tiermodellen (Maus und Ratte) nach einer Bolus-Injektion von RB durch die Schwanzvene und anschließende Beleuchtung einer dünnt Schädel mit einem 561 nm Laserlicht zu induzieren. Die Bilder in Figur 4 zeigen den Verlauf der Gerinnselbildung in einem einzigen Gefäß nach Bestrahlung des Bereichs auf 0, 1, 1,5 und 2 min. Vor der Gerinnselbildung der gesamte Behälter ist weiß aufgrund fließt Rose Bengal zu befreien. Nach der Induktion der Bestrahlung des Gefäßes gibt es eine offensichtliche Verdunkelung in Abschnitten des Behälters und zeigt die Induktion der Bildung von Blutgerinnseln (Rahmen 1 und 1,5 min). Nach vollständiger Okklusion ergibt sich eine deutliche Akkumulation von Rose Bengal-Farbstoff (weißer Bereich) vor der Gerinnselbildung (schwarzer Bereich) innerhalb des Behälters. Die 2 Minuten Rahmen zeigt die vollständigen Verschluss der Arterie.
Zur Überprüfung der Anwesenheit von einem ischämischen Schlaganfall TTC-Färbung eingesetzt werden können. TTC ist eine Commonly verwendete Färbung zum Nachweis von Hirninfarkt durch die Bildung von roten Formazan TTC Produkte in gesundem Gewebe. Der Mangel an Formazan-Produktion (weiße Gewebe) zeigt die Infarktgebiet. Die durch die Kästen in Figur 5 angegebenen Bereiche zeigen die typischen Läsionsgrößen folgende eines Gerinnsels in einem Gefß etwa 80 mm im Durchmesser hergestellt erhaltenen 1 und 5 Tagen von zwei getrennten Tiere. Bildanalyse wird auf einem Flachbett-Scanner und die Verwendung ImageJ Software. Regionen von Interesse innerhalb ImageJ gezogen werden, um den Bereich des Schlagvolumens für jedes Gehirn messen.
Abb. 1: Edelstahlring Drei Ansichten (oben, Seiten und am Boden Ansichten) sind der Edelstahlringhalter, der auf den Schädel des Maus, um es in die stereotaktischen Halterung befestigen angewendet wird angezeigt.
Fig. 2: Mikroskop-Abbildungsplattform Setup für RB photothrombosis Chirurgisches / Abbildungsplattform eine Halterung für die Anästhesie Rohr mit Vorsatzhaube und einer stereotaktischen Halterung für den Ring aus rostfreiem Stahl, die mit dem Schädel des Tiers befestigt wird, um eine Bewegung des Tieres während verringern enthält Imaging. Die Plattform ist auf der Oberseite angeordnet und auf der Laborhebebühne befestigt ist, um eine vertikale Bewegung zum Positionieren der Maus unter dem Mikroskopobjektiv ermöglichen. Die Laborhebebühne wird dann in einen Mikroskoptisch, der für eine horizontale Bewegung ermöglicht befestigt. Der Objekttisch ist auf der Oberseite angeordnet und auf vier zylindrische Stangen befestigt.
Bild 3: Bild von Imaging / chirurgische Plattform-Design und Orientierung im Rahmen des Ziels inverter. (A) Die auf der linken zeigt ein repräsentatives Bild der Positionierung einer narkotisierten Maus (Anästhesie Bugnase wurde kurz nach der Aufnahme entfernt). Beachten Sie die Verwendung eines kundenspezifischen Stahlring, um die Maus Schädel befestigen, um den Beitrag von Atemartefakten in den bildgebenden Verfahren zu verringern. Das Bild auf der rechten Seite zeigt ein Bild des kortikalen Fenster unter einem Binokular. (B) Schematische Darstellung des dünnen Schädel Herstellung aus einem Koronalansicht demonstrieren die Schichten des Schädels im Verhältnis zu der Dura mater und der Dicke des verdünnten Bereich in Bezug auf den vollen Schädeldicke.
Bild 4: Bild von Rose Bengal Gerinnselbildung Repräsentative Bilder eines einzigen Gefäß mit Rose Bengal-Farbstoff, der durch den Schweif vei injiziert wurde.n der Maus. Die Abbildungen zeigen den Verlauf der Gerinnselbildung in dem Behälter nach der Bestrahlung der Fläche mit 0, 1, 1,5 und 2 min. Beachten Sie die Ansammlung der Rose Bengal-Farbstoff (weiß) vor dem Gerinnsel (schwarz) in der 2 min Rahmen, die einen vollständigen Verschluss der Arterie.
Abbildung 5: 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Bild von RB induzierten Läsion Repräsentative Bilder werden an Tag 1 und 5 nach der photothrombosis Induktion gezeigt.. Wurden die Mäuse getötet und die Gehirne rasch entnommen und in 1 mm Kranzschnitte geschnitten und mit TTC gefärbten nach Standardmethoden. TTC ist eine häufig verwendete Farbstoff für den Nachweis von Hirninfarkt durch die Bildung von roten Formazan TTC Produkte in gesundem Gewebe. Der Mangel an Formazan-Produktion (weiße Gewebe) zeigt die Infarktgebiet. DieGebieten, die von den Kästen angegeben zeigen die folgenden ein Blutgerinnsel in einem Gefäß erzeugt etwa 80 um Durchmesser erhalten typische Läsion Größen.
Abbildung 6: Schematische Darstellung der Rose Bengal photothrombotic Verfahren.
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Discussion
Die Fähigkeit, experimentellem Schlaganfall Pathophysiologie vom Tier zum Menschen Anwendung übersetzen mit Ausfall geplagt. Jedoch ist die Verwendung von Tiermodellen, wie dem photothrombosis Modell ermöglicht ein besseres Verständnis der Pathophysiologie und der Hub der Erforschung neuer Therapieansätze für die Neuroprotektion bereitzustellen nach einem Schlaganfall. Kleine Schlaganfällen und kortikaler Mikroinfarkten durch die photothrombotic Modell produziert werden, sind klinisch relevant subklinischer oder "stille" Takt 13-15, die eine hohe Prävalenz hat und wirkt sich auf rund 4 Prozent der Bevölkerung der Vereinigten Staaten (etwa 11 Millionen) pro Jahr 16. Leiser muss nicht die klassischen Schlaganfall-Symptome in einem größeren Hub vorhanden ist, wie Lähmungen, Sensibilitätsstörungen und Schwierigkeiten beim Sprechen, wie in der A. cerebri media (MCA) Okklusion oder transitorische ischämische Attacke (TIA) 17 zu sehen. Auch unterscheidet sich von lacunar Schlaganfall, leiser waswird durch Okklusion eines einzigen durchdringenden Arterie in tieferen Hirnstrukturen oder innerhalb des Hirnstamms verursacht und auch klinisch manifestiert mit motorischen, sensorischen oder Mischdefizite 18. Patienten mit subklinischer oder "stille" Schlaganfall in der Regel keine äußeren Symptome zeigen und wissen oft nicht, sie haben sogar einen Schlaganfall erlitten. Leiser zu einer subklinischen Verminderung der kognitiven Funktion durch Defizite im Speicher, Entscheidungs- und Verhaltensänderungen zeigten. Im Laufe der Zeit mehrere stille Schlaganfall führen zu einer klinisch signifikanten Anzeichen von Gedächtnisverlusten vaskulären oder Multi-Infarkt-Demenz bekannt. Allerdings kann leiser Hirnschäden mit bildgebenden Verfahren nachgewiesen werden, und legt einen Patienten mit einem Risiko für TIA und schweren Schlaganfall in der Zukunft 19.
Die photothrombosis Modell ermöglicht die Herstellung einer reproduzierbaren in vivo-Modell der Thrombose in einem intakten, narkotisierten Maus unter Verwendung des lichtempfindlichen Farbstoff Bengalrosa (RB) in KombiNation mit der konfokalen Mikroskopie. Es gibt viele Vorteile der in vivo photothrombosis Modell. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist die Fähigkeit, die Lage der Striche mit der stereotaktischen Koordinaten vordefinieren; so dass man bestimmte Zellpopulationen über Tiere zu studieren. Zusätzlich wird die Reproduzierbarkeit der Läsionsgröße und Volumen gut kontrollierte Verwendung dieser Methode durch Variation der Intensität des Laserlichtes und zum Steuern einer Gefäßgröße bestrahlt 20. Dieses Verfahren ermöglicht auch die detaillierte Untersuchung der Veränderungen in der peri-Infarkt-Neurotransmission und entsprechende Gegen Cortex 4. Obwohl ein einzelner leiser verursacht nur eine minimale Defiziten ist die Reproduzierbarkeit dieses Modells erlaubt die Fähigkeit, mehrere stille Striche in bestimmten Bereichen zu induzieren, die verwendet werden können, um verschiedene Funktionsstörungen des Gehirns, wie vaskuläre Demenz imitieren. Entwicklung von einem Schwellenwert zwischen mehreren stille Schlaganfälle und klinisch evidenter Defizite könnten in spezifischen bestimmt werdenFIC Bereichen des Gehirns durch die Verwendung dieses Verfahrens als auch. Schließlich ermöglicht die Längsschnittstudien in demselben Tier so dass für die akute und chronische Auswirkungen zu beachten das Modell.
Es gibt jedoch einige Nachteile bei der Verwendung der photothrombosis Modell. Ein Nachteil umfaßt die Herstellung einer Läsion, die als mit einem kleinen ischämischen Penumbra im Vergleich zu anderen Modellen von fokalen Schlaganfalls 4 hingewiesen wird. Zweitens ist vasogenen und zytotoxische Ödembildung aufgrund der Schäden, die während der Induktion von photothrombosis, das nahezu der traumatischen Gehirnverletzungen als Brenn Takt 4 auftreten können, möglich.
Bei Verwendung des photothrombosis Modell gibt es eine Reihe von Faktoren, die während des gesamten Experiments überwacht werden müssen. Es ist entscheidend, dass der physiologische Zustand des Tieres in allen bildgebenden Verfahren überwacht werden. Es ist bekannt, dass Anästhesie Ebene können die physiologischen st beeinflussenatus des Tieres, mit mehr als Betäubung verursacht verminderte Herzfrequenz und Sauerstoffversorgung des Tieres. Dies ist eine wichtige Überlegung, da dies die Verfügbarkeit von Sauerstoff in das Gehirn, was zu einer globalen Ischämie verringern. Daher ist die Verwendung eines Systems, um den physiologischen Zustand des Tieres überwacht wird zum gleichzeitigen nichtinvasiven Aufnahme zu ermöglichen: die arterielle Sauerstoffsättigung (SpO 2); Puls; Atemfrequenz; Pulse-Ausdehnung (Anzeige der lokalen Durchblutung und Signalqualität); Atem-Ausdehnung (Surrogat für intraplueral Druck); und die Kerntemperatur in Mäusen und Ratten. Es wird immer wichtiger, für die Anästhesie Kontrolle verwechselt bei der Arbeit mit einem Tier-Modell zu unerwarteten verwechselt bei der Übersetzung Versuchsergebnisse auf die Leistungen in der klinischen stoke reduzieren. Die Wahl, die Dauer und Tiefe der Anästhesie können drastische Auswirkungen in Tiermodell der experimentellen Schlaganfall. Studien haben gezeigt, dass Anästhetika kann Infarkt si reduzierenze und kann sogar einen gewissen Schutz vor zerebraler Ischämie 21-23,24. Zusätzlich weist Veränderungen in der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies auch in einer Studie, die den Gebrauch von Halothan und Propofol 25 gezeigt. Dies ist wichtig, da confound einer der Primärhypothesen Neuronentod Zusammenhang mit Schlaganfall ist die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies.
Eine Komplikation der Verwendung von in vivo-Mikroskopie, die Antwort des Gehirns auf einen Schlag zu studieren, ist die Begrenzung der Bildtiefe erreichbar ist. In unserem Labor mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie die Bildtiefe, die erreicht werden kann, ist im Bereich von 100 bis 200 & mgr; m, während mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop können diese Tiefe zwischen 400 bis 500 & mgr; m zu erhöhen. Diese verwechselt werden durch die Entwicklung von Zielen mit einer erhöhten Arbeitsabstände und abnehmender Größe verringert. Zum Beispiel wird der Gradient Brechungsindex (GRIN) Mikrolinsen Mikroendoskope with Durchmessern zwischen 35-1,000 um und sind die kleinsten auf dem neuesten Stand zur Verfügung. Diese Art der Sonde, ohne dass invasive Beschädigung und eine geringe numerische Apertur nicht in das Gewebe eingeführt werden. Aufgrund des niedrigen NA die Auflösung ist schlechter im Vergleich zu herkömmlichen optischen Mikroskop Objektiven 26.
Zusammenfassend ist die Rose Bengal photothrombosis Modell induziert einen Infarkt von kleiner Größe und ist nützlich bei der Untersuchung der zellulären Reaktion auf einen Infarkt in sowohl der akuten und chronischen Phasen in einem gut definierten Zellpopulation. Dieses Modell zeigt wesentliche zelluläre Merkmale mit fokalen Ischämie nach MCAO gesehen und ist deshalb bei der Beurteilung neuroprotektive / neuroregenerativen Therapien.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Rose Bengal | Sigma | 330000 | |
| Isoflurane Anesthetic | MWI Veterinary Supply | 088-076 | |
| Vetbond | 1469SB | 1469SB | |
| aCSF | 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4). | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissecting Scissors | Bioindustrial Products | 500-410 | |
| Operating scissors 14 cm | Bioindustrial Products | 12-055 | |
| Forceps Dumont High Tech #5 style, straight | Bioindustrial Products | TWZ-301.22 | |
| LabJack 132X80 | Optosigma Co | 123-6670 | |
| Platform for Labjack 8X 8 | Optosigma Co | 145-1110 | |
| Ear bar holder from stereotaxic setup | Stoelting/Cyborg | 51654 | |
| Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine | DRE, Inc. | 15001 | |
| Tech IV Isoflurane vaporizer | DRE, Inc. | 34001 | |
| F Air Canister | DRE, Inc | 80120 | |
| Bain circuit breathing tube | DRE, Inc | 86111B | |
| Rodent adapter for bain tube | DRE, Inc | 891000 | |
| O2 regulator for oxygen tanks | DRE, Inc | CE001E | |
| Rodent induction chamber | DRE, Inc | 15004C | |
| Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle | Suture Express | 1639G | |
| Objective inverter Optical Adapter | LSM technologies | ||
| Foredom drill Dual voltage 110/120 | Foredom | 134.53 | |
| Meisinger 3.9 mm drill bit | Meisinger | (Ref#310 104 001 001 009) | |
References
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