Abstract
胸腺沈降前駆細胞を特徴づけることはリンパ球減少患者におけるT細胞の交換のための戦略を考案することが不可欠、T細胞の発達の前胸腺の段階を理解することが重要です。我々は、in vitroおよびin vivo技術 、「ハンギングドロップ」法に基づいて、両方の中の相補的な2によってマウス胚13日目と18胸腺から前駆細胞を沈降胸腺を検討しました。この方法は、その子孫以下こうしてCD45アロタイプマーカーとで区別E13および/またはE18胸腺前駆細胞を照射した胎児胸腺葉に定着させました。混合集団との植民地は、人口のいずれかでのコロニー形成が可能で競争力のある選択圧を除去しながら、前駆細胞の生物学的性質の細胞自律的な差異を分析することができます。植民地化胸腺葉はまた、Tの人口動態などのin vivoでの成熟T細胞子孫の分析可能にする免疫不全の雄レシピエントマウスに移植することができます彼異なる組織や器官の末梢免疫系と植民地化。胎児胸腺器官培養物を、E13前駆細胞はすべてに急速に発展し、CD3 +細胞に成熟することを明らかにした樹状上皮T細胞として知られている標準的なγδのT細胞サブセット、を生じました。対照的に、E18の前駆細胞は分化遅延を有し、樹状上皮T細胞を生成することができませんでした。 / - -胸腺移植されたCD3の末梢血のモニタリングマウスはさらにE18の胸腺沈降前駆細胞は、時間の経過とともに、短期的胎児胸腺に理解することができなかった機能をそのE13の対応よりも成熟T細胞のより大きな数を生成することを示しました器官培養。
Introduction
Tリンパ球は、αβまたはγδT細胞受容体（TCR）を有する、特殊な器官における胸腺を区別する。十分に発達した胸腺は、2つの異なる領域で構成されています。生産性のTCRβおよびα鎖遺伝子を再配置胸腺細胞がプログラム死（正の選択として知られるプロセス）から救出された胸腺前駆細胞の開発皮質、および;自己リガンドに強すぎる反応性を有する胸腺細胞を選択した髄質は、（負の選択）1,2削除されます。胸腺は、後に間葉細胞3に囲まれている第三の咽頭嚢の内胚葉層に由来します。これは、胎生E12から始まる造血前駆細胞が定着され、その後、連続的な動員は、通常のT細胞の発生4に必要とされます。胸腺の移民が開始され、厳密に調節されたプログラムによって編成、連続した発達段階を経て進化し、舞そのリガンドとの相互作用時に胸腺細胞のNotchシグナル伝達経路の活性化によってntained、4のようなデルタ、胸腺上皮細胞（のTEC）上に発現5。
胸腺細胞の開発は、いわゆるCD4で始まる- CD8 -ダ ブルネガティブ（DN）の段階。 、DN2（CD25 + CD44 +）、DN3（CD25 + CD44 - ）とDN4（CD25 - CD44 - ） - DN胸腺細胞は、さらにDN1（CD44 + CD25）へのCD25およびCD44の発現に応じて分割することができます。 CD24（HSA）およびCD117（c-キット）をさらにDN1aとbが早期胸腺前駆細胞（ETP）に対応する5サブセットにDN1区画を細分化。胸腺細胞は、DN段階でのTcRδ、βおよびα鎖の配置を変更し、前のTCR選択（DN3-DN4ステージを）受けます。のTCRα鎖は、正と負のSELEの前に並べ替えて、CD4 + CD8 +ダブルポジティブ（DP）区画への彼らは、さらにトランジットction。この段階では、ほとんどの胸腺細胞は排除され、わずかな割合（3〜5％）は、CD4 +またはCD8 + T細胞コンパートメント成熟到達します。
リンパ分化経路は、多能前駆細胞（MPP）と赤血球と巨核球6の可能性を失ったリンパプライミング多能性前駆細胞（LMPP）を生成するHSCの段階を経て進行します。 （C-キット（CD117）の発現、SCA-1とのFlt3 / Flk2は（CD135）およびインターロイキンの検出可能なレベルの不在- LMPPは、表現型（林は、系統が負）分化した血液細胞マーカーの不在によって定義されていますIL）-7受容体α鎖（IL-7RαまたはCD127）。 LMPPsはさらにその段階によって、骨髄細胞を生成する能力を失っていることを共通のリンパ系前駆細胞（CLP）7へと分化します。 CLPは、リンパ球（B細胞およびT細胞）、NK細胞、DCおよび先天性リンパ系細胞（ILC）の可能性を保持し、CD1の発現によりLMPP異なります27とSCA-1の高レベルの不在。
前駆細胞を沈降胸腺（TSP）の性質は広範囲に8を議論されてきたが、それは開発9を通じて、TSP変更表現型、分化能および機能ことが最近明らかになりました。我々は、E13（第一波）またはE18（第2波）のいずれかからFACS選別細胞による孤立し、TSPを特徴づけるために、in vitroおよびin vivoアッセイを行いました。異なるアロタイプマーカーを有するE13とE18前駆細胞の同数の植民地照射胸腺葉を持つ胎児胸腺器官培養（FTOC）は、同様の発達の環境でそれらの子孫以下の許可および前駆細胞の両方のタイプの間で異なる細胞固有の特性を明らかにしました。 E13やE18 TSPのいずれかによって植民地化胸腺ローブが原因で両方の前駆体との間の競合に選択せずに開発を可能にした。コロニー形成胸腺葉のインビボ移植、さらにまた、Tことが示されました彼は、 インビボで異なる生物学的特性を有するE13とE18 TSPの子孫を成熟します。最初の波からのTSPは、急速にT細胞を生成するが、αβおよびγδT細胞の数が少ないを生じさせます。後者の中、私たちは不変TCRは、それらは創傷治癒における機能を発揮し、唯一の胚発生の10の間に生成され、表皮に移行していVγ5Vδ1樹状上皮T細胞（DETC）を検出しました。対照的に、第二波のTSPは、TCR + T細胞の高い数を生成するために時間がかかり、DETCを生成することができません。
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Protocol
倫理文：すべての実験は、パスツール研究所の倫理憲章に従って行わフランス農業省によって承認され、EUのガイドラインに。農業のフランスの省によって認定小齧歯類手術の訓練を受けたマニピュレータは、すべての外科的処置を行います。
注：5段階の計画手順を示す附属書表1に参照してください。
胚の1選択
- 36 C57BL / 6 CD45.2の女性、12人の女性のCD45.1、12 C57BL / 6 CD45.1の男性と12 C57BL / 6 CD45.2の男性を使用してください。いずれかの男性の遺伝子型と雌を交配すると、胚CD45.1 / 2およびCD45.1を生成する受信者の胸腺葉のソースとして使用TSPまたはCD45.2のソースとして使用。ハウス個別にすべての男性。
- E18 TSP分離のための胚を得るために、21日グラフト実験の前に、午後6時に1人の男性CD45.1とケージに2人の女性を配置します。正午前に、次の日の膣栓の存在を確認してください。 SEPA差し込ま女性を評価します。
- TSPによって植民地化されるE14胚を得るために、17日グラフト実験の前に、男性のCD45.2を使用して、（1.2）には、上記の手順を繰り返します。
- E13 TSPを単離するための胚を得るために、16日間のグラフト化実験の前に、雄C57BL / 6 CD45.1を使用して、（1.2）上記の手順を繰り返します。
水平層流フードの下で胚の2解剖
注：グラフト実験前二日。
- 飽和密室で、少なくとも5分の間に頸部脱臼によりまたはCO 2ガスの漸進的な投与によって妊娠した雌を生け贄に捧げます。心肺運動の決定的な逮捕によって死を確認してください。 70％エタノールで腹部を濡らします。
- 正中腹部の皮膚に縦切開を行い、離れて、皮膚を引っ張ってそれを開きます。消化管に触れることなく鉗子とハサミで腹膜を開きます。ビフィズスのuterを引き出し私たちとハサミで膣から分離。
- 40〜50ミリリットルのDPBSを含む90×15ミリメートルペトリ皿に子宮を置き、各胚の脱落膜の間に横方向に切断しました。
- 先端の細いハサミや微細な鉗子で、子宮の筋肉膜を除去胎盤および卵黄嚢との間で切断して胚を取り出して、胚を保持さamniosを、削除してください。
- ペトリ皿に胚を置きHBSS + 1％ウシ胎児血清を含む90×15ミリ（FCS）。 E15よりも古い胚のために、任意のさらなる解剖前にハサミで頭部を削除します。
胸腺の3分離
- 双眼拡大レンズの下では、湿ったガーゼ寝具に、仰臥位（腹ビュー）に横たわって、胚を配置します。
- 胸部グリッドをつまんで開き、胸骨の軟骨に沿って長手方向に1鉗子を挿入します。湾曲鉗子で、Tを可視化するために確保胸壁を引きます気管の両側にハイミックローブ。
- 慎重に微細な鉗子でつまんで下の各葉を保持し、1ミリリットルのHBSS + 1％FCSを含有するペトリ皿に置きます。ローブを分離し、カプセルに損傷を与えることなく、2 1ミリリットルのシリンジ+ 26 G⅜「針で周囲の結合組織を除去。
- 血液細胞を除去するためにHBSS + 1％FCS 3mlにローブを洗います。
注：E15の前に、胸腺ローブが二肺葉臓器を構成する途中で気管以降ヒューズの両側に配置されています。
4.細胞懸濁液
- HBSS + 1％FCSで1ミリリットルの注射器に取り付けられた2つの26 G針で、双眼拡大レンズの下でローブを離れていじめます。ナイロンメッシュを通して細胞懸濁液をフィルタリングします。
5.蛍光抗体で染色し、細胞選別
注：すべての抗体は、以前に集団の最適な定義を得るために滴定する（titratイオン）は、抗体のバッチで変化させることができます。
- 系統陽性細胞を染色するために、ビオチン化抗体のカクテル100μlを4℃で15〜30分間、胸腺細胞（E13またはE18）をインキュベートする（抗CD19、抗群Gr1、抗TER119、抗NK1.1 、抗CD11cの、抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD25）。
- 離れて抗体を過剰に洗浄するために7分間280×gで4ミリリットルHBSS + 1％FCSでチューブをスピンダウンし、上清を、新鮮なHBSS + 1％FCS中に再懸濁したペレットを除去します。遠心分離を繰り返します。
- 4℃で15分間、ストレプトアビジンビーズとE18のビオチン標識された細胞をインキュベートし、HBSS、1％FCSで細胞を2回洗浄します。 2ミリリットルのHBSS + 1％FCSで細胞を再懸濁します。ほとんどのE13胸腺細胞は、系統陰性であり、従って、細胞選別の前にMACS濃縮を必要としません。
- 製造業者の説明書に従って、LSカラム上で細胞を渡します。すべての細胞懸濁液が入ったとき、カラムを2mlのHBSS + 1％FCSを追加します。回復しますカラム4mlを280×gで7分間、細胞を通って流れ、遠心。
- 枯渇E18またはTSP抗体ミックス（抗CD117 APC50μlの総E13の胸腺細胞、抗CD135 PE、抗CD127 PECy7、抗CD24 FITC、抗CD44 APCCy7とストレプトアビジンパシフィックブルーのいずれかのペレットを再懸濁）、暗所で4℃で20分間インキュベートします。
- 4ミリリットルHBSS + 1％FCSとで細胞を洗浄する1ミリリットルHBSS中にヨウ化プロピジウムでの+ 1％FCSに細胞を再懸濁。
- ソートのTSP林- 200μlの完全培地+ 20％FCSを含む1.5 mlチューブの上に（4レーザーで）FACSにおけるCD44 + CD117 + CD24 低 CD127 + CD135 +細胞。 FSCおよびSSCチャンネルでそれらのサイズおよび粒度に応じて第1のセルのゲート。 （ヨウ化プロピジウムで染色）死細胞、ゲートアウトダブレットを排除し、指数関数的なスケールで蛍光をスコア。 100または600の周りのTSPは、1 E13やE18 1胸腺、respectivから得ることができますエリー。
前駆細胞とE14胸腺ローブの6植民地：ハンギングドロップ法
- （30グレイ= 30 Gyの）CD45.2胚からE14胸腺葉、文化の前に3時間を照射します。
注：E14またはE15胸腺ローブは正常T細胞前駆細胞のレシピエントとして使用されています。以前の妊娠日目の胸腺ローブがおそらく上皮細胞の不完全な発展に、不十分ながら開発による臓器の大きいサイズに早期の壊死の後の妊娠日の結果の受信者胸腺葉を使用しました。 - 遠心のTSPと再サスペンド細胞培養培地中で（10％FCSを含むOPTI-MEM完全培地、ペニシリン（50単位/ ml）、ストレプトマイシン（50μg/ ml）および2βメルカプトエタノール（50μM））をソートし、その結果35 μlの500 TSPが含まれています。
- 60ウェルテラサキプレートの他のすべてのウェルの細胞懸濁液の35μlのドロップを置きます。
注：これらは連続したウェルに入れている場合は35μlの滴が融合することができます。 - 各液滴の表面に1照射ローブを配置します。テラサキプレートを閉じて、細胞が重力によって落下の頂端極に到達できるように逆さまにプレートを回します。
- ドロップの頂端縁にスライドするようにローブを強制的に穏やかに反転板の上側を押してください。 37℃+ 5％CO 2で48時間、加湿インキュベーターで反転テラサキプレートをインキュベートします。植民地化した後、培養E14 FTOC 7で胸腺、または受信者の成体マウス8の腎臓被膜下に移植片のいずれか。
7.胎児胸腺器官培養
- 35ミリメートルペトリ皿の上に完全培地の3ミリリットルを置きます。媒体上に浮上isopore膜フィルターを置きます。鉗子（1膜上を超えない8ローブ）を有する膜の端に再構成されたローブを配置します。
- ウォートの2ミリリットルを含む、カバーなし、35mm皿と一緒に、90ミリメートルのペトリ皿の内側に胸腺葉を含むペトリ皿を置きます最適な湿度を確保するために、R。 37℃+ 5％CO 2で12日間インキュベートします。
無菌条件下での腎臓被膜下移植片8
注：腎実質はカプセルを形成する結合組織に囲まれています。サブ莢領域は、血液、それによって移植片の開発に適した環境（ 例えば胸腺葉、膵島または新生児の心）を提供するリンパ管において特に豊富です。それは右腎よりもアクセス可能であるため、移植片は、通常、左の腎臓で行われています。 CD3 - / -雄マウスはE15の前にセックス決意を容易に行われないため、受信者は、このように起因するY染色体にリンクされているマイナー組織適合性抗原に対する宿主反応、移植片対を回避として使用しました。
- 楽器を殺菌し、手術に沿って滅菌手袋を着用してください。ケタミン10 mg / mlのキシラジン+ 1ミリグラム/溶液の腹腔内注射によりマウスを麻酔mlをPBS中に希釈した（体重10gあたり50〜100μl）を、1mlシリンジを使用して。すだれ状反射の欠如をチェックすることによって麻酔を確認してください。麻酔中の乾燥を防ぐために、それぞれの目にハイドロOptimuneゲルのドロップを置きます。
注：ソリューションは、即座に調製し、注射前に室温で温めする必要があります。麻酔は、少なくとも20分間持続します。麻酔の程度は、すべての手術に沿って制御されるべきです。麻酔は、20分毎に半分の用量の腹腔内注射することにより延長することができます。 - 水平ラミナフローフード下で、その右側にマウスを置きます。 70％エタノールおよび10％ヨウ化真皮溶液で手術領域を滅菌します。鉗子部とだけ後肢の関節上記2cmの長さに沿ってマウスの毛。手術領域を剃ります。
- メスで、最初の切開1.5センチメートル長を行い、皮膚組織は、その後はさみで筋肉組織を切断します。切開の両側にわずかな圧力を適用します、腹腔から腎臓を強制れます。
- 湿った腎臓を維持するために綿芽で生理食塩水を適用します。あなたは臓器を露出させることは困難である場合は、腎臓が接続されている周囲の脂肪細胞組織を引き出すために平らなピンセットを使用しています。臓器の下に配置された綿棒により後腹膜腔から腎臓を維持します。
- 2細かい鉗子で、カプセル2-3ミリの穴を作る（出血を防ぐために実質を触れないように注意してください）。全体の外科的処置の間に連続的に湿らせた露出された腎臓カプセルを保持します。
- 開かれたカプセルの壁を維持することによって、腎臓被膜下に慎重ローブを挿入し、エッジの極に向かって被膜下移植片をスライドさせます。腎臓あたり6ローブまで置きます。
- レトロ腹腔内に腎臓を交換してください。筋腱膜、個々の外科医の結び目と、その後皮膚を縫合。 10％ヨウ化ポビドン溶液で傷を濡らします。加熱されたPAの上にマウスを置きます37℃でD。
- 心臓、呼吸器およびウィスカの動きの制御により、麻酔から完全に回復するまで、移植マウスを調査、自己から見た完全に回復するまでの粘膜の色が動きを含んでいました。
注：私達はちょうど手術後の痛みを防止するために、手術後の手術と2日後に鎮痛剤溶液（Buprenorphin、0.1ミリグラム/ kg）を筋肉内注射することをお勧めします。 - 完全に回復するまで、単独で動作する動物を保管してください。確認し、感染を防止するために、一日おきに、創傷のステッチを点検します。この手順に従って、創傷感染を観察することはありません。
注：CD3から末梢血細胞の週刊分析- / -グラフトされたマウスは、私たちが由来集団はCD45アロタイプマーカーおよびT細胞系列特異的抗体（ 図3）を使用して、E13やE18前駆細胞のいずれか由来の胸腺を検出することを可能にします。
フローサイトメトリーによるTSPの子孫の9分析
- CD45.1 PECy7、CD45.2 AmCyan、CD4 APCCy7、CD8 APC、CD3パシフィックブルー、Vγ5FITC、Vδ1PEとセクション5で説明したようにインキュベートを認識する抗体を含む抗体混合物と個々のローブからステイン細胞懸濁液。
- 再懸 濁（ 図2の結果を参照してください）HBSS + 1％FCS +ヨウ化プロピジウムで細胞を、フローサイトメーターで分析します。
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Representative Results
コロニー形成前駆細胞の最良の開発を可能にする内因性胸腺細胞の胸腺葉を枯渇させる方法を選択するために、我々は、照射後にコロニー形成胸腺葉におけるT細胞再構成のレベルまたは5日間のデオキシグアノシン（D-Guaの）治療を比較しました。結果は、照射後のT細胞の発生を得るために、D-Guaの治療よりも適切であり、培養の9日目に差がないが、照射されたローブがこのように12日目に、D-Guaので処置したものよりも多くのT細胞を含有することを示し胸腺植民地化（ 図1）。 E13とE18 TSPの発生可能性を研究するために、我々は、E14は、前駆細胞の2つのタイプの同数の混合物で胸腺ローブを照射植民地化。結果は、E13のTSPは対照的に、E13 TSPがDETCを生成し、CD3の高い周波数+細胞 （ 図2）成熟し、より少ない胸腺細胞およびE18 TSP未満のDPを生じさせるが、ことを示しています。 in vivoで鍋を分析するために、- / -レシピエントE13とE18 TSPのentialは、前駆細胞の各タイプを保菌胸腺ローブがCD3の腎臓被膜下に移植しました。結果は、FTOCと一致して、E13 TSPが速くE18前駆細胞よりもT細胞を生じさせたが、循環するT細胞の数（ 図3）は有意に低かったことを示しています。
図1：T細胞の開発は、胸腺ローブを植民地化し、デオキシグアノシン処理されたよりも照射でより効率的である E14胸腺ローブ（CD45.2）は30 Gyのが照射またはデオキシグアノシン（D-瓜）で5日間処理のいずれかでした。フィルター上の48時間培養のドロップをぶら下げで、CD45.1 / 2胚から単離されたCD117 + SCA-1 +（LSK）E14 FL細胞-胸腺葉は、その後、1000年林が定着しました。差異は、ENの効率で観察されませんでした胸腺葉の2つの群の間のdogenous胸腺細胞の枯渇。 CD45.1、CD45.2、CD3、Vγ5、Vδ1およびCD4に対する抗体で染色した胸腺細胞は、9日目、FACSによって12で分析した開発。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2：E18とは対照的に、E13のTSPはVγ5Vδ1DETCを生成 CD45.2の胸 腺ローブがCD45.1 / 2胚およびCD45.1胚から500 E18 TSPから500 E13 TSPの混合コホートで48時間照射し、植民地化されました。 。これらの実験条件下では、E13及びE18 TSPは同じ環境および分化の速度に差が発展し、培養後に観察されたT細胞のサブセットのみがセル固有の生物学の相違を反映することができる成熟しますプロパティ。 12の後、個々の葉からの培養胸腺細胞内の日数はサイトメトリーCD45.1、CD45.2、CD4、CD8、CD3、Vγ5、Vδ1を認識する抗体で染色した後、流れによって分析しました。 （A）パネルは、各葉に回収された細胞の数を示します。 （B）のプロフィール代表的なフローサイトメトリー。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3：E13のTSPは、E18のTSPよりも速くを開発 CD45.2の胸 腺ローブがCD45.1胚から500 E13 TSPまたは500 E18 TSPと48時間照射し、植民地化されました。 CD3 - / -マウスはE13やE18のTSPのいずれかを保菌4胸腺葉に移植しました。末梢血を週間隔で収集し、DOについてFACSにより分析しましたも（CD45.1）CD3 + T細胞。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
| ステップ1 | E18胚（日-21）を取得するために、マウスを交配。 E14胚（日-17）を取得するために、マウスを交配。 E13胚を得るために、マウスを交配（日-16） | ||
| ステップ2a | 胚の解剖、日-2 | ||
| ステップ2b | E14胸腺ローブの照射、日-2 | ||
| ステップ2C | 準備、染色、およびE13とE18の胸腺葉から細胞を選別、日-2 | ||
| 手順2d。 | ハンギングドロップ培養、日-2 | ||
| ステップ3a | 胎児胸腺器官培養、0日目 | ||
| ステップ3b | 腎臓被膜下に移植片、0日目 | ステップ4 | FTOC：フローサイトメトリー分析、12日目 |
| ステップ5 | グラフト：T細胞の循環毎週フローサイトメトリー分析、日15、22、35 |
表1：5段階の手順がグラフトしたマウスの解析までの異なるマウス系統の交配から実験の実験時間表に続きます 。移植片は、7週齢のマウスで行われます。 E13胚を得るために、E14胚を得るために、一日-21はE18胚を得るために、マウスの交配で、0日として日-16日-17を移植する時間を割いて、日中-2 E13とE18 TSPのソートを、照射胸腺葉と懸滴技術。
| 抗体 | クローン番号 | 抗体 | クローン番号 | |
| CD25 | 7D4 | CD19 | 6D5 | |
| CD44 | IM7 | テル119 | TER-119 | |
| CD24 | M1 / 69 | NK1.1 | PK 136 | |
| CD117 | 2B8 | のCD11c | HL3 | |
| CD3 | 145-2C11 | GR1 | RB6-8C5 | |
| CD4 | RM4-5 | GD | eBioGL3 | |
| CD8 | 53-6.7 | SCA-1 | D7 | |
| CD135 | A2F10 | CD45.2 | 104 | |
| CD127 | A7R34 | Ly5.1 | A20 |
表2：抗体およびクローン番号。
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Discussion
二つの主なアッセイは、ex vivoでのT細胞分化を分析するために使用することができます。最も最近報告Noth1、1または4〜12のようなデルタのリガンドを発現し、OP9 BMストローマ細胞と造血前駆細胞の共培養である。この2-Dアッセイは、実施が容易で、非常に効率的で敏感であり、可能分析で単一細胞レベル。しかし、いずれも、胸腺上皮との直接的な相互作用を必要とし、どちらもDPの段階でもγδDETC 13の世代を越えT細胞の開発をサポートしています。
FTOCs長いT細胞の発達3を分析するために使用されてきました。このアッセイの主な強みは、すべての生成がT細胞コンパートメント、胸腺上皮で胸腺細胞の効率的な3次元相互作用によって付与されたプロパティを成熟させること。そこで我々は、外因性前駆細胞による効率的な定着を可能にする、ここで、現在、内因性の胸腺細胞を枯渇させるために使用される2つのメソッドをテストしました。電離放射線照射とデオキシグアノシン治療の両方を効率的に胸腺細胞の開発を枯渇しました。しかし、唯一の照射胸腺葉がd-Guaの処置はまた、上皮区画のコンポーネントに影響を与える可能性があることを示唆している時間の長い期間のための堅牢なT細胞の発生を持続しました。胚胸腺ローブが「ハンギングドロップ」の方法を使用して、外因性前駆細胞が定着しました。競争の中で両方の集団を照射ローブの植民地は、異なる細胞自律的な生物学的特性を検出することができます。 TSPサブセットの唯一の保菌は、非競争的な環境での分化能を明らかにする。
この方法の欠点は、OP9Dl共培養14と比較して、T細胞に発達するTSPの周波数で低い効率です。しかし、我々は近い間質細胞で得られたものに効率的に個々の胸腺葉を植民地化するために、単一のDN1またはDN2細胞を行っています。 10倍reductioFLまたはBM造血前駆細胞は、培養物のようなOP9デルタでは観察されないFTOCために使用される場合、N T細胞産生の効率に見出されます。これより少ない効率的な開発は、T細胞の可能性のあるすべてのBMまたはFL細胞が胸腺を植民地化することができないことを示唆しています。
植民地化胸腺葉をグラフトすることFTOCよりも胸腺の開発に、より良い栄養と酸素の供給、およびin vivoで 、TSPの子孫の運命を追跡する可能性を提供しています。これら2つの合成戦略を使用して、我々は、分化とのTSPの子孫の機能ポテンシャルの手順を記述することができます。 - / - CD3ので成熟T細胞を開発することはできませんマウスCD45.2 15、我々はCD45アロタイプの違いと一緒に、宿主として使用された可能性があり、明確に彼らの自然な環境で新たに生成されたT細胞に従ってください
ここに記載の実験手順の新規な態様再構成FTOCの組み合わせですin vivoでの移植と。これは、造血前駆細胞の定義されたサブセットの子孫を識別し、トレース可能にしました。我々は、第一および第二の波からTSPはγδT細胞の異なるサブセット、αβT細胞の異なる数を生成し、分化の異なる動態を有することを見出しました。
胚の段階：0日目は、プラグ検出に応じて、マウスの交配後の18時間であると考えられます。胸腺の解剖は、良好な冷光150 W、両眼解剖顕微鏡や解剖、麻酔および移植手順のためのいくつかの練習が必要です。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。
Acknowledgments
パスツール研究所、INSERM、アジャンス国立デRECHERCHE ANR（グラント「リンパ球」）、REVIVE今後の投資計画と「contreルがんラ·リーグ」でサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture Petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26 G ⅜" 0.45 x 10 mm syringes with needles | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility actions |
| Ketamine 100 mg/ml (stock solution) | MERIAL | Anesthesic | |
| Xylazine 100 mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3 mg/ml stock solution | AXIENCE | Morphinic analgesic | |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | Eye protection | |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fetal calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2-Mercaptoethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine iris scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps: Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| 2 pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1x270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5 x 7.5 cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
- Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu Rev Immunol. 26, 355-388 (2008).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Douagi, I., Andre, I., Ferraz, J. C., Cumano, A. Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation. Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).
- Calderon, L., Boehm, T. Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments. Cell. 149, 159-172 (2012).
- Adolfsson, J., et al. Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment. Cell. 121, 295-306 (2005).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26, 678-689 (2007).
- Ramond, C., et al. Two waves of distinct hematopoietic progenitor cells colonize the fetal thymus. Nat Immunol. 15, 27-35 (2014).
- Allison, J. P., Havran, W. L. The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors. Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Barbee, S. D., et al. Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 3330-3335 (2011).
- Douagi, I., Colucci, F., Di Santo, J. P., Cumano, A. Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver. Blood. 99, 463-471 (2002).
- Malissen, M., et al. Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene. EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).
