Abstract
تميز التوتة تسوية الأسلاف من المهم أن نفهم مراحل ما قبل الغدة الصعترية التنمية الخلايا T، ضرورية لوضع استراتيجيات لT استبدال الخلايا في المرضى الذين يعانون lymphopenic. درسنا التوتة تسوية الأسلاف من الفئران الجنينية يوم 13 و 18 التوتة من قبل اثنين من تكميلي في المختبر وتقنيات الجسم الحي، سواء على أساس "شنقا قطرة" الأسلوب. يسمح هذا الأسلوب استعمار المشع فصوص الغدة الصعترية الجنين مع E13 و / أو E18 الأسلاف الغدة الصعترية تتميز CD45 علامات النمط الخيفي وبالتالي التالية ذريتها. الاستعمار المختلطة السكان يسمح تحليل الخلايا الخلافات الحكم الذاتي في خصائص بيولوجية من الأسلاف في حين الاستعمار سواء مع السكان يزيل ضغوط انتقائية تنافسية الممكنة. ويمكن أيضا أن فصوص الغدة الصعترية المستعمر أن المطعمة في الفئران المتلقي الذكور العوز المناعي يسمح للتحليل ناضجة الخلايا التائية ذرية في الجسم الحي، مثل ديناميات السكان رانه الطرفية جهاز المناعة، واستعمار الأنسجة والأعضاء المختلفة. كشفت الجنين الثقافات الجهاز الغدة الصعترية أن الأسلاف E13 تطورت بسرعة في جميع تنضج CD3 + الخلايا، وأدت إلى الكنسي فرعية الخلايا T γδ، والمعروفة باسم خلايا T الظهارية الجذعية. في المقابل، الأسلاف E18 لها تمايز وتأخر وكانت قادرة على توليد خلايا الظهارية T الجذعية. وأظهرت الفئران أيضا أن الأسلاف E18 التوتة تسوية تولد، مع مرور الوقت، أعداد أكبر من الخلايا الناضجة T من نظرائهم E13، وهي الميزة التي لا يمكن تقديره في التوتة الجنين على المدى القصير - رصد الدم المحيطي من المطعمة الغدة الصعترية CD3 - / ثقافات الجهاز.
Introduction
اللمفاويات التائية، التي تحمل αβ أو γδ الخلايا التائية مستقبلات (TCR)، تفرق في جهاز متخصص، والغدة الصعترية. ويتم تنظيم الغدة الصعترية كاملة النمو إلى منطقتين متميزتين: القشرة، حيث تتطور الأسلاف الغدة الصعترية، وحيث يتم إنقاذ thymocytes أن إعادة ترتيب الخلاق للβ TCR والجينات سلسلة α من الموت المبرمج (وهي عملية تعرف باسم الانتقاء الإيجابية)؛ والنخاع، حيث المختارة thymocytes مع تفاعل قوي جدا لبروابط الذاتي يتم حذف (اختيار السلبية) 1،2. الغدة الصعترية تنبع من طبقة الأديم الباطن من الحقيبة البلعوم الثالثة التي تحيط وقت لاحق من خلايا اللحمة المتوسطة 3. واستعمرت من قبل الأسلاف المكونة للدم ابتداء من يوم الجنينية E12، وبعد ذلك مطلوب التوظيف المستمر لT العادي تطوير خلية 4. المهاجرين الغدة الصعترية تتطور من خلال مراحل النمو المتعاقبة، مدبرة من قبل برنامج منظم بإحكام، بدأت ومايو ntained من خلال تفعيل إشارات المسار الشق على thymocytes على التفاعل مع يجند لها، مثل دلتا 4، أعرب عن الخلايا الظهارية الغدة الصعترية (TECS) 5.
تبدأ تطوير خلية توتية في ما يسمى CD4 - CD8 - النفي المزدوج (DN) مراحل. thymocytes DN يمكن تقسيم كذلك وفقا لتعبير عن CD25 CD44 وإلى DN1 (CD25 - CD44 +)، DN2 (CD25 + CD44 +)، DN3 (CD25 + CD44 -) وDN4 (CD25 - CD44 -). CD24 (هائل سعيد أنعم) وCD117 (ج كيت) يقسم كذلك مقصورة DN1 إلى 5 مجموعات فرعية حيث DN1a وب تتوافق مع الأسلاف الغدة الصعترية في وقت مبكر (ETP). Thymocytes إعادة ترتيب TCR δ، β α والسلاسل في مرحلة DN وتخضع قبل TCR اختيار (مراحل DN3-DN4). انهم عبور أخرى إلى CD4 + CD8 + إيجابية مزدوج (DP) حجرة حيث تعيد ترتيب سلسلة α TCR قبل سيلي الإيجابية والسلبيةction. في هذه المرحلة يتم استبعاد معظم thymocytes وفقط نسبة صغيرة (3-5٪) تصل إلى CD4 + أو CD8 + T مقصورة تنضج الخلية.
تمايز مسار اللمفاوية تقدم من خلال مراحل HSCs التي تولد الأسلاف متعدد القدرات (MPP) والأسلاف معبي اللمفاوية متعددة القدرات (LMPP) التي فقدت كرات الدم الحمراء والنواء المحتملين 6. يتم تعريف LMPP ظاهريا بسبب عدم وجود علامات خلايا الدم متباينة (النسب السلبية، لين -)، والتعبير عن ج-كيت (CD117)، هيئة السلع التموينية، 1 وFlt3 / Flk2 (CD135) وعدم وجود مستويات ملحوظة من انترلوكين ( IL) -7 مستقبلات α سلسلة (IL-7rα أو CD127). LMPPs تمييز الى مزيد من الأسلاف المشتركة اللمفاوية (CLP) 7 أنه من خلال تلك المرحلة قد فقدت القدرة على توليد خلايا الدم النخاعي. CLP الاحتفاظ الخلايا اللمفاوية (B والخلايا التائية)، الخلايا القاتلة الطبيعية، DC والخلايا اللمفاوية الفطرية (ILC) المحتملة، وتختلف عن LMPP عن طريق التعبير عن CD127 وعدم وجود مستويات عالية من هيئة السلع التموينية-1.
على الرغم من أن طبيعة التوتة تسوية الأسلاف (TSP) قد نوقشت على نطاق واسع 8، أصبح من الواضح مؤخرا أن تغيير النمط الظاهري TSP، إمكانية التمايز وظيفة، في جميع أنحاء تنمية 9. أجرينا في التجارب المختبرية وفحوصات الجسم الحي لتوصيف TSP المعزولة FACS الخلية الفرز من أي E13 (الموجة الأولى) أو E18 (الموجة الثانية). الجنين الثقافات الجهاز الغدة الصعترية (FTOC) مع فصوص الغدة الصعترية المشع مستعمرة من قبل أعداد متساوية من E13 E18 والأسلاف، واضعا علامات النمط الخيفي مختلفة، سمح التالية ذريتهم في بيئة تنموية مماثلة وكشف خلية الخصائص الجوهرية، مختلفة بين كلا النوعين من الأسلاف. فصوص الغدة الصعترية التي استعمرتها إما E13 أو E18 TSP سمحت تنمية دون انتقاء بسبب المنافسة بين كل من الأسلاف. أظهر في الجسم الحي زرع فصوص الغدة الصعترية المستعمرة كذلك أن أيضا رانه ذرية ناضجة من E13 E18 وTSP دينا مختلف الخصائص البيولوجية في الجسم الحي. TSPs من الموجة الأولى تولد بسرعة خلايا T ولكن تؤدي إلى انخفاض أعداد αβ وγδ الخلايا التائية. بين هذا الأخير اكتشفنا Vγ5Vδ1 الخلايا الجذعية الظهارية T (DETC)، التي لها TCR ثابتة، تهاجر إلى البشرة حيث تمارس وظيفة في التئام الجروح ويتم إنتاجها فقط أثناء التطور الجنيني 10. في المقابل، TSP من الموجة الثانية يستغرق وقتا أطول لتوليد أعداد كبيرة من الخلايا TCR + T وغير قادر على توليد DETC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق: تم إجراء جميع التجارب وفقا لميثاق أخلاقيات معهد باستور، التي وافقت عليها وزارة الزراعة الفرنسية، والمبادئ التوجيهية للاتحاد الأوروبي. A تتلاعب مع التدريب على جراحة القوارض الصغيرة، ومصدقة من وزارة الزراعة الفرنسية، ويؤدي جميع التدخلات الجراحية.
ملاحظة: انظر الجدول 1 في المرفق يبين الإجراء خطة 5 خطوات.
1. اختيار الأجنة
- استخدام 36 C57BL إناث / 6 CD45.2، 12 من الإناث CD45.1، 12 C57BL / 6 ذكور CD45.1 و 12 C57BL / 6 ذكور CD45.2. سوف عبور الإناث مع الذكور إما الوراثي إنتاج أجنة CD45.1 / 2 و CD45.1 تستخدم كمصدر للTSP أو CD45.2 تستخدم كمصدر للمتلقي فصوص الغدة الصعترية. بيت كل الذكور على حدة.
- للحصول على الأجنة لE18 TSP العزلة، ضع 2 الإناث في قفص مع CD45.1 واحد من الذكور في 06:00، قبل 21 يوما من التجربة التطعيم. تحقق من وجود المكونات المهبلي في اليوم التالي، قبل الظهر. سيبامعدل الإناث توصيله.
- للحصول على الأجنة E14 أن استعمرها TSP، كرر الإجراء أعلاه (1.2)، وذلك باستخدام الذكور CD45.2، قبل 17 يوما من التجربة التطعيم.
- للحصول على الأجنة لعزل E13 TSP، كرر الإجراء أعلاه (1.2)، وذلك باستخدام الذكور C57BL / 6 CD45.1، قبل 16 يوما من التجربة التطعيم.
2. تشريح الأجنة تحت أفقي تدفق رقائقي هود
ملاحظة: قبل التجربة تطعيم يومين.
- التضحية الإناث الحوامل خلع عنق الرحم أو عن طريق إدارة التدريجي للCO 2 الغاز خلال 5 دقائق على الأقل، في غرفة مغلقة تشبع. ضمان الموت بالتوقيف النهائي لحركات القلب والجهاز التنفسي. الرطب في البطن مع الايثانول 70٪.
- إجراء شق طولي في الجلد في البطن خط الوسط وفتحه عن طريق سحب الجلد على حدة. فتح الصفاق مع ملقط ومقص دون لمس الجهاز الهضمي. سحب uter أشرملنا وفصلها من المهبل مع مقص.
- وضع الرحم في 90 × 15 مم طبق بتري تحتوي على 40-50 مل DPBS وقطع عرضيا بين الساقط كل الجنين.
- مع زوج من مقص طرف الجميلة وملقط غرامة إزالة الغشاء العضلي للرحم، واخراج الأجنة عن طريق قطع بين المشيمة والكيس المحي، وإزالة amnios التي الإبقاء على الأجنة.
- وضع الأجنة في طبق بيتري 90 × 15 ملم تحتوي على HBSS + 1٪ مصل العجل الجنين (FCS). لأجنة مضى عليها أكثر من E15، وإزالة الرؤوس مع زوج من مقص قبل أي تشريح آخر.
3. عزل من الغدة الصعترية
- تحت العدسة المكبرة مجهر، ووضع الجنين، والكذب في موقف ضعيف (عرض البطني)، على الفراش الشاش الرطب.
- أدخل أحد ملقط طوليا على طول غضروف القص، قرصة وفتح شبكة الصدري. بالملقط المنحنية، وسحب الجدار الصدري جانبا لتصور رفصوص hymic على كل جانب من القصبة الهوائية.
- عقد بعناية كل فص من قبل معسر تحت مع ملقط غرامة ووضعها في طبق بتري تحتوي على 1 مل HBSS + 1٪ FCS. عزل الفصوص وإزالة الأنسجة المحيطة الضام مع اثنين من 1 مل الحقن + 26 G ⅜ "الإبر، دون الإضرار الكبسولة.
- غسل فصوص في 3 مل من HBSS + 1٪ FCS للقضاء على خلايا الدم.
ملاحظة: قبل E15، تقع فصوص الغدة الصعترية على كل جانب من القصبة الهوائية والصمامات لاحق في الوسط لتشكل جهازا ثنائية فصي.
4. الخلية تعليق
- ندف بصرف النظر فصوص تحت العدسة المكبرة مجهر، مع اثنين من الإبر 26 G التي شنت على 1 مل الحقن، في HBSS + 1٪ FCS. تصفية تعليق الخلية من خلال شبكة من النايلون.
5. تلطيخ مع الفلورسنت الأجسام المضادة وفرز الخلايا
ومعاير جميع الأجسام المضادة في السابق للحصول على التعريف الأمثل للسكان (وtitrat ملاحظة:أيون يمكن أن تختلف مع الدفعة الضد).
- احتضان thymocytes (E13 أو E18) ل15-30 دقيقة على 4 درجات مئوية مع 100 ميكرولتر من مزيج من الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز وصمة عار الخلايا إيجابية النسب (مكافحة CD19، ومكافحة GR1، ومكافحة Ter119، ومكافحة NK1.1 ، CD11c ومكافحة، ومكافحة CD3، ومكافحة CD4، ومكافحة CD8، ومكافحة CD25).
- ليغسل فائض من الأجسام المضادة تدور أسفل الأنابيب مع 4 مل HBSS + 1٪ FCS في 280 x ج لمدة 7 دقائق، والقضاء على وطاف بيليه في HBSS الطازجة + 1٪ FCS تعليق إعادة. تكرار الطرد المركزي.
- احتضان الخلايا المسمى البيوتين E18 مع بلي ستربتافيدين خلال 15 دقيقة على 4 درجات مئوية، وغسل الخلايا مرتين في HBSS 1٪ FCS. إعادة تعليق الخلايا في 2 مل HBSS + 1٪ FCS. معظم thymocytes E13 هي النسب سلبي، وبالتالي لا تحتاج لتخصيب MACS قبل فرز الخلايا.
- تمر الخلايا على العمود LS، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. عندما دخل كل تعليق خلية العمود إضافة 2 مل HBSS + 1٪ FCS. استرداد4 مل من العمود تتدفق من خلال وأجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 7 دقائق في 280 ز س.
- إعادة تعليق بيليه إما المنضب E18 أو E13 مجموع thymocytes في 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة مزيج TSP (مكافحة CD117 APC، ومكافحة CD135 PE، ومكافحة CD127 PECy7، ومكافحة CD24 FITC، ومكافحة CD44 APCCy7 وستربتافيدين الأزرق المحيط الهادئ )، واحتضان لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
- غسل الخلايا مع 4 مل HBSS + 1٪ FCS وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل HBSS + 1٪ FCS مع يوديد propidium.
- فرز TSPs لين - CD44 + CD24 + CD117 CD127 منخفض + CD135 + الخلايا في FACS (مع 4 ليزر) على 1.5 مل أنابيب تحتوي على 200 ميكرولتر المتوسطة كاملة + 20٪ FCS. بوابة أولا الخلايا وفقا لحجمها وتحبب على FSC وقنوات التعاون بين بلدان الجنوب. القضاء على الخلايا الميتة (تلطيخ مع يوديد propidium)، بوابة من الحلل ويسجل مضان في جداول الأسي. ويمكن الحصول على حوالي 100 أو 600 TSPs من E13 أو E18 واحد الغدة الصعترية، respectivاعل.
6. استعمار E14 التوتة فصوص مع الأسلاف: شنق قطرة تقنية
- أشرق (30 غرايز = 30 غراي) E14 فصوص الغدة الصعترية من أجنة CD45.2، 3 ساعات قبل الثقافة.
ملاحظة: استخدمت E14 أو E15 فصوص الغدة الصعترية بنجاح كما متلقي T الأسلاف الخلية. باستخدام المتلقي فصوص الغدة الصعترية من لاحقة أيام الحمل يؤدي إلى نخر سابق لأوانه نظرا لحجم أكبر من الجهاز في حين فصوص الغدة الصعترية في أيام الحمل السابقة تتطور بشكل سيئ، وربما يرجع ذلك إلى عدم اكتمال نمو الخلايا الظهارية. - الطرد المركزي فرز TSPs واعادة تعليق الخلايا في مستنبت (OPTI-MEM المتوسطة كاملة مع 10٪ FCS والبنسلين (50 وحدة / مل)، الستربتومايسين (50 ميكروغرام / مل)، و2β المركابتويثانول (50 ميكرومتر)) بحيث 35 ميكرولتر تحتوي على 500 TSP.
- وضع قطرة 35 ميكرولتر من تعليق خلية في كل جانب الآخر من 60 لوحة Terasaki جيدا.
ملاحظة: يمكن 35 قطرات ميكرولتر تلتحم إذا وضعت في آبار متجاورة. - وضع الفص المشع واحد على سطح كل قطرة. إغلاق لوحة Terasaki وتحويل لوحة رأسا على عقب للسماح للخلايا تصل إلى القطب القمي من الهبوط بفعل الجاذبية.
- ضرب بلطف الجانب العلوي من لوحة مقلوب لإجبار فصوص أن تنزلق على حافة قمي من الانخفاض. احتضان لوحة Terasaki مقلوب في حاضنة مرطب لمدة 48 ساعة على 37 درجة C + 5٪ CO 2. بعد الاستعمار، إما ثقافة E14 التوتة في FTOC 7، أو الكسب غير المشروع تحت كبسولة الكلى من الماوس الكبار المتلقي 8.
7. التوتة الجنينية ثقافة الجهاز
- وضع 3 مل من المتوسط كاملة على طبق بيتري 35 ملم. وضع مرشح غشاء isopore تطفو على المدى المتوسط. وضع فصوص تشكيلها على حافة الغشاء مع ملقط (لا يزيد عن 8 فصوص على غشاء واحد).
- وضع أطباق بتري تحتوي على فصوص الغدة الصعترية داخل صحن 90 ملم بيتري، جنبا إلى جنب مع طبق 35 ملم، من دون غطاء، التي تحتوي على 2 مل توفير المياهص، لضمان الرطوبة المثلى. احتضان 12 يوما في 37 ° C + 5٪ CO 2.
8. الطعوم تحت كبسولة الكلى تحت العقيمة الشروط
ملاحظة: ويحيط حمة الكلى عن طريق النسيج الضام تشكيل الكبسولة. المنطقة شبه المحفظة غنية وخاصة في الدم والأوعية اللمفاوية وبالتالي توفير بيئة مناسبة لتطوير الطعوم (على سبيل المثال فصوص الغدة الصعترية، الجزر البنكرياسية أو قلوب الأطفال حديثي الولادة). وعادة ما يتم القيام به الطعوم على الكلية اليسرى لأنه أكثر منالا من الكلية اليمنى. CD3 - / - استخدمت الفئران الذكور كما وبالتالي المتلقين تجنب الكسب غير المشروع مقابل رد فعل المضيفة بسبب مستضدات التوافق النسيجي الطفيفة مرتبطة الكروموسوم Y لتحديد الجنس قبل E15 لم يتم ذلك بسهولة.
- تعقيم الأدوات وارتداء القفازات المعقمة على طول الجراحة. تخدير الماوس عن طريق الحقن البريتوني داخل من محلول الكيتامين 10 ملغ / مل + زيلازين 1 ملغ /مل مخففة في برنامج تلفزيوني: (50-100 ميكرولتر لكل 10 غرام من وزن الجسم)، وذلك باستخدام حقنة 1 مل. تحقق التخدير عن طريق التحقق من عدم وجود ردود الافعال بين الأصابع. وضع قطرة المائية Optimune الجل على كل عين لمنع جفاف أثناء التخدير.
ملاحظة: يجب أن تكون مستعدة الحل بشكل إرتجالي وتحسنت في درجة حرارة الغرفة قبل الحقن. التخدير يدوم 20 دقيقة على الأقل. يجب السيطرة على درجة التخدير على طول الجراحة. التخدير يمكن لفترات طويلة عن طريق الحقن البريتوني داخل نصف الجرعة كل 20 دقيقة. - ضع الماوس على جانبها الأيمن، تحت غطاء تدفق الأفقي الصفيحة. تعقيم الجراحي الميداني مع الايثانول 70٪ و 10٪ من محلول يوديد أدمي. مع جزء الملقط الشعر الماوس على طول طول 2 سم فقط فوق مفصل من الساق الخلفية. حلق المنطقة الجراحية.
- مع مشرط، وجعل سم طول شق 1.5 من الأولى، والأنسجة الجلدية، ثم مع قطع مقص النسيج العضلي. تطبيق ضغط طفيف على كلا الجانبين من شقالذي سيجبر الكلى من تجويف البطن.
- تطبيق المالحة مع القطن برعم للحفاظ على الكلى رطبة. إذا كان لديك صعوبات في الكشف عن الجهاز، واستخدام ملقط مسطحة لسحب الأنسجة المحيطة خلية شحمية التي يتم إرفاق الكلى. الحفاظ على الكلى من تجويف خلف الصفاق التي كتبها برعم القطن وضعت تحت الجهاز.
- مع اثنين من ملقط غرامة، وجعل ثقب 2-3 ملم في كبسولة (تجنب لمس لحمة لمنع النزيف). أثناء إجراء العمليات الجراحية كله الحفاظ على كبسولة الكلى يتعرض مبلل باستمرار.
- إدراج بعناية فصوص تحت كبسولة الكلى من خلال المحافظة على جدار كبسولة فتح وحرك الكسب غير المشروع تحت الكبسولة نحو القطب الحافة. وضع ما يصل الى 6 فصوص في الكلى.
- استبدال الكلى في التجويف البريتوني الرجعية. خياطة سفق العضلات، ثم الجلد مع عقدة الجراح الفردية. الرطب الجرح مع 10٪ محلول يوديد البوفيدون. ضع الماوس على السلطة الفلسطينية ساخنةد عند 37 درجة مئوية.
- مسح الماوس المزروعة حتى الشفاء التام من التخدير عن طريق التحكم من القلب والجهاز التنفسي والطولي الحركات والألوان المخاطية حتى الشفاء التام يراها النفس الوارد الحركات.
ملاحظة: نوصي حقن محلول مسكن (Buprenorphin، 0.1 ملغم / كغم) في العضلات الداخلية بعد الجراحة و2 أيام بعد الجراحة لمنع الألم بعد الجراحة. - حفاظ على الحيوانات تعمل في عزلة حتى تعافى تماما. تفقد كل يوم غرز الجرح للتحقق ومنع العدوى. أبدا لوحظ عدوى الجرح بعد هذا الإجراء.
ملاحظة: التحليل الأسبوعي لخلايا الدم الطرفية من CD3 - / - الفئران المطعمة تسمح لنا للكشف عن التوتة السكان مشتقة نشأت من إما E13 أو E18 الأسلاف باستخدام علامة الأنماط الخيفية CD45 ونسب الخلايا التائية أجسام مضادة محددة (الشكل 3).
9. تحليل ذرية TSP بواسطة التدفق الخلوي
- تعليق خلية وصمة عار من فصوص الفردية مع مزيج الأجسام المضادة التي تحتوي على الأجسام المضادة الاعتراف CD45.1 PECy7، CD45.2 AmCyan، CD4 APCCy7، CD8 APC، CD3 باسيفيك بلو، Vγ5 FITC، Vδ1 PE واحتضان كما هو موضح في المادة 5.
- إعادة تعليق الخلايا في HBSS + 1٪ FCS + يوديد propidium وتحليلها في قياس التدفق الخلوي (انظر النتائج في الشكل 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
من أجل اختيار طريقة لاستنزاف فصوص الغدة الصعترية من thymocytes الذاتية السماح للأفضل تطوير الأسلاف استعمار، قارنا مستويات T إعادة خلية في فصوص الغدة الصعترية المستعمر بعد التشعيع أو 5 أيام ديوكسي-غوانوزين (د-غواتيمالا) العلاج. أظهرت النتائج أنه في حين لا يوجد فرق في يوم 9 من الثقافة، تضمنت فصوص المشع المزيد من الخلايا T من الذين عولجوا مع د-غواتيمالا، في يوم 12. وهكذا، التشعيع هو أكثر ملاءمة من مد غواتيمالا العلاج للحصول على نمو الخلايا T بعد الاستعمار الغدة الصعترية (الشكل 1). لدراسة إمكانية التنموية للE13 E18 وTSP، ونحن المستعمر المشع E14 فصوص الغدة الصعترية مع خليط من أعداد متساوية من هذين النوعين من الأسلاف. وأظهرت النتائج أن E13 TSPs تؤدي إلى أقل thymocytes وأقل DP من E18 TSP ولكن، في المقابل، E13 TSP توليد DETC وترددات أعلى من CD3 + تنضج الخلايا (الشكل 2). لتحليل وعاء في الجسم الحيential من E13 E18 وTSP، والمطعمة فصوص الغدة الصعترية المستعمر مع كل نوع من الأسلاف تحت كبسولة الكلى من CD3 - / - المتلقين. وأظهرت النتائج أن، بما يتفق مع FTOC، أعطى E13 TSP أدى إلى خلايا T أسرع من الأسلاف E18 ولكن كان عدد من تعميم خلايا T أقل من ذلك بكثير (الشكل 3).
الشكل 1: تطور الخلايا T هو أكثر كفاءة في المشع مما كانت عليه في deoxyguanosine المعالجة، فصوص الغدة الصعترية المستعمر كانت E14 فصوص الغدة الصعترية (CD45.2) إما المشع مع 30 غراي أو المعالجة لمدة 5 أيام مع ديوكسي-غوانوزين (د-غوا). وبعد ذلك المستعمر فصوص الغدة الصعترية مع 1000 لين - CD117 + هيئة السلع التموينية-1 + خلايا (LSK) E14 FL معزولة عن CD45.1 / 2 أجنة، في شنقا انخفاض لمدة 48 ساعة ومثقف على التصفية. وقد لوحظ عدم وجود فروق في كفاءة ENاستنزاف خلية توتية dogenous بين المجموعتين من فصوص الغدة الصعترية. تطوير thymocytes ملطخة أجسام مضادة ضد CD45.1، CD45.2، CD3، Vγ5، Vδ1 وCD4 تم تحليلها في يوم 9 و 12 من قبل FACS. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: وعلى النقيض من E18، E13 TSPs توليد Vγ5Vδ1 DETC تم المشع CD45.2 فصوص التوتة واستعمرت لمدة 48 ساعة مع لفيف مختلطة من 500 E13 TSP من CD45.1 / 2 الأجنة و 500 E18 TSP من أجنة CD45.1. . في ظل هذه الظروف التجريبية، E13 E18 وTSP تطوير في نفس البيئة والاختلاف في معدل التمايز والخلايا التائية الناضجة فرعية لوحظ بعد ثقافة يمكن أن تعكس الاختلافات في الخلية البيولوجية الذاتية فقطخصائص. بعد أن تم تحليل 12 يوما في thymocytes الثقافة من فصوص الفردية عن طريق التدفق الخلوي بعد تلطيخ مع الأجسام المضادة التي تعترف CD45.1، CD45.2، CD4، CD8، CD3، Vγ5، Vδ1. (A) لوحات تظهر أعداد الخلايا تعافى في كل شحمة الأذن. (B) تدفق الممثل الخلوي الشخصية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: E13 TSPs تطوير أسرع من E18 TSPs تم المشع فصوص CD45.2 التوتة واستعمرت لمدة 48 ساعة مع 500 E13 TSP أو 500 E18 TSP من أجنة CD45.1. CD3 - / - والمطعمة الفئران مع 4 فصوص التوتة المستعمر مع إما E13 أو E18 TSPs. وقد تم جمع الدم المحيطي على فترات أسبوعية وتحليلها بواسطة FACS لتأليفولا الخلايا (CD45.1) CD3 + T. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الخطوة 1 | التزاوج الفئران للحصول على الأجنة E18 (يوم -21)؛ التزاوج الفئران للحصول على الأجنة E14 (يوم -17)؛ التزاوج الفئران للحصول على الأجنة E13 (يوم -16) | ||
| خطوة 2A | تشريح الأجنة، اليوم -2 | ||
| خطوة 2B | تشعيع E14 فصوص الغدة الصعترية، اليوم -2 | ||
| الخطوة رقم c2 | إعداد وتلطيخ، وفرز الخلايا من E13 E18 وفصوص الغدة الصعترية، اليوم -2 | ||
| الخطوة 2d | شنقا ثقافة الإفلات، اليوم -2 | ||
| الخطوة 3A | التوتة الجنينية ثقافة الجهاز، اليوم 0 | ||
| الخطوة 3B | الكسب غير المشروع تحت كبسولة الكلى، اليوم 0 | الخطوة 4 | FTOC: تحليل التدفق الخلوي، اليوم 12 |
| خطوة 5 | الكسب غير المشروع: تدفق الأسبوعي الخلوي تحليل تعميم الخلايا T، أيام 15، 22، 35 |
الجدول 1: يتبع الإجراء 5 خطوات في التجربة الجدول الزمني للتجربة من التزاوج من سلالات الفئران مختلفة تصل إلى تحليل الفئران المطعمة. يتم إجراء ترقيع في 7 أسابيع الفئران القديمة. أخذ الوقت لزرع كيوم 0، اليوم -21 هو تزاوج الفئران للحصول على الأجنة E18، اليوم -17 للحصول على الأجنة E14، اليوم -16 للحصول على الأجنة E13، وفي اليوم -2 الفرز من E13 E18 وTSP وتشعيع الفص الغدة الصعترية والشنق تقنية الهبوط.
| الجسم المضاد | عدد استنساخ | الجسم المضاد | عدد استنساخ | |
| CD25 | 7D4 | CD19 | 6D5 | |
| CD44 | IM7 | ثالثا 119 | TER-119 | |
| CD24 | M1 / 69 | NK1.1 | PK 136 | |
| CD117 | 2B8 | CD11c و | HL3 | |
| CD3 | 145-2C11 | GR1 | RB6-8C5 | |
| CD4 | RM4-5 | GD | eBioGL3 | |
| CD8 | 53-6،7 | هيئة السلع التموينية، 1 | D7 | |
| CD135 | A2F10 | CD45.2 | 104 | |
| CD127 | A7R34 | Ly5.1 | A20 |
الجدول 2: الأجسام المضادة واستنساخ الأرقام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحليلين الرئيسية يمكن استخدامها لتحليل T تمايز الخلايا خارج الجسم الحي. الأكثر ذكرت مؤخرا هو شريك في ثقافة الأسلاف المكونة للدم مع خلايا انسجة BM، OP9، معربا عن بروابط من Noth1، دلتا مثل 1 أو 4 12. هذا الاختبار 2-D من السهل القيام بها، كفاءة عالية وحساسية، مما يسمح للتحليل في مستوى خلية واحدة. ومع ذلك، فإنه لا يدعم نمو الخلايا T تجاوز مرحلة DP ولا جيل من γδ DETC 13، وكلاهما يتطلب التفاعل المباشر مع ظهارة الغدة الصعترية.
منذ فترة طويلة تستخدم FTOCs لتحليل تطور الخلايا T 3. نقاط القوة الرئيسية من هذا الاختبار هو السماح للجيل جميع تنضج T مقصورات الخلية، وهي خاصية التي تمنحها كفاءة التفاعلات 3-D من thymocytes مع ظهارة الغدة الصعترية. اختبرنا هنا استخدمنا طريقتين حاليا في استنزاف thymocytes الذاتية مما يسمح الاستعمار كفاءة عن طريق الأسلاف الخارجية. كلا المؤينة تشعيع وdeoxyguanosine العلاج المنضب بكفاءة تطوير thymocytes. إلا أن استمرار فصوص الغدة الصعترية المشع فقط تطور الخلايا التائية قوية لفترات أطول من الوقت مما يشير إلى أن العلاج د-غواتيمالا قد تؤثر أيضا على مكونات المقصورة الظهارية. كانت مستعمرة فصوص الغدة الصعترية الجنينية التي كتبها الأسلاف الخارجية باستخدام "شنقا قطرة" الأسلوب. استعمار فصوص المشع مع كل السكان في المنافسة يسمح اكتشاف خلية مختلفة خصائص بيولوجية مستقلة. الاستعمار مع واحد فقط من مجموعات فرعية TSP يكشف قدرة التمايز في بيئة غير تنافسية.
وعيب هذه الطريقة هو كفاءة أقل في وتيرة TSP أن تتطور إلى خلايا T بالمقارنة مع OP9Dl المشترك الثقافات 14. لكن قمنا به خلايا DN1 أو DN2 واحدة لاستعمار فصوص الغدة الصعترية الفردية مع كفاءة أقرب إلى أن الحصول عليها مع الخلايا اللحمية. A reductio عشرة أضعافن في كفاءة إنتاج خلايا T وجدت عندما تستخدم FL أو BM الأسلاف المكونة للدم لFTOC التي لم يتم ملاحظتها في دلتا OP9 مثل الثقافات. وتشير هذه التطورات أقل كفاءة أنه ليس كل الخلايا BM أو FL مع T إمكانات خلية يمكن أن تستعمر الغدة الصعترية.
تطعيم فصوص الغدة الصعترية المستعمر يقدم العرض أفضل المغذيات والأكسجين إلى تطوير التوتة مما كانت عليه في FTOC، وإمكانية لمتابعة مصير ذرية TSP، في الجسم الحي. باستخدام هذه الاستراتيجيات مجتمعة اثنين أننا يمكن أن تصف الخطوات من التمايز وإمكانات وظيفية من ذرية TSPs. لأن CD3 - / - الفئران CD45.2 15، التي لا يمكن أن تتطور خلايا T ناضجة، استخدمت بصفتها الدولة المضيفة، ونحن يمكن أن جنبا إلى جنب مع الاختلافات الأنماط الخيفية CD45، بشكل لا لبس فيه اتباع خلايا T ولدت حديثا في بيئاتها الطبيعية
الجوانب جديدة من إجراء التجارب وصفها هنا هي مزيج من FTOC المعادمع زرع في الجسم الحي. يسمح هذا تحديد وتعقب ذرية فرعية محددة من الأسلاف المكونة للدم. وجدنا أن TSP من الموجات الأولى والثانية تولد مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا γδT، أعداد مختلفة من الخلايا αβT ولها حركية مختلفة من التمايز.
يعتبر اليوم 0 18 ساعة بعد التزاوج من الفئران، وفقا لكشف المكونات: مرحلة الأجنة. تشريح للالتوتة تتطلب جيدة الباردة الخفيفة 150 W، المجهر تشريح مجهر وبعض الممارسات للتشريح، والتخدير والإجراءات الكسب غير المشروع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
بدعم من معهد باستور، INSERM، الوكالة الوطنية للبحوث وكالة الاستخبارات الوطنية (غرانت اللمفاويات ')، وإعادة إحياء برنامج الاستثمار في المستقبل و "لا دوري الدرجة مناهضة للسرطان".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture Petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26 G ⅜" 0.45 x 10 mm syringes with needles | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility actions |
| Ketamine 100 mg/ml (stock solution) | MERIAL | Anesthesic | |
| Xylazine 100 mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3 mg/ml stock solution | AXIENCE | Morphinic analgesic | |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | Eye protection | |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fetal calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2-Mercaptoethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine iris scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps: Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| 2 pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1x270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5 x 7.5 cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
- Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu Rev Immunol. 26, 355-388 (2008).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Douagi, I., Andre, I., Ferraz, J. C., Cumano, A. Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation. Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).
- Calderon, L., Boehm, T. Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments. Cell. 149, 159-172 (2012).
- Adolfsson, J., et al. Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment. Cell. 121, 295-306 (2005).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26, 678-689 (2007).
- Ramond, C., et al. Two waves of distinct hematopoietic progenitor cells colonize the fetal thymus. Nat Immunol. 15, 27-35 (2014).
- Allison, J. P., Havran, W. L. The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors. Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Barbee, S. D., et al. Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 3330-3335 (2011).
- Douagi, I., Colucci, F., Di Santo, J. P., Cumano, A. Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver. Blood. 99, 463-471 (2002).
- Malissen, M., et al. Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene. EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).
