Abstract
Karakterisering thymiske afregning stamfædre er vigtigt at forstå de præ-thymus stadier af T-celle udvikling, vigtigt at udtænke strategier for T-celle udskiftning i lymphopenic patienter. Vi studerede thymiske afregning progenitorer fra murin embryonisk dag 13 og 18 Thymi af to komplementære in vitro og in vivo teknikker, begge baseret på den "hængende dråbe" metoden. Denne metode tillod kolonisere bestrålede føtale thymiske lapper med E13 og / eller E18 thymiske progenitorer udmærker sig ved CD45 allotypiske markører og dermed efter deres afkom. Kolonisering med blandede populationer tillader analysere celle autonome forskelle i biologiske egenskaber af stamceller mens kolonisering med enten befolkning fjerner eventuelle konkurrencemæssige selektive pres. De koloniserede thymus lapper kan også blive indpodet immundefekte mandlige recipientmus tillader analyse af T afkom den modne celle in vivo, såsom populationsdynamik af than perifere immunsystem og kolonisering af forskellige væv og organer. Føtale thymus organkulturer afslørede, at E13 progenitorer udviklede sig hurtigt til alle modne CD3 + celler og gav anledning til den kanoniske γδ T-celle delmængde, kendt som dendritiske epiteliale T-celler. Til sammenligning E18 progenitorer har en forsinket differentiering og var ude af stand til at generere dendritiske epitel-T-celler. Overvågningen af perifert blod fra thymus-transplanterede CD3 - / - mus viste desuden, at E18 thymiske bundfældning progenitorer generere med tiden større antal modne T-celler end deres modstykker E13, en funktion, der ikke kunne forstås på kort sigt føtal thymus organkulturer.
Introduction
T-lymfocytter, der bærer αβ eller γδ T-celle receptor (TCR), differentiere i et specialiseret organ, thymus. Det fuldt udviklede thymus er organiseret i to adskilte regioner: cortex, hvor thymus stamfædre udvikler, og hvor thymocytter der produktivt omarrangere TCR β og α-kæde gener er reddet fra programmeret død (en proces kendt som positiv selektion); og medulla, hvor udvalgte thymocytter med for stærk reaktivitet til selv-ligander slettes (negativ selektion) 1,2. Thymus stammer fra endodermal lag af den tredje svælg pose, der er senere omgivet af mesenkymale celler 3. Det er koloniseret af hæmatopoietiske progenitorer starter ved fosterdag E12 og kontinuerlig rekruttering kræves derefter for normal T-celle udvikling 4. Thymus indvandrere udvikle sig gennem successive udviklingsstadier, orkestreret af en tæt reguleret program, iværksættes og maintained af aktiveringen af Notch signalvejen på thymocytter ved interaktion med dets ligand, delta like 4, udtrykt på thymiske epitelceller (TECs) 5.
Thymocyt udvikling starter ved den såkaldte CD4 - CD8 - dobbelt negative (DN) etaper. DN thymocytter kan yderligere opdeles i overensstemmelse med ekspression af CD25 og CD44 i DN1 (CD25 - CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) og DN4 (CD25 - CD44 -). CD24 (HSA) og CD117 (c-Kit) yderligere opdeler DN1 rum i 5 undergrupper, hvor DN1a b svarer til tidlige thymiske progenitorer (ETP). Thymocytter omarrangere TCR δ, β og α-kæder på DN scenen og gennemgå pre-TcR udvælgelse (DN3-DN4 stadier). De har endvidere transit til CD4 + CD8 + dobbelt positive (DP) rum, hvor TcR α-kæden omarrangerer forud for positive og negative selektion. På dette stadium fleste thymocyter elimineres og kun en lille procentdel (3-5%) nå CD4 + eller CD8 + modne T-celle rum.
Den lymfoide differentieringsvej skrider gennem stadier af HSC'er der genererer multipotente progenitorer (MPP) og lymfoide-primet multipotente progenitorer (LMPP), der mistet erythrocyt og megakaryocyt potentiale 6. LMPP er fænotypisk defineret ved fravær af differentierede blodlegemer markører (afstamning negativ, Lin -), ekspressionen af c-kit (CD117), Sca-1 og Flt3 / flk2 (CD135) og fraværet af påviselige niveauer af interleukin ( IL) -7 receptor α-kæde (IL-7rα eller CD127). LMPPs yderligere differentiere til fælles lymfoide progenitorer (CLP) 7, at ved denne fase har mistet evnen til at generere myeloide celler. CLP bevarer lymfocyt (B- og T-celle), NK-celle, DC og medfødte lymfecelle (ILC) potentiale, og adskiller sig fra LMPP ved ekspression af CD127 og fraværet af høje niveauer af Sca-1.
Selv om arten af de thymiske afregning progenitorer (TSP) er blevet grundigt drøftet 8, blev det for nylig klart, at TSP ændring fænotype, differentiering potentiale og funktion i hele udvikling 9. Udførte vi in vitro og in vivo assays til at karakterisere TSP, isoleret ved FACS cellesortering fra enten E13 (første bølge) eller E18 (anden bølge). Føtale thymus organkulturer (FTOC) med bestrålede thymiske lapper koloniseret af lige mange E13 og E18 stamfædre, der bærer forskellige allotypiske markører, tilladt efter deres afkom i en lignende udviklingsmæssig miljø og afslørede celle iboende egenskaber, forskellige mellem de to typer af stamceller. Thymus lapper koloniseret af enten E13 eller E18 TSP tilladt udvikling uden selektion på grund af konkurrencen mellem de to stamfædre. In vivo transplantation af de koloniserede thymus lapper viste desuden, at også than modne afkom af E13 og E18 TSP har forskellige biologiske egenskaber in vivo. Tsps fra den første bølge hurtigt generere T-celler, men giver anledning til et lavt antal αβ og γδ T-celler. Blandt de sidstnævnte, vi har registreret Vγ5Vδ1 dendritiske epiteliale T-celler (DETC), der har en invariant TcR, migrere til overhuden, hvor de udøver en funktion i sårheling og er kun produceret i fosterudviklingen 10. I modsætning hertil TSP fra den anden bølge tage længere tid at generere høje antal af TcR + T-celler og er ude af stand til at generere DETC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik erklæring: alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med Pasteur Institute Etik Charter, der er godkendt af det franske landbrugsministerium, og til EU-retningslinjerne. En manipulator med træning på små gnavere kirurgi, certificeret af det franske landbrugsministerium, udfører alle kirurgiske indgreb.
BEMÆRK: Se bilag Tabel 1 viser den 5-trins plan procedure.
1. Valg af embryonerne
- Brug 36 C57BL / 6 CD45,2 hunner, 12 hunner CD45,1, 12 C57BL / 6 CD45,1 hanner og 12 C57BL / 6 CD45,2 hanner. Indlægget hunnerne med enten mand genotype vil producere embryoer CD45,1 / 2 og CD45,1 anvendes som en kilde til TSP eller CD45,2 anvendes som en kilde til modtagerens thymiske lapper. Hus alle mænd individuelt.
- For at opnå embryoner til E18 TSP isolation, placere 2 hunner i et bur med en han CD45,1 kl 6, 21 dage før podning eksperiment. Kontrol af tilstedeværelse af en vaginal prop den næste dag, før middag. Sepabedømme plugged hunner.
- For at få E14 embryoner skal koloniseret af TSP, gentages ovenstående (1.2) procedure, ved hjælp af hanner CD45,2, 17 dage før podning eksperiment.
- For at få embryoner at isolere E13 TSP, gentages ovenstående (1.2) procedure, ved hjælp af hanner C57BL / 6 CD45,1, 16 dage før podning eksperiment.
2. Dissektion af embryoner Under en vandret Laminar Flow Hood
BEMÆRK: To dage før podning eksperiment.
- Sacrifice de drægtige hunner ved cervikal dislokation eller ved progressiv indgivelse af CO 2 gas i mindst 5 minutter, i en mættende lukket kammer. Sikre døden ved endelig anholdelse af hjerte-respiratorisk bevægelser. Fugt maven med 70% ethanol.
- Lav en langsgående snit i huden på midterlinjen maven og åbne den ved at trække i huden fra hinanden. Åbne bughinden med pincet og saks uden at røre fordøjelseskanalen. Træk bifid puteros og adskille den fra skeden med saksen.
- Placer livmoderen i en 90 x 15 mm petriskål indeholdende 40-50 ml DPBS og skæres på tværs mellem hvert foster er decidua.
- Med par fine spids saks og en fin pincet fjerne muskel membran af livmoderen, tegne embryoner ved at skære mellem placenta og blommesækken, og fjern Amnios, som er opretholdelse af de embryoner.
- Placer embryoner i en petriskål 90 x 15 mm indeholdende HBSS + 1% føtalt kalveserum (FCS). For embryoner ældre end E15, skal du fjerne hovederne med en saks inden yderligere dissektion.
3. Isolering af Thymus
- Under kikkerten forstørrelsesglas, placere embryo, liggende i rygleje (ventral view), på en våd gaze sengetøj.
- Indsæt en pincet længderetningen langs brusk af brystbenet, knivspids og åbn thorax nettet. Med buede pincet, træk thorax væg til side for at visualisere thymic lapper på hver side af luftrøret.
- Holde nøje hver lap ved at knibe nedenunder med en fin pincet og placere dem i en petriskål indeholdende 1 ml HBSS + 1% FCS. Isoler knasterne og fjern omgivende bindevæv med to 1 ml sprøjter + 26 G ⅜ "nåle, uden at beskadige kapslen.
- Vask lapperne i 3 ml HBSS + 1% FCS for at fjerne blodceller.
BEMÆRK: Før E15, er thymiske lapper placeret på hver side af luft- og senere sikring i midten for at udgøre en bi-lobar organ.
4. cellesuspensioner
- Drille hinanden de lapper under kikkerten forstørrelsesglas, med to 26 G nåle monteret på 1 ml sprøjter, i HBSS + 1% FCS. Filtrer cellesuspensionen gennem en nylonnet.
5. Farvning med fluorescerende antistoffer og Cell Sortering
BEMÆRK: Alle antistoffer tidligere titreret for at opnå optimal definition af befolkningerne (den titration kan variere med antistoffet batch).
- Inkubér thymocytter (E13 eller E18) i 15-30 minutter ved 4 ° C med en 100 pi af en cocktail af biotinylerede antistoffer til at farve afstamningsceller positive celler (anti-CD19, anti-Gr1, anti-TER119, anti-NK1.1 , anti- CD11, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25).
- At vaske væk overskud af antistoffer spin ned rørene med 4 ml HBSS + 1% FCS ved 280 xg i 7 min, fjerne supernatanten og resuspendere pelleten i frisk HBSS + 1% FCS. Gentag centrifugering.
- Inkubér E18 biotinmærkede celler med streptavidin mikroperler i løbet af 15 minutter ved 4 ° C og vaskes cellerne to gange i HBSS 1% FCS. Re-suspendere cellerne i 2 ml HBSS + 1% FCS. De fleste E13 thymocytter er afstamning negative og derfor ikke behøver MACS berigelse før celle sortering.
- Passere cellerne på LS-søjle, i overensstemmelse med producentens anvisninger. Når alt cellesuspensionen indtastede kolonnen tilsættes 2 ml HBSS + 1% FCS. Inddrive4 ml af søjlen flyde igennem og centrifuger cellerne i 7 minutter ved 280 x g.
- Resuspender pellet af enten forarmet E18 eller E13 total thymocytter i 50 pi af TSP-antistof mix (anti-CD117 APC, anti-CD135 PE, anti-CD127 PECy7, anti-CD24 FITC, anti-CD44 APCCy7 og streptavidin Pacific Blue ) og inkuberes i 20 minutter ved 4 ° C i mørke.
- Vask cellerne med 4 ml HBSS + 1% FCS og resuspender cellerne i 1 ml HBSS + 1% FCS med propidiumiodid.
- Sortere tsps Lin - CD44 + CD117 + CD24 lav CD127 + CD135 + celler i en FACS (med 4 lasere) på et 1,5 ml rør indeholdende 200 pi komplet medium + 20% FCS. Gate første celler i henhold til deres størrelse og granularitet på FSC og SSC kanaler. Eliminer døde celler (farvning med propidiumiodid), gate ud dubletter og score den fluorescens i eksponentielle skalaer. Omkring 100 eller 600 tsps kan fås fra en E13 eller en E18 thymus, respektively.
6. Kolonisering af E14 tymisk Lobes med progenitorer: Hængende Drop Teknik
- Bestråle (30 Grays = 30 Gy) E14 thymiske lapper fra CD45,2 embryoner, 3 timer før kulturen.
BEMÆRK: E14 eller E15 thymiske lapper med succes er blevet brugt som modtager af T-celle stamfædre. Under anvendelse modtagende thymiske kamre af senere gestational dage resulterer i for tidlig nekrose som følge af større størrelse af organet mens thymiske lapper på tidligere gestational dage udvikler dårligt sandsynligvis på grund af ufuldstændig udvikling af epitelcellerne. - Centrifuger sorteret tsps og genopslæmmes cellerne i dyrkningsmedium (OPTI-MEM komplette medium med 10% FCS, penicillin (50 enheder / ml), streptomycin (50 ug / ml) og 2β-mercaptoethanol (50 pM)), således at 35 pi indeholder 500 TSP.
- Placer en 35 ul dråbe cellesuspension hver anden brønd i en 60 brønd Terasaki plade.
BEMÆRK: 35 pi dråber kan smelte, hvis de er placeret i tilstødende brønde. - Placer en bestrålet lap på overfladen af hver dråbe. Luk Terasaki plade og drej pladen på hovedet for at lade cellerne når den apikale pol af dråben af tyngdekraften.
- Hit forsigtigt den øvre side af den omvendte plade for at tvinge knasterne til at glide til den apikale kant af dråben. Inkubere den inverterede Terasaki plade i en befugtet inkubator i 48 timer ved 37 ° C + 5% CO2. Efter kolonisering, enten kultur E14 Thymi i FTOC 7 eller transplantat under nyrekapslen af en modtager voksne mus 8.
7. Fetal tymisk Organ Culture
- Placere 3 ml komplet medium på en 35 mm petriskål. Placer en isopore membranfilter flyder på mediet. Placer de rekonstituerede lapper på kanten af membranen med en pincet (ikke mere end 8 kamre på den ene membran).
- Placer Petriskåle indeholdende de thymiske lapper inde i en 90 mm petriskål, sammen med en 35 mm skål, uden låg, indeholdende 2 ml water, for at sikre optimal fugtighed. Inkuber 12 dage ved 37 ° C + 5% CO2.
8. Transplantater Under nyrekapslen under sterile forhold
BEMÆRK: nyre parenkym er omgivet af bindevæv danner en kapsel. Sub-kapsel region er særligt rige på blod og lymfekar og derved giver et passende miljø for udvikling af transplantater (f.eks thymiske lapper, pancreasøer eller nyfødte hjerter). Grafts normalt gøres på den venstre nyre, fordi det er mere tilgængeligt end den højre nyre. CD3 - / - hanmus blev anvendt som recipienter således undgå graft versus host reaktion som følge af mindre histokompatibilitetsantigener tilknytning til Y-kromosomet, fordi kønsbestemmelse før E15 ikke gøres nemt.
- Sterilisere instrumenter og slid sterile handsker langs kirurgi. Bedøver musen ved intraperitoneal injektion af en opløsning af ketamin 10 mg / ml + xylazin 1 mg /ml fortyndet i PBS: (50 til 100 pi pr 10 g legemsvægt), anvendelse af en 1 ml sprøjte. Verificere anæstesi ved at kontrollere manglende interdigitale reflekser. Placer en dråbe hydro-Optimune gel på hvert øje for at forhindre tørhed under anæstesi.
BEMÆRK: Opløsningen skal fremstillet umiddelbart og varmes ved stuetemperatur før injektion. Bedøvelsen varer mindst 20 minutter. Graden af anæstesi bør styres langs hele operationen. Anæstesi kan forlænges ved intraperitoneal injektion af halv dosis hver 20 min. - Placer musen på sin højre side, under en vandret lamina flow hætte. Sterilisere kirurgiske område med 70% ethanol og 10% iodid dermic opløsning. Med en pincet del musen håret langs en længde lige over samlingen af bagbenet 2 cm. Barbere det kirurgiske område.
- Med en skalpel skæres et snit 1,5 cm længde af første, den kutane væv, derefter med saks klippe muskelvævet. Påfør et let tryk på begge sider af snittet, Hvilket vil tvinge nyren ud af bughulen.
- Påfør saltvand med en bomulds-opløbet til at holde nyrerne fugtig. Hvis du har problemer med at udsætte orgel, bruge en flad pincet til at trække sig ud den omgivende adipocyt væv, som nyren er fastgjort. Bevar nyren ud af retroperitoneal hulrum med en vatpind placeret under orglet.
- Med to fine tænger, lave en 2-3 mm hul i kapslen (undgå at røre ved parenkym at forhindre blødning). Under hele kirurgiske procedure holde den udsatte nyre kapsel kontinuerligt fugtet.
- Sæt forsigtigt lapper under nyrekapslen, ved at opretholde væg af kapslen åbnes og skub transplantatet under kapslen mod kanten pol. Placere op til 6 kamre pr nyre.
- Erstat nyren i retro-peritoneale hulrum. Suturere musklen aponeuroses, så huden med enkelte kirurg knob. Fugt såret med 10% iodid povidon opløsning. Placer musen på et opvarmet pad ved 37 ° C.
- Opmål det transplanterede mus indtil fuld helbredelse fra anæstesi ved styring af hjerte-, respiratoriske og knurhår bevægelser, slimhinder farver indtil fuldstændig bedring set af self indeholdt bevægelser.
BEMÆRK: Vi anbefaler, injektion af smertestillende løsning (buprenorphin, 0,1 mg / kg) intra muskel lige efter operationen og de 2 dage efter operationen for at forhindre post-kirurgi smerter. - Hold opererede dyr i isolation indtil fuldt tilbagebetalt. Undersøg hver anden dag stingene af såret for at kontrollere og forhindre infektion. Aldrig observeret sårinfektion efter denne procedure.
BEMÆRK: Ugentlig analyse af perifere blodceller fra CD3 - / - mus podede tillade os at detektere thymiske afledte populationer stammede fra enten E13 eller E18 progenitorer ved hjælp af CD45 allotypisk markør og T-celle afstamning specifikke antistoffer (figur 3).
9. Analyse af TSP afkom ved flowcytometri
- Plet cellesuspensioner fra individuelle lapper med et antistof indeholdende antistoffer, der genkender CD45,1 PECy7, CD45,2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, Vδ1 PE og inkuberes som beskrevet i afsnit 5.
- Resuspender cellerne i HBSS + 1% FCS + propidiumiodid og analysere i et flowcytometer (se resultater i figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at vælge en metode at nedbryder thymiske kamre af endogene thymocyter muliggør den bedste udvikling af koloniserende progenitorer sammenlignede vi niveauerne af T-celle rekonstituering i thymiske lapper koloniseret efter bestråling eller en 5-dages deoxy-guanosin (d-Gua) behandling. Resultaterne viser, at mens der ikke er forskel på dag 9 af kultur, bestrålede lapper indeholdt flere T-celler end dem behandlet med d-Gua, på dag 12. Således bestråling er mere passende end d-Gua behandling for at opnå T-celle udvikling efter thymus kolonisering (figur 1). For at undersøge den udviklingsmæssige potentiale E13 og E18 TSP, vi koloniseret E14 bestrålet thymiske lapper med en blanding af lige mange af de to typer af stamceller. Resultaterne viser, at E13 tsps giver anledning til færre thymocytter og mindre DP end E18 TSP, men i modsætning hertil E13 TSP generere DETC og højere frekvenser af CD3 + modne celler (figur 2). For at analysere in vivo potrentielle af E13 og E18 TSP blev thymiske lapper koloniseret med hver type progenitorer podet under nyrekapslen af CD3 - / - modtagere. Resultaterne viser, at, i overensstemmelse med den FTOC, E13 TSP gav anledning til T-celler hurtigere end E18 progenitorer men antallet af cirkulerende T-celler var signifikant lavere (figur 3).
Figur 1: T-celleudvikling er mere effektiv i bestrålet end i deoxyguanosin behandlet, koloniserede thymus lapper E14 thymiske lapper (CD45,2) var enten bestrålet med 30 Gy eller behandlet i 5 dage med deoxy-guanosin (d-Gua).. Thymus lapper blev derefter koloniseret med 1000 Lin - CD117 + Sca-1 + (LSK) E14 FL celler isoleret fra CD45,1 / 2 embryoner i hængende drop i 48 timer og dyrkes på et filter. Ingen forskelle blev observeret i effektiviteten af endogenous thymocyt udtømning mellem de to grupper af thymiske lapper. Udvikling thymocytter farvet med antistoffer mod CD45,1, CD45,2, CD3, Vγ5, Vδ1 og CD4 blev analyseret på dag 9 og 12 ved FACS. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: I modsætning til E18, E13 tsps genererer Vγ5Vδ1 DETC CD45,2 thymiske lapper blev bestrålet og koloniseret i 48 timer med en blandet gruppe af 500 E13 TSP fra CD45,1 / 2 embryoner og 500 E18 TSP fra CD45,1 embryoer. . Under disse eksperimentelle betingelser, E13 og E18 TSP udvikle sig i samme miljø og forskelle i antallet af differentiering og modne T-celle delmængder observeret efter kultur kan kun afspejler forskelle i celle iboende biologiskegenskaber. Efter 12 dage i kultur thymocytter fra individuelle lapper blev analyseret ved flowcytometri efter farvning med antistoffer, der genkender CD45,1, CD45,2, CD4, CD8, CD3, Vγ5, Vδ1. (A) Paneler viser antallet af celler inddrevet i hver lap. (B) Repræsentant flowcytometri profiler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: E13 tsps udvikle hurtigere end E18 CD45,2 thymiske lapper blev bestrålet og koloniseret i 48 timer med 500 E13 TSP eller 500 E18 TSP fra CD45,1 embryoer tsps.. CD3 - / - mus blev podet med 4 thymiske lapper koloniseret med enten E13 eller E18 tsps. Perifert blod blev opsamlet med ugentlige mellemrum og analyseret ved FACS til gørheller (CD45,1) CD3 + T-celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
| trin 1 | Parring mus til opnåelse E18 embryoner (dag -21); parring mus til opnåelse E14 embryoner (dag -17); parring mus til opnåelse E13 embryoner (dag -16) | ||
| trin 2a | Dissektion af embryoner, dag -2 | ||
| trin 2b | Bestråling af E14 thymus lapper, dag -2 | ||
| trin 2c | Forberedelse, farvning, og sortering af celler fra E13 og E18 thymiske lapper, dag -2 | ||
| trin 2d | Hængende dråbe kultur, dag -2 | ||
| trin 3a | Føtal tymisk Organ Kultur, dag 0 | ||
| trin 3b | Graft under nyrekapslen, dag 0 | trin 4 | FTOC: flowcytometri analyse, dag 12 |
| trin 5 | Graft: ugentlig flowcytometri analyse af cirkulerende T-celler, dage 15, 22, 35 |
Tabel 1: Fremgangsmåden 5-trin følges i eksperimentet Time-tabel af forsøget fra parring af de forskellige musestammer op til analysen af de podede mus.. Transplantater udføres hos 7 uger gamle mus. Idet tidspunktet for transplantation som dag 0, dag -21 er parring af mus for at opnå E18 embryoner, dag -17 til opnåelse E14 embryoner, dag -16 til opnåelse E13 embryoner, og i dag -2 sorteringen af E13 og E18 TSP , bestråling thymisk lap og hængende drop teknik.
| Antistof | Klon Number | Antistof | Klon Number | |
| CD25 | 7D4 | CD19 | 6D5 | |
| CD44 | IM7 | Ter 119 | TER-119 | |
| CD24 | M1 / 69 | NK1.1 | PK 136 | |
| CD117 | 2B8 | CD11c | HL3 | |
| CD3 | 145-2C11 | Gr1 | RB6-8C5 | |
| CD4 | RM4-5 | GD | eBioGL3 | |
| CD8 | 53-6,7 | Sca-1 | D7 | |
| CD135 | A2F10 | CD45,2 | 104 | |
| CD127 | A7R34 | Ly5.1 | A20 |
Tabel 2: Antistoffer og klonnumre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
To vigtige assays kan anvendes til at analysere T-celle differentiering ex vivo. Den mest nylig rapporteret er co-dyrkning af hæmatopoietiske progenitorer med BM stromaceller, OP9, der udtrykker ligander af Noth1, delta som 1 eller 4 12. Denne 2-D-assayet er let at udføre, meget effektiv og følsom, hvilket tillader analyse på enkelt celle niveau. Det hverken understøtter dog T celle udvikling ud over det stadium af DP eller frembringelsen af γδ DETC 13, som begge kræver direkte interaktioner med thymusepitel.
FTOCs har længe været anvendt til at analysere T-celle udvikling 3. Den store styrke af dette assay er at tillade dannelsen af alle modne T-celle-rum, en egenskab, der ydes af de effektive 3-D interaktioner af thymocyter med thymusepitel. Vi testede her to metoder i øjeblikket anvendes til at tømme endogene thymocytter således tillader effektiv kolonisering af udefra kommende stamfædre. Både ioniserende bestråling og deoxyguanosin behandling effektivt forarmet udvikle thymocytter. Dog kun bestrålede thymiske lapper lidt en robust udvikling T-celle i længere tid antyder, at d-Gua behandling kan også påvirke komponenterne i epitel rum. Embryonale thymus lapper blev koloniseret af eksogene forfædre ved hjælp af "hængende dråbe" metoden. Kolonisering af bestrålede lapper med begge populationer i konkurrence tillader detektering forskellige celle autonome biologiske egenskaber. Kolonisering med kun én af TSP delmængder afslører deres differentiering kapacitet i et ikke-konkurrencepræget miljø.
Ulempen ved denne metode er en lavere effektivitet i frekvensen af TSP, der udvikler sig til T-celler sammenlignet med OP9Dl co-kulturer 14. Men vi har gjort enkelt DN1 eller DN2 celler at kolonisere individuelle thymiske lapper med effektivitet tættere på det, der opnås med stromacellerne. En ti-fold reduction i effektivitet af T-celle produktion findes, når FL eller BM hæmatopoietiske progenitorer anvendes til FTOC, der ikke er observeret i OP9 delta lignende kulturer. Dette mindre effektiv udvikling tyder på, at ikke alle BM eller FL-celler med T-celle potentiale kan kolonisere thymus.
Podning koloniserede thymus flige giver en bedre næringsstof og iltforsyning til udvikling Thymi end i FTOC, og muligheden for at følge skæbnen for afkommet af TSP, in vivo. Ved anvendelse af disse to kombinerede strategier kunne vi beskrive trinene differentiering og funktionel potentiale afkommet af tsps. Fordi CD3 - / - mus CD45,2 15, der ikke kan udvikle modne T-celler, blev anvendt som værter, kunne vi sammen med CD45 allotypiske forskelle, utvetydigt følge nyligt genererede T-celler i deres naturlige miljøer
De hidtil ukendte aspekter af den eksperimentelle fremgangsmåde beskrevet her er kombinationen af rekonstitueret FTOCmed in vivo transplantation. Dette gav identificere og spore afkom af definerede delmængder af hæmatopoietiske stamceller. Vi fandt, at TSP fra den første og anden bølger generere forskellige undergrupper af γδT celler, forskellige antal αβT celler og har forskellige kinetikker af differentiering.
Stadium af embryonerne: dagen 0 anses 18 timer efter parring af musene, ifølge påvisning stik. Dissektioner af thymi kræver en god koldt lys 150 W, en kikkert dissektion mikroskop og nogle praksis for dissektioner, anæstesi og podede procedurer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Støttet af Pasteur Instituttet, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant 'lymfopoiese «), den REVIVE Future Investment Program og" La Ligue contre le Cancer ".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture Petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26 G ⅜" 0.45 x 10 mm syringes with needles | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility actions |
| Ketamine 100 mg/ml (stock solution) | MERIAL | Anesthesic | |
| Xylazine 100 mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3 mg/ml stock solution | AXIENCE | Morphinic analgesic | |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | Eye protection | |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fetal calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2-Mercaptoethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine iris scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps: Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| 2 pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1x270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5 x 7.5 cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
- Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu Rev Immunol. 26, 355-388 (2008).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Douagi, I., Andre, I., Ferraz, J. C., Cumano, A. Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation. Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).
- Calderon, L., Boehm, T. Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments. Cell. 149, 159-172 (2012).
- Adolfsson, J., et al. Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment. Cell. 121, 295-306 (2005).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26, 678-689 (2007).
- Ramond, C., et al. Two waves of distinct hematopoietic progenitor cells colonize the fetal thymus. Nat Immunol. 15, 27-35 (2014).
- Allison, J. P., Havran, W. L. The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors. Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Barbee, S. D., et al. Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 3330-3335 (2011).
- Douagi, I., Colucci, F., Di Santo, J. P., Cumano, A. Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver. Blood. 99, 463-471 (2002).
- Malissen, M., et al. Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene. EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).
