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Developmental Biology

Thymic की विशेषता का उपयोग कर माउस भ्रूण में progenitors निपटाने Published: June 9, 2015 doi: 10.3791/52795
Automatic Translation
1,3, 2, 3, 3, 3, 3
1Research Center Growth and Signaling, INSERM U845, Institut Cochin, 2Unit for Biology of Lymphocyte Populations, Immunology Department, Institut Pasteur and CIMI, Unity of Treg Biology and Therapy, University of Pierre & Marie Curie, 3Unit for Lymphopoiesis, Immunology Department, INSERM U668, University Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Institut Pasteur

Abstract

Thymic निपटाने के पूर्वज निस्र्पक lymphopenic रोगियों में टी सेल प्रतिस्थापन के लिए रणनीति वसीयत करने के लिए आवश्यक है, टी सेल के विकास के पूर्व Thymic चरणों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। हम इन विट्रो में पूरक दो से murine भ्रूण दिन 13 और 18 thymi से पूर्वज निपटाने Thymic का अध्ययन किया और इन विवो तकनीक में, दोनों "फांसी ड्रॉप" विधि पर आधारित है। इस विधि E13 और / या E18 उनकी संतान निम्नलिखित इस प्रकार CD45 allotypic मार्करों और द्वारा प्रतिष्ठित Thymic पूर्वज के साथ विकिरणित भ्रूण Thymic पालियों बस्तियां की अनुमति दी। आबादी के साथ या तो बसाना संभव प्रतिस्पर्धी चयनात्मक के दबाव को हटा जबकि मिश्रित आबादी के साथ औपनिवेशीकरण progenitors के जीवविज्ञान का गुण में सेल स्वायत्त मतभेद का विश्लेषण करने की अनुमति देता है। उपनिवेश Thymic पालियों भी ऐसी टी की जनसंख्या गतिशीलता के रूप में vivo में परिपक्व टी सेल संतान के विश्लेषण की अनुमति immunodeficient पुरुष प्राप्तकर्ता चूहों में grafted किया जा सकता हैवह प्रतिरक्षा प्रणाली और विभिन्न ऊतकों और अंगों के उपनिवेशन परिधीय। भ्रूण Thymic अंग संस्कृतियों E13 पूर्वज सभी में तेजी से विकसित CD3 + कोशिकाओं को परिपक्व पता चला है कि और वृक्ष के समान उपकला टी कोशिकाओं के रूप में जाना विहित γδ टी सेल सबसेट, को जन्म दिया है। इसकी तुलना में, E18 पूर्वज एक देरी भेदभाव किया है और वृक्ष के समान उपकला टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने में असमर्थ थे। / - - थाइमस-grafted CD3 के परिधीय रक्त की निगरानी चूहों आगे E18 Thymic निपटाने के पूर्वज है, समय के साथ, लघु अवधि के भ्रूण Thymic में की सराहना नहीं की जा सकी एक विशेषता है कि उनके E13 समकक्षों की तुलना में परिपक्व टी कोशिकाओं की बड़ी संख्या उत्पन्न पता चला है कि अंग संस्कृतियों।

Introduction

टी lymphocytes, αβ या γδ टी सेल रिसेप्टर (TCR) असर, एक विशेष अंग में थाइमस अलग। पूरी तरह से विकसित थाइमस दो अलग-अलग क्षेत्रों में आयोजित किया जाता है: उत्पादकता TCR β और α श्रृंखला जीन को पुनर्व्यवस्थित कि thymocytes क्रमादेशित मौत (सकारात्मक चयन के रूप में जाना जाता प्रक्रिया) से बचाया जाता है, जहां Thymic पूर्वज का विकास जहां कॉर्टेक्स, और; और आत्म ligands के लिए भी मजबूत जेट के साथ thymocytes चयनित जहां मज्जा, (नकारात्मक चयन) 1,2 नष्ट हो जाती हैं। थाइमस बाद में mesenchymal कोशिकाओं 3 से घिरा हुआ है कि तीसरे ग्रसनी थैली के endodermal परत से निकलती है। यह उसके बाद, सतत भर्ती सामान्य टी सेल विकास 4 के लिए आवश्यक है भ्रूण दिन E12 और, पर शुरू हिमेटोपोयटिक पूर्वज द्वारा उपनिवेश रहा है। Thymic आप्रवासियों एक कसकर विनियमित कार्यक्रम, शुरू की और माई द्वारा करवाया, लगातार विकास के चरणों के माध्यम से विकसित4 की तरह अपने ligand के साथ बातचीत पर thymocytes पर पायदान संकेतन मार्ग की सक्रियता, डेल्टा द्वारा ntained, Thymic उपकला कोशिकाओं (Tecs) पर व्यक्त 5।

Thymocyte विकास तथाकथित सीडी 4 में शुरू होता है - सीडी 8 - डबल नकारात्मक (डी.एन.) चरणों। , DN2 (CD25 + CD44 +) DN3 (CD25 + CD44 -) और DN4 (CD25 - CD44 -) - डी.एन. thymocytes आगे DN1 (CD44 + CD25) में CD25 और CD44 की अभिव्यक्ति के अनुसार विभाजित किया जा सकता है। CD24 (HSA) और CD117 (सी-किट) आगे DN1a और बी जल्दी Thymic पूर्वज (ईटीएफ) के अनुरूप हैं जहां 5 कैंपेन्स में DN1 डिब्बे subdivides। Thymocytes डी.एन. चरण में TCR δ, β और α जंजीरों को पुनर्व्यवस्थित और पूर्व TCR चयन (DN3-DN4 चरणों) से गुजरना। TCR α श्रृंखला सकारात्मक और नकारात्मक sele करने से पहले rearranges जहां सीडी 4 + सीडी 8 + डबल सकारात्मक (डीपी) डिब्बे में वे आगे पारगमनction है। इस स्तर पर सबसे thymocytes समाप्त हो जाते हैं और केवल एक छोटा सा प्रतिशत (3-5%) सीडी 4+ तक पहुंचने या CD8 + टी सेल डिब्बे परिपक्व।

ल्य्म्फोइड भेदभाव मार्ग multipotent पूर्वज (एमपीपी) और एरिथ्रोसाइट और महामूललोहितकोशिका 6 संभावित खो दिया है कि ल्य्म्फोइड-primed multipotent पूर्वज (LMPP) उत्पन्न कि HSCs के चरणों के माध्यम से प्रगति। सी-किट (CD117) की अभिव्यक्ति, SCA-1 और Flt3 / Flk2 (CD135) और इंटरल्यूकिन की detectable स्तर की अनुपस्थिति (- LMPP phenotypically (वंश नकारात्मक लिन) विभेदित रक्त कोशिका मार्कर की अनुपस्थिति से परिभाषित कर रहे हैं आईएल) -7 श्रृंखला α रिसेप्टर (आईएल 7rα या CD127)। LMPPs आगे कहा कि मंच द्वारा माइलॉयड कोशिकाओं को उत्पन्न करने की क्षमता खो दिया है कि आम ल्य्म्फोइड पूर्वज (सीएलपी) 7 में अंतर है। सीएलपी लिम्फोसाइट (बी और टी सेल), एन.के. सेल, डीसी और जन्मजात ल्य्म्फोइड सेल (ILC) संभावित बनाए रखने, और CD1 की अभिव्यक्ति के द्वारा LMPP से अलग27 और SCA-1 के उच्च स्तर के अभाव।

Thymic निपटाने के पूर्वज (टीएसपी) की प्रकृति को बड़े पैमाने पर 8 बहस की गई है, यद्यपि यह हाल ही में स्पष्ट हो गया है कि विकास के 9 भर में टीएसपी परिवर्तन फेनोटाइप, भेदभाव क्षमता और समारोह,। हम E13 (पहली लहर) या E18 (दूसरी लहर) से या तो छँटाई FACS सेल द्वारा पृथक टीएसपी, चिह्नित करने के लिए इन विट्रो में और vivo assays में प्रदर्शन किया। बराबर E13 और E18 progenitors के नंबर, अलग allotypic मार्करों असर द्वारा उपनिवेश एक समान विकास के वातावरण में अपने संतान निम्नलिखित अनुमति दी है और progenitors के दोनों प्रकार के बीच अलग अलग सेल आंतरिक गुणों का पता चला विकिरणित Thymic खण्डों के साथ भ्रूण Thymic अंग संस्कृतियों (FTOC)। E13 या E18 टीएसपी या तो द्वारा उपनिवेश Thymic पालियों की वजह से दोनों पूर्वज के बीच प्रतियोगिता के लिए चयन के बिना विकास की अनुमति दी। उपनिवेश Thymic पालियों के vivo प्रत्यारोपण आगे से पता चला है कि यह भी टीवह E13 के परिपक्व संतान और E18 टीएसपी विवो में विभिन्न जीवविज्ञान का गुण है। पहली लहर से TSPs तेजी से टी कोशिकाओं को उत्पन्न लेकिन αβ और γδ टी कोशिकाओं की कम संख्या को जन्म दे। बाद में हम एक अपरिवर्तनीय TCR, वे घाव भरने में एक समारोह में डालती है और केवल भ्रूण के विकास के लिए 10 के दौरान उत्पादन किया जाता है, जहां एपिडर्मिस की ओर पलायन किया है कि Vγ5Vδ1 वृक्ष के समान उपकला टी कोशिकाओं (DETC), का पता चला। इसके विपरीत, टीएसपी दूसरी लहर से TCR + टी कोशिकाओं की उच्च संख्या उत्पन्न करने के लिए लंबे समय लेने के लिए और DETC उत्पन्न करने में असमर्थ हैं।

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Protocol

आचार बयान: सभी प्रयोगों फ्रेंच कृषि मंत्रालय द्वारा अनुमोदित पाश्चर संस्थान एथिक चार्टर के अनुसार प्रदर्शन किया है, और यूरोपीय संघ के दिशा-निर्देशों के थे। कृषि के फ्रेंच मंत्रालय द्वारा प्रमाणित छोटे कृंतक सर्जरी पर प्रशिक्षण के साथ एक जोड़तोड़, सभी शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप करता है।
नोट: 5 कदम योजना प्रक्रिया दिखा एनेक्स 1 टेबल में देखें।

भ्रूण के 1. चुनाव

  1. 36/6 C57BL CD45.2 महिलाओं, 12 महिलाओं CD45.1, 12 C57BL 6 / CD45.1 पुरुषों और 12 C57BL 6 / CD45.2 पुरुषों का प्रयोग करें। पुरुष जीनोटाइप के साथ या तो महिलाओं को पार भ्रूण CD45.1 / 2 और CD45.1 प्राप्तकर्ता Thymic खण्डों के एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया टीएसपी या CD45.2 के एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल का उत्पादन होगा। सभा को व्यक्तिगत रूप से सभी पुरुषों।
  2. , E18 टीएसपी अलगाव के लिए भ्रूण प्राप्त 21 दिनों ग्राफ्टिंग प्रयोग से पहले 6 बजे, पर एक पुरुष CD45.1 साथ एक पिंजरे में 2 महिलाओं जगह है। दोपहर से पहले, अगले दिन एक योनि प्लग की उपस्थिति की जाँच करें। SEPAखामियों को दूर महिलाओं को रेट।
  3. E14 भ्रूण प्राप्त करने के लिए टीएसपी द्वारा उपनिवेश होने के लिए, 17 दिनों ग्राफ्टिंग प्रयोग से पहले पुरुषों CD45.2, का उपयोग करते हुए, (1.2) उपरोक्त प्रक्रिया को दोहराएँ।
  4. E13 टीएसपी अलग करने के लिए भ्रूण को प्राप्त करने के 16 दिनों के ग्राफ्टिंग प्रयोग से पहले, पुरुषों C57BL 6 / CD45.1 का उपयोग करते हुए, (1.2) उपरोक्त प्रक्रिया को दोहराएँ।

एक क्षैतिज लामिना का प्रवाह हुड के तहत भ्रूण की 2. विच्छेदन

नोट: ग्राफ्टिंग प्रयोग से पहले दो दिन।

  1. एक saturating बंद कक्ष में, कम से कम 5 मिनट के दौरान गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से या सीओ 2 गैस के प्रगतिशील प्रशासन द्वारा गर्भवती महिलाओं के बलिदान। हृदय सांस आंदोलनों की निश्चित की गिरफ्तारी से मौत सुनिश्चित करें। 70% इथेनॉल के साथ पेट को गीला करें।
  2. Midline के पेट पर त्वचा में एक अनुदैर्ध्य चीरा और अलग त्वचा खींच कर उसे खोलें। पाचन तंत्र को छूने के बिना संदंश और कैंची के साथ पेरिटोनियम खोलें। बाइफिड uter बाहर खींचोहमें कैंची से योनि से अलग और।
  3. 40-50 मिलीलीटर DPBS युक्त एक 90 x 15 मिमी पेट्री डिश में गर्भाशय प्लेस और प्रत्येक भ्रूण के पत्या के बीच transversally काटा।
  4. ठीक टिप कैंची की जोड़ी और एक ठीक संदंश के साथ, गर्भाशय की मांसपेशियों की झिल्ली को हटा दें नाल और जर्दी थैली के बीच काटने से भ्रूण को बाहर ले, और भ्रूण को बनाए रखना है, जो amnios, हटा दें।
  5. एक पेट्री डिश में भ्रूण रखें HBSS + 1% भ्रूण बछड़ा सीरम युक्त 90 x 15 मिमी (एफसीएस)। ई 15 से अधिक भ्रूण पुराने के लिए, किसी भी आगे विच्छेदन से पहले कैंची की एक जोड़ी के साथ सिर को हटा दें।

थाइमस 3. अलगाव

  1. दूरबीन आवर्धक लेंस के तहत, एक गीला धुंध बिस्तर पर, लापरवाह स्थिति (उदर दृश्य) में झूठ बोल रही है, भ्रूण रखें।
  2. , अनुलंबीय उरोस्थि की उपास्थि के साथ एक संदंश डालें चुटकी और वक्ष ग्रिड खोलें। घुमावदार संदंश के साथ, टी कल्पना करने के लिए एक तरफ वक्ष दीवार खींचश्वासनली के प्रत्येक पक्ष पर hymic पालियों।
  3. ध्यान से एक ठीक संदंश के साथ नीचे बन्द रखो द्वारा प्रत्येक पालि पकड़ और 1 मिलीलीटर HBSS + 1% एफसीएस युक्त एक पेट्री डिश में उन्हें जगह है। पालियों अलग करने और कैप्सूल को नुकसान पहुँचाए बिना, दो 1 मिलीलीटर सीरिंज + 26 जी ⅜ "सुइयों के साथ आसपास के संयोजी ऊतक को हटा दें।
  4. रक्त कोशिकाओं को खत्म करने के लिए HBSS + 1% एफसीएस के 3 मिलीलीटर में पालियों धो लें।
    नोट: E15 पहले, Thymic पालियों एक द्वि-लोबार अंग गठन करने के लिए बीच में श्वासनली और बाद में फ्यूज के प्रत्येक पक्ष पर स्थित हैं।

4. सेल निलंबन

  1. HBSS + 1% एफसीएस में 1 मिलीलीटर सीरिंज पर मुहिम शुरू की दो 26 जी सुइयों के साथ, दूरबीन आवर्धक लेंस के तहत पालियों अलग छेड़ो। एक नायलॉन जाल के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर।

फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी और सेल छँटाई के साथ 5. धुंधला

नोट: सभी एंटीबॉडी पहले से आबादी का इष्टतम परिभाषा (titrat प्राप्त करने के लिए titrated रहे हैंआयन) एंटीबॉडी बैच के साथ अलग-अलग हो सकते हैं।

  1. वंश सकारात्मक कोशिकाओं दाग biotinylated एंटीबॉडी के एक कॉकटेल के 100 μl के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 15-30 मिनट के लिए thymocytes (E13 या E18) सेते (विरोधी CD19, विरोधी GR1, विरोधी Ter119, विरोधी NK1.1 , विरोधी CD11c, विरोधी CD3, विरोधी सीडी 4, विरोधी सीडी 8, विरोधी CD25)।
  2. एंटीबॉडी 7 मिनट के लिए 280 XG पर 4 मिलीलीटर HBSS + 1% एफसीएस के साथ ट्यूब नीचे स्पिन की दूरी पर अतिरिक्त धोने के लिए सतह पर तैरनेवाला को खत्म करने और फिर से निलंबित ताजा HBSS + 1% एफसीएस में गोली। Centrifugation के दोहराएँ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के दौरान streptavidin microbeads के साथ E18 बायोटिन लेबल की कोशिकाओं को सेते हैं और दो बार HBSS के 1% एफसीएस में कोशिकाओं को धो लें। 2 मिलीलीटर HBSS + 1% एफसीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित। अधिकांश E13 thymocytes वंश नकारात्मक होते हैं और इसलिए सेल छँटाई करने के लिए पहले एमएसीएस संवर्धन की जरूरत नहीं है।
  4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, लोकसभा स्तंभ पर कोशिकाओं से गुजरती हैं। सभी सेल निलंबन में प्रवेश किया स्तंभ 2 मिलीलीटर HBSS + 1% एफसीएस जोड़ें। पुनर्प्राप्तस्तंभ की 4 एमएल 280 x जी पर 7 मिनट के लिए कोशिकाओं के माध्यम से प्रवाह और अपकेंद्रित्र।
  5. पुनः निलंबित समाप्त E18 या टीएसपी एंटीबॉडी मिश्रण के 50 μl (एंटी-CD117 एपीसी, विरोधी CD135 पे, विरोधी CD127 PECy7, विरोधी CD24 FITC, विरोधी CD44 APCCy7 और streptavidin प्रशांत ब्लू में कुल E13 thymocytes या तो गोली ) और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. 4 मिलीलीटर HBSS + 1% एफसीएस और साथ कोशिकाओं को धो 1 मिलीलीटर HBSS में propidium आयोडाइड के साथ + 1% एफसीएस कोशिकाओं फिर से निलंबित।
  7. क्रमबद्ध TSPs लिन - 200 μl पूरा मध्यम + 20% एफसीएस युक्त एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब पर (4 लेज़रों के साथ) एक FACS में CD44 + CD117 + CD24 कम CD127 + CD135 + कोशिकाओं। FSC और एसएससी चैनलों पर उनके आकार और विघटन के अनुसार गेट पहली कोशिकाओं। (Propidium आयोडाइड के साथ धुंधला) मृत कोशिकाओं, गेट बाहर दोहरी हटा दें और घातीय तराजू में प्रतिदीप्ति स्कोर। करीब 100 या 600 TSPs एक E13 या एक E18 थाइमस, respectiv से प्राप्त किया जा सकता हैइली।

Progenitors साथ 6. औपनिवेशीकरण E14 के Thymic पालियों: फांसी ड्रॉप तकनीक

  1. (30 Grays = 30 Gy) CD45.2 भ्रूण से E14 Thymic पालियों, संस्कृति से पहले 3 घंटा चमकाना।
    नोट: E14 या E15 Thymic पालियों सफलतापूर्वक टी सेल progenitors के प्राप्तकर्ता के रूप में इस्तेमाल किया गया है। पहले गर्भावधि दिनों में Thymic पालियों खराब विकसित करते समय शायद कारण उपकला कोशिकाओं के अधूरे विकास के लिए, की वजह से अंग के बड़े आकार के लिए समय से पहले नेक्रोसिस में बाद में गर्भावधि दिनों परिणामों के प्राप्तकर्ता Thymic खण्डों का उपयोग करना।
  2. अपकेंद्रित्र TSPs और फिर से निलंबित कोशिकाओं संस्कृति के माध्यम में (10% एफसीएस साथ Opti- सदस्य पूरा मध्यम, पेनिसिलिन (50 इकाइयों / एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) और 2β-mercaptoethanol (50 माइक्रोन)) के अनुसार क्रमबद्ध कि इस तरह के 35 μl 500 टीएसपी होते हैं।
  3. एक 60 अच्छी तरह से Terasaki थाली के हर दूसरे को अच्छी तरह से सेल निलंबन के 35 μl बूंद रखें।
    नोट: वे सटे कुओं में रखा जाता है तो 35 μl बूँदें फ्यूज कर सकते हैं।
  4. प्रत्येक बूंद की सतह पर एक विकिरणित पालि रखें। Terasaki थाली को बंद करें और कोशिकाओं को गंभीरता से बूंद के शिखर ध्रुव तक पहुँच जाने के लिए उल्टा थाली की बारी है।
  5. मारो धीरे उल्टे थाली के ऊपरी ओर बूंद के शिखर किनारे करने के लिए स्लाइड करने के लिए पालियों मजबूर करने के लिए। 37 डिग्री सेल्सियस 5% सीओ 2 में 48 घंटे के लिए एक humidified इनक्यूबेटर में उलटा Terasaki थाली सेते हैं। एक प्राप्तकर्ता वयस्क माउस 8 के गुर्दे कैप्सूल के तहत उपनिवेशन, या तो संस्कृति E14 FTOC 7 में thymi, या भ्रष्टाचार के बाद।

7. भ्रूण Thymic अंग संस्कृति

  1. एक 35 मिमी पेट्री डिश पर पूरा मध्यम के 3 मिलीलीटर रखें। मध्यम पर तैर एक isopore झिल्ली फिल्टर रखें। एक संदंश (एक झिल्ली पर कोई अधिक से अधिक 8 पालियों) के साथ झिल्ली के किनारे पर पुनर्गठित पालियों रखें।
  2. Wate के 2 मिलीग्राम से युक्त, कवर के बिना, एक 35 मिमी पकवान के साथ एक साथ, एक 90 मिमी पेट्री डिश के अंदर Thymic पालियों युक्त पेट्री डिश रखेंआर, इष्टतम नमी सुनिश्चित करने के लिए। 37 डिग्री सी + 5% सीओ 2 के 12 दिनों के सेते हैं।

बाँझ शर्तों के तहत किडनी कैप्सूल के तहत 8. Grafts

नोट: गुर्दे पैरेन्काइमा एक कैप्सूल के गठन संयोजी ऊतक से घिरा हुआ है। उप-सम्पुटी क्षेत्र रक्त और इस तरह ग्राफ्ट के विकास के लिए एक उपयुक्त वातावरण (जैसे Thymic खण्डों, अग्नाशय के टापू या नवजात दिल) उपलब्ध कराने के लसीका वाहिकाओं में विशेष रूप से समृद्ध है। यह सही गुर्दे की तुलना में अधिक सुलभ है क्योंकि Grafts आमतौर पर बायां गुर्दा पर किया जाता है। CD3 - / - पुरुष चूहों E15 से पहले लिंग निर्धारण आसानी से नहीं किया जाता है क्योंकि प्राप्तकर्ताओं इस प्रकार की वजह से वाई गुणसूत्र से जुड़ा हुआ नाबालिग उतक अनुरूपता एंटीजन को मेजबान प्रतिक्रिया बनाम भ्रष्टाचार से बचने के रूप में इस्तेमाल किया गया।

  1. उपकरणों जीवाणुरहित और शल्य चिकित्सा के साथ बाँझ दस्ताने पहनते हैं। Ketamine 10 मिलीग्राम / एमएल + Xylazine 1 मिलीग्राम की एक समाधान की इंट्रा पेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा माउस anesthetize /मिलीलीटर पीबीएस में पतला: (10 ग्राम शरीर के वजन के प्रति 50 से 100 μl), 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर। Interdigital सजगता की कमी की जाँच करके संज्ञाहरण की जाँच करें। संज्ञाहरण के दौरान सूखापन को रोकने के लिए हर आंख पर पन Optimune जेल की एक बूंद रखें।
    नोट: समाधान बिना तैयारी किए हुए तैयार किया है और इंजेक्शन से पहले कमरे के तापमान पर गर्म किया जाना चाहिए। संज्ञाहरण कम से कम 20 मिनट तक रहता है। संज्ञाहरण की डिग्री सभी सर्जरी के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए। संज्ञाहरण हर 20 मिनट खुराक आधे का इंट्रा पेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा लंबे समय तक किया जा सकता है।
  2. एक क्षैतिज पटल प्रवाह हुड के तहत, इसकी सही पक्ष पर माउस रखें। 70% इथेनॉल और 10% आयोडाइड जिल्द का समाधान के साथ शल्य चिकित्सा क्षेत्र जीवाणुरहित। एक संदंश भाग के साथ बस हिंद पैर के संयुक्त के ऊपर एक 2 सेमी लंबाई के साथ माउस बाल। शल्य चिकित्सा के क्षेत्र दाढ़ी।
  3. एक स्केलपेल के साथ, कैंची मांसपेशियों के ऊतकों में कटौती फिर साथ, पहले, त्वचीय ऊतक का एक चीरा 1.5 सेमी लंबाई बनाते हैं। चीरा के दोनों पक्षों के लिए एक मामूली दबाव लागू करें, उदर गुहा के बाहर गुर्दे के लिए मजबूर होगा।
  4. नम गुर्दे रखने के लिए एक कपास कली के साथ खारा लागू करें। आप अंग को उजागर करने में समस्या आती है, तो गुर्दे से जुड़ा हुआ है, जो करने के लिए आसपास के adipocyte ऊतक बाहर खींचने के लिए एक फ्लैट संदंश का उपयोग करें। अंग के नीचे रखा एक कपास कली से retroperitoneal गुहा के बाहर गुर्दे बनाए रखें।
  5. दो ठीक संदंश के साथ, (रक्तस्राव को रोकने के लिए पैरेन्काइमा छूने से बचने) कैप्सूल में एक 2-3 मिमी छेद बना। पूरे शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान लगातार सिक्त उजागर गुर्दे कैप्सूल रखने के लिए।
  6. खोला कैप्सूल की दीवार बनाए रखने के द्वारा, गुर्दे कैप्सूल के तहत ध्यान से पालियों डालें और धार ध्रुव की ओर कैप्सूल के तहत भ्रष्टाचार के स्लाइड। गुर्दे की प्रति 6 खण्डों के लिए ऊपर रखें।
  7. रेट्रो-पेरिटोनियल गुहा में गुर्दे बदलें। पेशी aponeuroses, व्यक्तिगत सर्जन गांठ के साथ फिर त्वचा सीवन। 10% आयोडाइड povidone समाधान के साथ घाव गीले। एक गर्म देहात पर माउस रखें37 डिग्री सेल्सियस पर डी।
  8. हृदय, श्वसन और गलमुच्छा आंदोलनों, स्वयं के द्वारा देखा कुल वसूली आंदोलनों निहित जब तक श्लैष्मिक रंग के नियंत्रण से संज्ञाहरण से पूरी वसूली तक प्रत्यारोपित माउस सर्वेक्षण।
    नोट: हम सिर्फ सर्जरी के बाद एनाल्जेसिक समाधान (Buprenorphin, 0.1 मिलीग्राम / किग्रा) इंट्रा पेशी के इंजेक्शन की सलाह देते हैं और 2 दिनों के बाद सर्जरी के दर्द को रोकने के लिए सर्जरी के बाद।
  9. पूरी तरह से ठीक है जब तक अलगाव में संचालित पशु रखें। सत्यापित करने और संक्रमण को रोकने के लिए हर दूसरे दिन घाव के टांके का निरीक्षण किया। इस प्रक्रिया के बाद घाव संक्रमण कभी नहीं देखा।
    नोट: CD3 से परिधीय रक्त कोशिकाओं की साप्ताहिक विश्लेषण - / - grafted चूहों हमें व्युत्पन्न आबादी CD45 allotypic मार्कर और टी सेल वंश विशिष्ट एंटीबॉडी (चित्रा 3) का उपयोग E13 या E18 पूर्वज या तो से उत्पन्न Thymic पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं।

फ्लो द्वारा टीएसपी संतान की 9. विश्लेषण

  1. एक एंटीबॉडी मिश्रण CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, सीडी 4 APCCy7, सीडी 8 एपीसी, CD3 प्रशांत ब्लू, Vγ5 FITC, Vδ1 पीई पहचानने एंटीबॉडी युक्त और खंड 5 में वर्णित के रूप में सेते के साथ अलग-अलग पालियों से दाग सेल निलंबन।
  2. HBSS में 1% एफसीएस + propidium आयोडाइड कोशिकाओं पुनः निलंबित और (चित्रा 2 में परिणाम देखें) कोशिकामापी एक प्रवाह में विश्लेषण करते हैं।

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Representative Results

बस्तियां पूर्वज का सबसे अच्छा विकास की अनुमति अंतर्जात thymocytes की Thymic पालियों खलाना करने के लिए एक विधि का चयन करने के लिए, हम विकिरण के बाद उपनिवेश Thymic पालियों में टी सेल पुनर्गठन के स्तर या 5 दिन डिओक्सी-ग्वानोसिन (D-गुआ) उपचार की तुलना में। परिणामों संस्कृति के 9 दिन में कोई अंतर नहीं है, जबकि किरणित पालियों इस प्रकार दिन 12 में, विकिरण के बाद टी सेल विकास प्राप्त करने के लिए डी-गुआ उपचार की तुलना में अधिक उपयुक्त है, डी-गुआ के साथ इलाज किया उन लोगों की तुलना में अधिक टी कोशिकाओं निहित बताते हैं कि Thymic उपनिवेशन (चित्रा 1)। E13 और E18 टीएसपी की विकास क्षमता का अध्ययन करने के लिए, हम E14 progenitors के दो प्रकार के बराबर संख्या का एक मिश्रण के साथ Thymic पालियों किरणित उपनिवेश। परिणामों E13 TSPs इसके विपरीत कम thymocytes और E18 टीएसपी से भी कम डीपी लेकिन, को जन्म दे बताते हैं कि, E13 टीएसपी DETC और CD3 + के उच्च आवृत्तियों कोशिकाओं (चित्रा 2) परिपक्व उत्पन्न करते हैं। इन विवो पॉट का विश्लेषण करने के लिए/ - - E13 और E18 टीएसपी के ential, progenitors के प्रत्येक प्रकार के साथ उपनिवेश Thymic पालियों CD3 के गुर्दे कैप्सूल के तहत grafted गया प्राप्तकर्ताओं। परिणामों FTOC के साथ संगत, E13 टीएसपी तेजी E18 पूर्वज की तुलना में टी कोशिकाओं को जन्म दिया लेकिन परिसंचारी टी कोशिकाओं की संख्या काफी कम (चित्रा 3) था, कि दिखाते हैं।

चित्र 1
चित्रा 1: टी सेल विकास, इलाज deoxyguanosine की तुलना में उपनिवेश Thymic पालियों विकिरणित में और अधिक कुशल है E14 Thymic पालियों (CD45.2) थे, या तो 30 Gy के साथ विकिरणित या डिओक्सी-ग्वानोसिन (D-गुआ) के साथ 5 दिनों के लिए इलाज किया।। एक फिल्टर पर 48 घंटे के लिए छोड़ देता है और सुसंस्कृत फांसी में, CD117 + Sca -1 CD45.1 / 2 भ्रूण से अलग + (LSK) E14 फ्लोरिडा कोशिकाओं - Thymic पालियों तो 1000 लिन के साथ उपनिवेश थे। कोई मतभेद एन की दक्षता में मनाया गयाThymic पालियों की दो समूहों के बीच dogenous thymocyte कमी। CD45.1, CD45.2, CD3, Vγ5, Vδ1 और सीडी 4 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग thymocytes विकास FACS द्वारा दिन 9 और 12 पर विश्लेषण किया गया। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: E18 के विपरीत, E13 TSPs उत्पन्न Vγ5Vδ1 DETC CD45.2 Thymic पालियों किरणित और CD45.1 भ्रूण से CD45.1 / 2 भ्रूण से 500 E13 टीएसपी और 500 E18 टीएसपी के एक मिश्रित पलटन के साथ 48 घंटे के लिए उपनिवेश थे। । इन प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, E13 और E18 टीएसपी केवल सेल आंतरिक जीवविज्ञान में मतभेद प्रतिबिंबित कर सकते हैं एक ही पर्यावरण और संस्कृति के बाद मनाया भेदभाव और परिपक्व टी सेल सबसेट की दर में मतभेद में विकसितगुण। अलग-अलग पालियों से संस्कृति thymocytes में 12 दिनों cytometry के एंटीबॉडी, CD45.2, सीडी 4, सीडी 8, CD3, Vγ5, Vδ1 CD45.1 पहचानने के साथ धुंधला के बाद प्रवाह द्वारा विश्लेषण किया गया बाद। (ए) पैनलों प्रत्येक पाली में बरामद कोशिकाओं की संख्या दिखाते हैं। (बी) के प्रोफाइल cytometry के प्रतिनिधि प्रवाह। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: E13 TSPs तुलना में तेजी से विकसित E18 TSPs CD45.2 Thymic पालियों किरणित और 500 E13 टीएसपी या CD45.1 भ्रूण से 500 E18 टीएसपी के साथ 48 घंटे के लिए उपनिवेश थे।। CD3 - / - चूहों E13 या E18 TSPs के साथ या तो उपनिवेश 4 Thymic पालियों साथ grafted थे। परिधीय रक्त साप्ताहिक अंतराल पर एकत्र की है और कर के लिए FACS द्वारा विश्लेषण किया गया थाऔर न ही (CD45.1) CD3 + टी कोशिकाओं। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

स्टेप 1 E18 भ्रूण दिन (-21) प्राप्त करने के लिए चूहों संभोग; E14 भ्रूण दिन (-17) प्राप्त करने के लिए चूहों संभोग; E13 भ्रूण प्राप्त करने के लिए चूहों संभोग (दिन -16)
कदम 2A भ्रूण के विच्छेदन, दिन -2
कदम 2 बी E14 Thymic पालियों की विकिरण, दिन -2
कदम -2 सी , धुंधला तैयार कर रहा है, और E13 और E18 से कोशिकाओं छँटाई Thymic पालियों, दिन -2
कदम 2D फांसी ड्रॉप संस्कृति, दिन -2
कदम 3 ए भ्रूण Thymic अंग संस्कृति, 0 दिन
कदम 3 बी गुर्दे कैप्सूल के तहत भ्रष्टाचार, 0 दिन चरण 4 FTOC: प्रवाह cytometry विश्लेषण, दिन 12
चरण 5 भ्रष्टाचार: टी कोशिकाओं परिसंचारी के cytometry विश्लेषण साप्ताहिक प्रवाह, दिन 15, 22, 35

तालिका 1:। 5 कदम प्रक्रिया grafted चूहों का विश्लेषण करने के लिए विभिन्न माउस उपभेदों के संभोग से प्रयोग का प्रयोग समय सारणी में पीछा किया। Grafts 7 सप्ताह पुरानी चूहों में प्रदर्शन कर रहे हैं। 0 दिन के रूप में प्रत्यारोपण के समय ले रहा है, दिन -21 E18 भ्रूण प्राप्त करने के लिए चूहों के संभोग, E14 भ्रूण प्राप्त करने के लिए दिन -17, E13 भ्रूण प्राप्त करने के लिए दिन -16, और दिन में -2 E13 और E18 टीएसपी की छँटाई है , विकिरण Thymic पालि और ड्रॉप तकनीक फांसी।

एंटीबॉडी क्लोन नंबर एंटीबॉडी क्लोन नंबर
CD25 7D4 CD19 6D5
CD44 IM7 टेर 119 आतंकवाद-119
CD24 एम 1/69 NK1.1 पी 136
CD117 2B8 CD11c HL3
CD3 145-2C11 GR1 RB6-8C5
सीडी 4 RM4-5 जी.डी. eBioGL3
सीडी 8 53-6.7 Sca-1 D7
CD135 A2F10 CD45.2 104
CD127 A7R34 Ly5.1 A20

तालिका 2: एंटीबॉडी और क्लोन संख्या।

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Discussion

दो मुख्य assays के टी सेल भेदभाव पूर्व vivo विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सबसे हाल ही में सूचना दी 1 या 4 से 12 की तरह Noth1 की ligands, डेल्टा व्यक्त बी.एम. stromal कोशिकाओं, OP9 साथ hematopoietic progenitors के सह संस्कृति है। यह 2-डी परख पर विश्लेषण की अनुमति, अत्यधिक कुशल और संवेदनशील, प्रदर्शन करने के लिए आसान है एकल कोशिका के स्तर। हालांकि, यह न तो Thymic उपकला के साथ सीधे बातचीत की आवश्यकता होती है, जो दोनों के डी पी के मंच और न ही γδ DETC 13 की पीढ़ी, परे टी सेल के विकास का समर्थन करता है।

FTOCs लंबे टी सेल के विकास के लिए 3 विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस परख के प्रमुख शक्ति सभी की पीढ़ी के टी सेल के डिब्बों, Thymic उपकला साथ thymocytes के कुशल 3-डी बातचीत द्वारा दी गई एक संपत्ति परिपक्व की अनुमति है। हम यहाँ दो तरीकों वर्तमान में इस प्रकार बहिर्जात पूर्वज द्वारा कुशल उपनिवेशन की इजाजत दी अंतर्जात thymocytes खलाना करने के लिए इस्तेमाल का परीक्षण किया। दोनों आयनीकरण विकिरण और deoxyguanosine उपचार कुशलता thymocytes विकासशील समाप्त हो गया। हालांकि, केवल विकिरणित Thymic पालियों भी उपकला डिब्बे के घटकों को प्रभावित कर सकता है कि डी-गुआ उपचार का सुझाव दे समय की लंबी अवधि के लिए एक मजबूत टी सेल विकास निरंतर। भ्रूण Thymic पालियों "फांसी ड्रॉप" पद्धति का उपयोग बहिर्जात पूर्वज द्वारा उपनिवेश थे। प्रतियोगिता में दोनों आबादी के साथ विकिरणित पालियों की औपनिवेशीकरण अलग सेल स्वायत्त जीवविज्ञान का गुण का पता लगाने की अनुमति देता है। टीएसपी कैंपेन्स का केवल एक ही साथ औपनिवेशीकरण एक गैर-प्रतिस्पर्धी माहौल में उनके भेदभाव क्षमता का पता चलता है।

इस विधि के नुकसान OP9Dl सह संस्कृतियों 14 की तुलना में टी कोशिकाओं में विकसित कि टीएसपी की आवृत्ति में एक कम क्षमता है। हालांकि हम करीब stromal कोशिकाओं के साथ प्राप्त करने के लिए कि दक्षता के साथ व्यक्तिगत Thymic पालियों उपनिवेश स्थापित करने के लिए एकल DN1 या DN2 कोशिकाओं किया है। दस गुना रिडक्शियोफ्लोरिडा या बी.एम. हिमेटोपोयटिक पूर्वज संस्कृतियों की तरह OP9 डेल्टा में नहीं मनाया जाता है कि FTOC के लिए उपयोग किया जाता है जब एन टी सेल उत्पादन की क्षमता में पाया जाता है। यह कम कुशल विकास टी सेल की क्षमता के साथ सभी बी.एम. या फ्लोरिडा कोशिकाओं थाइमस उपनिवेश स्थापित नहीं कर सकते हैं कि पता चलता है।

उपनिवेश Thymic पालियों कलम बांधने का काम FTOC की तुलना में thymi विकसित करने के लिए एक बेहतर पोषक तत्व और ऑक्सीजन की आपूर्ति, और vivo में, टीएसपी की संतान के भाग्य का पालन करने के लिए संभावना प्रदान करता है। इन दो संयुक्त रणनीतियों का प्रयोग हम भेदभाव और TSPs की संतान के कार्यात्मक क्षमता के चरणों का वर्णन सकता है। / - - CD3 क्योंकि परिपक्व टी कोशिकाओं का विकास नहीं कर सकते हैं कि चूहों CD45.2 15, हम CD45 allotypic मतभेदों के साथ एक साथ, मेजबान के रूप में कर सकता है इस्तेमाल किया गया, असंदिग्ध रूप से उनके प्राकृतिक वातावरण में नव सृजित टी कोशिकाओं का पालन करें

यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रिया के उपन्यास पहलुओं पुनर्गठन FTOC का संयोजन हैइन विवो प्रत्यारोपण के साथ। यह पहचान करने और hematopoietic progenitors के परिभाषित कैंपेन्स की संतान अनुरेखण की अनुमति दी। पहली और दूसरी लहरों γδT कोशिकाओं के विभिन्न सबसेट, αβT कोशिकाओं के विभिन्न संख्या पैदा करते हैं और भेदभाव के विभिन्न कैनेटीक्स है से हम जानते हैं कि टीएसपी पाया।

भ्रूण के स्टेज: 0 दिन प्लग का पता लगाने के अनुसार, 18 घंटा चूहों के संभोग के बाद माना जाता है। Thymi की Dissections एक अच्छी ठंड प्रकाश 150 डब्ल्यू, एक दूरबीन विच्छेदन माइक्रोस्कोप और dissections, संज्ञाहरण और भ्रष्टाचार प्रक्रियाओं के लिए कुछ अभ्यास की आवश्यकता है।

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

Acknowledgments

पाश्चर संस्थान, INSERM, एजेंस नेशनल डे Recherche ANR (अनुदान 'Lymphopoiesis') को पुनर्जीवित भावी निवेश कार्यक्रम और "contre Le कैंसर ला लीग" के द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture Petri dishes. TPP T93100/T9340 Sampling
26 G ⅜" 0.45 x 10 mm syringes with needles BD Plastipak 300015 Cell suspension
Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. SEFAR NITEX 03-100/32 Filtration of cells
Ethanol 70%. VWR 83801.36 Sterility actions
Iodide Povidone 10% (Betadine) MEDA Pharma 314997.8 Sterility actions
Ketamine 100 mg/ml (stock solution) MERIAL Anesthesic
Xylazine 100 mg/ml in PBS (stock solution) Sigma X1251-1G Anesthesic and muscle relaxant
Buprenorphin 0.3 mg/ml stock solution AXIENCE Morphinic analgesic
Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) Schering-Plough Animal Health Eye protection
DPBS (+ CaCl2, MgCl2) GIBCO Life Technology 14040-174 to isolate embryos
HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) GIBCO Life Technology 24020-091 to wash out the blood and dissect the embryos
OPTI-MEM I GlutaMAX I GIBCO Life Technology 51985-026 Medium for cultures
Fetal calf serum EUROBIO CVFSVF00-0U additive for cultures
Penicilin and streptomycin GIBCO Life Technology 15640-055 Antibiotics for cultures
2-Mercaptoethanol GIBCO Life Technology 31350010 additive for cultures
LEICA MZ6 Dissection microscope LEICA MZ6 10445111 Occular W-Pl10x/23
Cold lamp source SCHOTT VWR KL1500 compact Two goose neck fibers adapted
Silicone elastomer World Precision Instruments SYLG184 Dissecting Pad
Spoon, round and perforated Fine Science Tools 10370-18 Dissection tools
Fine iris scissors Fine Science Tools 14090-09 Dissection tools
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15018-10 Dissection tools
Forceps: Dumont #5/45 Inox 11 cm F.S.T. 11253-25 Dissection tools
2 pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. Fine Science Tools 11295-20 Dissection tools
Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c ETHICON F2403 for sutures
Needle-holder MORIA/F.S.T. 12060-02 for sutures
Heating pad VWR 100229-100 To maintain mouse temperature during anesthesy
Membrane Isopore RTTPO2500 DUTSCHER 44210 For FTOC
Terasaki 60 wells plates FISHER 1x270 10318801 For hanging drop technique
Gauze swabs steriles 7.5 x 7.5 cm Hydrex 11522 To apply disinfecting solution
Fluorescence or biotin labelled antibodies BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences  Clone Number see table below Staining cells
MACS Columns/Streptavidin Microbeads Miltenyi Biotec 130-042-401/130-048-101 Cell depletion
Mice Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs  (CD45.2) C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 Source of cells and thymic lobes
Mice CDTA Orléans, France CD 3 epsilon Ko CD45.2 Grafting experiment

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 100 Thymopoiesis progenitors प्रसार भेदभाव FTOC (भ्रूण Thymic अंग संस्कृति) भ्रष्टाचार किडनी कैप्सूल
Thymic की विशेषता का उपयोग कर माउस भ्रूण में progenitors निपटाने<em&gt; Vivo</em&gt; और<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Assays
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Ramond, C., Bandeira, A., Berthault, … More

Ramond, C., Bandeira, A., Berthault, C., Pereira, P., Cumano, A., Burlen-Defranoux, O. Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays. J. Vis. Exp. (100), e52795, doi:10.3791/52795 (2015).

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