Abstract
Karakteriserer tymiske bosetting stamfedre er viktig å forstå de pre-thymic stadier av T-celle utvikling, avgjørende for å utarbeide strategier for T-celle utskifting i lymphopenic pasienter. Vi studerte tymisk settling progenitorer fra murine embryoniske dag 13 og 18 thymus ved to komplementære in vitro og in vivo teknikker, begge basert på "hengende dråpe" -metoden. Denne metoden tillot kolon bestrålte foster tymiske lapper med E13 og / eller E18 tymiske progenitors preget av CD45 allotypic markører og dermed følge deres avkom. Kolonisering med blandede bestander lar analysere cellestyrte forskjeller i biologiske egenskapene til forfedrene mens kolonisering med enten befolkningen fjerner mulige konkurranse selektive press. De koloniserte tymiske fliker kan også bli podet på immunsvikt hann resipientmus tillater analyse av modne T-celle-avkom in vivo, slik som populasjonsdynamikk tHan perifere immunsystemet og kolonisering av forskjellige vev og organer. Foster tymiske organkulturer viste at E13 forfedre utviklet seg raskt til alle modne CD3 + celler og ga opphav til den kanoniske γδ T-celle undergruppe, kjent som dendrittiske epitelceller T-celler. Til sammenligning E18 stamceller er en forsinket differensiering og var ikke i stand til å generere dendrittiske epithelial T-celler. Overvåkingen av perifert blod fra thymus-podet CD3 - / - mus viste videre at E18 tymisk avsetnings progenitorceller generere, med tiden, større antall modne T-celler enn sine motstykker E13, en funksjon som ikke kunne bli verdsatt på kort sikt fetal tymisk orgel kulturer.
Introduction
T-lymfocytter, bærer αβ eller γδ T-celle reseptor (TcR), skille i et spesialisert organ, thymus. Det fullt utviklet thymus er organisert i to forskjellige regioner: cortex, der thymic forfedre utvikle og hvor tymocytter at produktivt omorganisere TCR β og α kjede gener blir reddet fra programmert død (en prosess som kalles positiv seleksjon); og medulla, hvor valgt thymocyttene med for sterk reaktivitet til selv ligander slettes (negativ seleksjon) 1,2. Thymus stammer fra endodermal laget av det tredje faryngeale posen som senere omgitt av mesenchymale celler 3. Det er kolonisert av blodkreft stamceller som starter på embryonale dag E12, og deretter blir kontinuerlig rekruttering nødvendig for normal T celle utvikling 4. Tymiske innvandrere utvikle seg gjennom suksessive utviklingsstadier, orkestrert av et tett regulert program, initiert og maintained ved aktivering av Notch signalveien på thymocytter ved interaksjon med dets ligand, delta som 4, uttrykt på tymiske epitel-celler (TECS) 5.
Thymocytt utvikling starter på den såkalte CD4 - CD8 - double negative (DN) stadier. DN thymocyttene kan videre deles i henhold til uttrykk av CD25 og CD44 inn DN1 (CD25 - CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) og DN4 (CD25 - CD44 -). CD24 (HSA) og CD117 (c-Kit) subdivides videre DN1 rommet i fem undergrupper hvor DN1a og b tilsvarer tidlige tymiske stamfedre (ETP). Thymocyttene omorganisere TCR δ, β og α kjedene på DN scenen og gjennomgå forhånds TcR utvalg (DN3-DN4 etapper). De videre transitt til CD4 + CD8 + dobbel positive (DP) rommet der TcR α-kjeden ordner før positive og negative seleDette skjer. På dette stadiet fleste thymocytter elimineres, og bare en liten prosentandel (3-5%) når CD4 + eller CD8 + T-celle modne rommet.
Lymfoid differensiering pathway skrider gjennom stadier av HSCs som genererer multipotente stamceller (MPP) og lymfoid-primet multipotente stamceller (LMPP) som mistet erytrocytt og megakaryocytt potensial 6. LMPP er definert fenotypisk ved fravær av differensierte blodcellemarkører (avstamning negativ, Lin -), ekspresjon av c-kit (CD117) SCA-1 og Flt3 / Flk2 (CD135) og fravær av påvisbare nivåer av interleukin ( IL) -7-reseptor α kjede (IL-7rα eller CD127). LMPPs ytterligere differensiere til felles lymfoide stamfedre (CLP) 7 som på det stadiet har mistet evnen til å generere myeloide celler. CLP beholder lymfocytt (B og T-celle), NK-celle, DC og medfødt lymfoid celle (ILC) potensial, og skiller seg fra LMPP ved ekspresjon av CD127 og fraværet av høye nivåer av Sca-1.
Selv om arten av de thymus-settling progenitorceller (TSP) har blitt grundig diskutert 8, ble det nylig klart at TSP forandring fenotype, differensiering potensial og funksjon, hele utviklingen 9. Vi har utført in vitro og in vivo, for å karakterisere TSP, isolert ved hjelp av FACS-cellesortering enten fra E13 (første bølge) eller E18 (andre bølge). Foster tymiske organkulturer (FTOC) med bestrålte tymiske lapper kolonisert av like mange E13 og E18 stamfedre, som bærer ulike allotypic markører, tillatt etter deres avkom i en lignende oppvekstmiljø og avslørt celle iboende egenskaper, ulike mellom begge typer stamfedre. Tymiske fliker kolonisert av enten E13 eller E18 TSP lov utvikling uten valg på grunn av konkurranse mellom begge stamfedre. In vivo transplantasjon av de koloniserte thymic fliker videre viste at også than moden avkom av E13 og E18 TSP har ulike biologiske egenskaper in vivo. TSP-ene fra den første bølgen raskt generere T-celler, men gir opphav til lavt antall αβ og γδ T-celler. Blant de sistnevnte vi har oppdaget Vγ5Vδ1 dendrittiske epitelceller T-celler (DETC), som har en invariant TcR, migrere til epidermis der de utøver en funksjon i sårheling og er kun produsert under embryonal utvikling 10. I kontrast, TSP fra den andre bølgen tar lengre tid for å generere et høyt antall TcR + T-celler og er ikke i stand til å generere DETC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk uttalelse: alle forsøkene ble utført i henhold til Pasteur Institute Ethic Charter, godkjent av det franske landbruksdepartementet, og til EUs retningslinjer. En manipulator med trening på liten gnager kirurgi, sertifisert av den franske Landbruksdepartementet, utfører alle kirurgiske inngrep.
MERK: Se vedlegg Tabell 1 viser 5-trinns plan prosedyre.
1. Valg av embryoene
- Bruk 36 C57BL / 6 CD45.2 kvinner, 12 hunner CD45.1, 12 C57BL / 6 CD45.1 hanner og 12 C57BL / 6 CD45.2 hanner. Krysset hunnene med enten mannlig genotype vil produsere embryoer CD45.1 / 2 og CD45.1 brukes som en kilde til TSP eller CD45.2 brukes som en kilde til mottaker thymic fliker. Huset alle menn individuelt.
- For å få embryoer for E18 TSP isolasjon, plassere to hunner i et bur med en mannlig CD45.1 på 18:00, 21 dager før pode forsøket. Sjekk at det finnes en vaginal plug neste dag, før middag. Separangere plugget kvinner.
- For å få E14 embryoer å bli kolonisert av TSP, gjenta prosedyren ovenfor (1.2), ved hjelp av hanner CD45.2, 17 dager før pode forsøket.
- For å få embryoer å isolere E13 TSP, gjenta prosedyren ovenfor (1.2), ved hjelp av hanner C57BL / 6 CD45.1, 16 dager før pode forsøket.
2. Disseksjon av embryoene Under en horisontal Laminar Flow Hood
MERK: To dager før pode eksperimentet.
- Ofre gravide kvinner ved halshugging eller progressive administrasjon av CO 2 gass i minst 5 min, i en mette lukket kammer. Sikre død ved definitive arrestasjonen av cardio-luftbevegelser. Fukt magen med 70% etanol.
- Lag en langsgående snitt i huden på midtlinjen magen og åpne den ved å dra huden fra hverandre. Åpne peritoneum med pinsett og saks uten å berøre fordøyelseskanalen. Trekk ut bifid Uteross og skille det fra skjeden med saksen.
- Plasser livmoren i en 90 x 15 mm petriskål som inneholder 40-50 ml DPBS og kuttet tvers mellom hver fosteret decidua.
- Med par fin spiss saks og en fin pinsett fjerne muskelmembranen i livmoren, ta ut embryoene ved å kutte mellom morkaken og plommesekken, og fjerne amnios, som er feste embryoene.
- Plasser embryoene i en petriskål 90 x 15 mm inneholdende HBSS + 1% føtalt kalveserum (FCS). For embryoer eldre enn E15, fjerne hodene med en saks før ytterligere disseksjon.
3. Isolering av Thymus
- Under kikkerten forstørrelsesglass, plasserer embryo, liggende i liggende stilling (ventral visning), på en våt gasbind sengetøy.
- Sett inn en pinsett langs brusken i brystbenet, klype og åpne thorax rutenettet. Med buede tang, trekke brystveggen til side for å visualisere thymic fliker på hver side av luftrøret.
- Hold nøye hver lapp ved å knipe under med en fin pinsett og legg dem i en petriskål inneholder 1 ml HBSS + 1% FCS. Isolere fliker og fjerne omkringliggende bindevev med to 1 ml sprøyter + 26 G ⅜ "nåler, uten å skade kapselen.
- Vask fliker i 3 ml HBSS + 1% FCS for å fjerne blodceller.
MERK: Før E15, er thymic fliker plassert på hver side av luftrøret og senere sikring i midten for å danne et bi-Lobar organ.
4. cellesuspensjoner
- Erte hverandre nesene under kikkerten forstørrelsesglass, med to 26 G kanyler montert på 1 ml sprøyter, i HBSS + 1% FCS. Filtrer cellesuspensjonen gjennom en nylonduk.
5. Farging med Fluorescent Antistoffer og Cell Sorting
MERK: Alle antistoffer tidligere titreres for å oppnå optimal definisjon av befolkningen (den titration kan variere med antistoffet batch).
- Inkuber thymocyttene (E13 eller E18) i 15-30 minutter ved 4 ° C med 100 ul av en cocktail av biotinylerte antistoffer til å flekke avstamning positive celler (anti-CD19, anti-GR1, anti-Ter119, anti-NK1.1 , anti- CD11c, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25).
- Å vaske bort overskytende av antistoffer spinne ned rør med 4 ml HBSS + 1% FCS ved 280 xg i 7 min, fjerne supernatanten og re-suspendering av pelleten i frisk HBSS + 1% FCS. Gjenta sentrifugering.
- Inkuber E18 biotin-merkede celler med streptavidin-mikroperler i 15 minutter ved 4 ° C, og vaske cellene to ganger i HBSS 1% FCS. Re-suspendere cellene i 2 ml HBSS + 1% FCS. De fleste E13 thymocyttene er avstamning negative og derfor ikke trenger MACS berikelse før cellesortering.
- Pass cellene på LS kolonnen, i henhold til produsentens instruksjoner. Når alle cellesuspensjonen angitt i kolonnen tilsett 2 ml HBSS + 1% FCS. Gjenopprette4 ml av kolonnen strømme gjennom og sentrifuger cellene i 7 minutter ved 280 x g.
- Re-suspendere pellet av enten utarmet E18 eller totalt E13 tymocytter i 50 mL av TSP antistoff mix (anti-CD117 APC, anti-CD135 PE, anti-CD127 PECy7, anti-CD24 FITC, anti-CD44 APCCy7 og streptavidin Pacific Blue ) og inkuberes i 20 min ved 4 ° C i mørket.
- Vask cellene med 4 ml HBSS + 1% FCS og re-suspendere cellene i 1 ml HBSS + 1% FCS med propidiumjodid.
- Sorter på TSP-ene Lin - CD44 + CD117 + CD24 lav CD127 + CD135 + celler i en FACS (med 4 lasere) på en 1,5 ml rør som inneholder 200 mL komplett medium + 20% FCS. Gate første cellene i henhold til deres størrelse og detaljnivå på FSC og SSC kanaler. Fjerne døde celler (farging med propidiumjodid), gate ut dubletter og scorer fluorescens i eksponensiell skalaer. Rundt 100 eller 600 TSP-ene kan fås fra en E13 eller en E18 thymus, respectivEly.
6. Kolonisering av E14 Thymus- Lobes med stamfedre: Hanging Drop Technique
- Strålebehandling (30 Grays = 30 Gy) E14 tymiske lapper fra CD45.2 embryoer, 3 timer før kultur.
MERK: E14 eller E15 tymiske lappene har blitt brukt som mottaker av T-celle stamfedre. Bruke mottaker tymiske fliker av senere svangerskaps dager resulterer i tidlig nekrose på grunn av større størrelse av orgelet mens tymiske lapper på tidligere svangerskaps dager utvikle dårlig, sannsynligvis på grunn av mangelfull utvikling av epitelceller. - Sentrifuger sortert TSP-ene og resuspendere cellene i dyrkningsmedium (OPTI-MEM komplett medium med 10% FCS, penicillin (50 enheter / ml), streptomycin (50 ug / ml) og 2β-merkaptoetanol (50 mM)), slik at 35 ul inneholde 500 TSP.
- Plasser en 35 pl dråpe av cellesuspensjonen alle andre brønn i en 60 godt Terasaki plate.
MERK: 35 pl dråper kan smelte hvis de er plassert i tilstøtende brønner. - Plasser en bestrålt lapp på overflaten av hver enkelt dråpe. Lukk Terasaki plate og snu platen opp ned for å la cellene når den apikale pol av fallet av tyngdekraften.
- Hit forsiktig oversiden av den inverterte plate for å tvinge flikene til å gli til den apikale kanten av dråpen. Inkuber inverterte Terasaki plate i en fuktet inkubator i 48 timer ved 37 ° C + 5% CO2. Etter kolonisering, enten kultur E14 thymus i FTOC 7, eller pode under nyrekapslen av en mottaker voksen mus åtte.
7. Fetal Thymus- Organ Culture
- Plassere 3 ml komplett medium på en 35 mm petriskål. Plasser en isopore membranfilter flytende på mediet. Plasser den utblandede lapper på kanten av membranen med en tang (ikke mer enn 8 lapper på en membran).
- Plasser petriskåler som inneholder thymic lapper inne i en 90 mm petriskål, sammen med en 35 mm fatet, uten deksel, som inneholder 2 ml water, for å sikre optimal fuktighet. Inkuber 12 dager ved 37 ° C + 5% CO2.
8. Grafts Under nyrekapslen under sterile forhold
MERK: nyre parenkymet er omgitt av bindevev som danner en kapsel. Under capsular region er særlig rikt på blod og lymfekar og gir dermed et egnet miljø for utvikling av transplantater (f.eks tymiske fliker, pankreatiske øyer eller nyfødte hjerter). Grafts er vanligvis utført på den venstre nyre, fordi det er lettere tilgjengelig enn den høyre nyre. CD3 - / - hannmus ble anvendt som mottakere og dermed unngår transplantat-mot-vert-reaksjon som følge av mindre histokompatibilitetsantigener knyttet til Y-kromosomet fordi kjønnsbestemmelse før E15 ikke er enkelt å utføre.
- Sterilisere instrumentene og slitasje sterile hansker langs kirurgi. Bedøve mus ved intraperitoneal injeksjon av en oppløsning av ketamin 10 mg / ml xylazin + 1 mg /ml fortynnet i PBS: (50 til 100 pl per 10 g kroppsvekt), anvendelse av en 1 ml sprøyte. Kontroller anestesi ved å sjekke mangel på inter reflekser. Plasser en dråpe hydro-Optimune gel på hvert øye for å hindre tørrhet under anestesi.
MERK: Oppløsningen skal være forberedt extemporaneously og varmet i romtemperatur før injeksjon. Den anestesi varer i minst 20 min. Graden av anestesi skal styres langs hele operasjonen. Den anestesi kan forlenges ved intraperitoneal injeksjon av en halv dose hver 20 min. - Plasser musen på sin høyre side, under en horisontal lamina flyt hette. Sterilisere kirurgiske felt med 70% etanol og 10% jodid-dermiske løsning. Med en tang del musen håret langs en 2 cm lengde like over skjøten på bakbenet. Barbere kirurgiske området.
- Med en skalpell, gjør et snitt 1,5 cm lengde først, kutan vev, deretter med saks klippe muskelvev. Påføre et lett trykk på begge sider av snittet, Som vil tvinge nyrene ut av bukhulen.
- Påfør saltvann med en bomullspinne for å holde nyrene fuktig. Hvis du har vanskeligheter med å utsette organ, bruk en flat tang til å trekke ut rundt adipocytt vev som nyrene er festet. Opprett nyrene ut av retroperitoneal hulrom av en bomullspinne plassert under organ.
- Med to fine tang, lage et 2-3 mm hull i kapselen (unngå å berøre parenkym å hindre blødning). Under hele kirurgiske prosedyren holde den eksponerte nyrekapselen kontinuerlig fuktet.
- Sett forsiktig fliker under nyrekapselen, ved å opprettholde veggen av kapselen åpnet og skyver transplantatet under kapselen mot kanten pol. Plassere opptil seks lapper pr nyre.
- Bytt nyrene i retro-bukhulen. Sutur muskel aponeuroses, deretter huden med enkelte kirurg knop. Fukt såret med 10% jodid povidonløsning. Plasser musen på en oppvarmet pad ved 37 ° C.
- Kartlegge transplantert musen inntil full utvinning fra anestesi ved kontroll av hjerte, luftveier og whisker bevegelser, slimhinne farger til total utvinning sett av selvbetjente bevegelser.
MERK: Vi anbefaler injeksjon av smertestillende løsning (Buprenorphin, 0,1 mg / kg) intra muskel rett etter operasjonen, og 2 dager etter operasjonen for å forhindre post-kirurgi smerte. - Hold opererte dyr isolert inntil fullt restituert. Inspisere annenhver dag masker av såret for å kontrollere og forebygge smitte. Aldri observert sårinfeksjon etter denne prosedyren.
MERK: Weekly analyse av perifere blodceller fra CD3 - / - podet mus tillate oss å oppdage thymic avledet populasjoner stammer fra enten E13 eller E18 stamfedre bruker CD45 allotypic markør og T-celle avstamning spesifikke antistoffer (figur 3).
9. Analyse av TSP avkommet ved flowcytometri
- Flekkecellesuspensjoner fra individuelle lapper med et antistoff blanding som inneholder antistoffer som gjenkjenner CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, Vδ1 PE og inkuberes som beskrevet i kapittel 5.
- Re-suspendere cellene i HBSS + 1% FCS + propidiumjodid og analysere i et strømningscytometer (se resultater i figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å velge en metode for å utarme tymiske fliker av endogene tymocytter slik at den beste utviklingen av koloniserende stamfedre, vi sammenlignet nivåene av T-celle tilberedning i thymic lapper koloniserte etter bestråling eller en 5-dagers deoksv-guanosin (d-Gua) behandling. Resultatene viser at mens det er ingen forskjell på dag 9 av kultur, bestrålt fliker inneholdt flere T-celler enn de som ble behandlet med d-Gua, på dag 12. Dermed er bestråling mer hensiktsmessig enn d-Gua behandling for å få T-celle utvikling etter thymic kolonisering (figur 1). For å studere utviklingspotensialet av E13 og E18 TSP, vi koloniserte E14 bestrålt tymiske lapper med en blanding av like mange de to typene av stamfedre. Resultatene viser at E13 TSP-ene gir opphav til mindre thymocytter og mindre enn DP E18 TSP, men i motsetning, E13 TSP generere DETC og høyere frekvenser av CD3 + modne celler (figur 2). Å analysere in vivo pottenential av E13 og E18 TSP, ble thymus fliker kolonisert med hver type av progenitorceller podet under nyrekapselen på CD3 - / - mottakere. Resultatene viser at, i samsvar med FTOC ga E13 TSP opphav til T-celler raskere enn E18 progenitorceller, men antallet av sirkulerende T-celler som var signifikant lavere (figur 3).
Figur 1: T-celle utvikling er mer effektiv enn i bestrålt i deoksyguanosin behandles, kolonis thymic fliker E14 tymiske fliker (CD45.2) enten ble bestrålt med 30 Gy eller behandlet i 5 dager med deoksy-guanosin (d-Gua).. Tymiske lapper ble deretter kolonisert med 1000 Lin - CD117 + Sca-1 + (LSK) E14 FL celler isolert fra CD45.1 / to embryoer, i hengende dråpe i 48 timer og dyrket på et filter. Ingen forskjeller ble observert i effektiviteten av enendogene thymocytt uttømming mellom de to gruppene av thymic fliker. Utvikling thymocyttene farget med antistoffer mot CD45.1, CD45.2, CD3, Vγ5, Vδ1 og CD4 ble analysert på dag 9 og 12 ved FACS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: I motsetning til E18, E13 TSP-ene generere Vγ5Vδ1 DETC CD45.2 tymiske lapper ble bestrålt og kolonisert i 48 timer med en blandet kohort av 500 E13 TSP fra CD45.1 / 2 embryoer og 500 E18 TSP fra CD45.1 embryoer. . Under disse eksperimentelle forhold, E13 og E18 TSP utvikle seg i samme miljø og forskjeller i graden av differensiering og modne T-celle undergrupper observert etter kultur kan bare reflektere forskjeller i celle iboende biologiskeegenskaper. Etter 12 dager i kultur tymocytter fra individuelle lapper ble analysert ved flowcytometri etter farging med antistoffer erkjenner CD45.1, CD45.2, CD4, CD8, CD3, Vγ5, Vδ1. (A) Paneler viser antall celler utvinnes i hver lapp. (B) Representant flowcytometri profiler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: E13 TSP-ene utvikle raskere enn E18 TSP-ene CD45.2 tymiske lapper ble bestrålt og kolonisert i 48 timer med 500 E13 TSP eller 500 E18 TSP fra CD45.1 embryoer.. CD3 - / - mus ble podet med 4 tymiske lapper kolonis med enten E13 eller E18 TSP-ene. Perifert blod ble samlet ukentlig og analysert av FACS for doheller (CD45.1) CD3 + T-celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| trinn 1 | Parring mus for å få E18 embryoer (dag -21); parring mus for å få E14 embryoer (dag -17); parring mus for å få E13 embryoer (dag -16) | ||
| trinn 2a | Disseksjon av embryoene, dag -2 | ||
| trinn 2b | Bestråling av E14 thymic lapper, dag -2 | ||
| trinn 2c | Forbereder, flekker, og sortering celler fra E13 og E18 tymiske lapper, dagen -2 | ||
| trinn 2d | Hengende dråpe kultur, dag -2 | ||
| trinn 3a | Fetal Thymus- Organ Culture, dag 0 | ||
| trinn 3b | Graft under nyrekapselen, dag 0 | trinn 4 | FTOC: flowcytometri analyse, dag 12 |
| trinn 5 | Graft: ukentlig flowcytometri analyse av sirkulerende T-celler, dagene 15, 22, 35 |
Tabell 1: 5-trinns prosedyre følges i forsøket tidstabellen av eksperimentet fra parring av de forskjellige musestammer opp til analysen av de podede musene.. Grafts er utført i 7 uker gamle mus. Tar tid for transplantasjon som dag 0 og dag -21 er paring av mus for å oppnå befruktede egg E18, dag -17 for å oppnå embryoer E14, dag -16 for å oppnå embryoer E13, og på dag -2 sortering av E13 og E18 TSP , bestråling thymisk lapp og henger slipp.
| Antistoff | Clone Antall | Antistoff | Clone Antall | |
| CD25 | 7D4 | CD19 | 6D5 | |
| CD44 | IM7 | Ter 119 | TER-119 | |
| CD24 | M1 / 69 | NK1.1 | PK 136 | |
| CD117 | 2B8 | CD11c | HL3 | |
| CD3 | 145-2C11 | Gr1 | RB6-8C5 | |
| CD4 | RM4-5 | GD | eBioGL3 | |
| CD8 | 53 til 6,7 | Sca-1 | D7 | |
| CD135 | A2F10 | CD45.2 | 104 | |
| CD127 | A7R34 | Ly5.1 | A20 |
Tabell 2: Antistoffer og klone tall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
To hoved analyser kan anvendes for å analysere T-celledifferensiering ex vivo. Den mest rapporterte nylig er co-kulturen i hematopoetiske stamceller med BM stromaceller, OP9, uttrykker ligander av Noth1, delta som en eller fire 12. Dette er 2-D-analysen enkel å utføre, svært effektiv og følsom, slik analyse på celle-nivå. Men støtter det verken T-celle utvikling utover scenen av DP eller generering av γδ DETC 13, som begge krever direkte samhandling med thymic epitel.
FTOCs har lenge vært brukt til å analysere T-celle utvikling tre. Den store styrke av denne analysen er å tillate generering av alle modne T-cellekamre, en egenskap gitt av de effektive 3-D-interaksjoner av tymocytter med tymiske epitel. Vi testet her to metodene som i dag brukes til å utarme endogene tymocytter dermed gir effektiv kolonisering av eksogene forfedre. Både ioniserende stråling og deoksyguanosin behandling effektivt tømt utvikle thymocyttene. Men bare bestrålte thymic fliker påført en robust T-celle utvikling for lengre perioder som tyder på at d-Gua behandling kan også påvirke komponenter av epitel rommet. Embryonale tymiske lapper ble kolonisert av eksogene stamfedre med "hengende drop" metoden. Kolonisering av bestrålte lapper med både populasjoner i konkurransen kan oppdage ulike cellestyrte biologiske egenskaper. Kolonisering med bare en av TSP undergrupper viser deres differensiering kapasitet i et ikke-konkurransedyktige.
Ulempen med denne metoden er en lavere effektivitet i frekvensen av TSP som utvikler seg til T-celler sammenlignet med OP9Dl ko-kulturer 14. Men vi har gjort enkelt DN1 eller DN2-celler til å kolonisere individuelle tymiske fliker med effektivitet nærmere til den som oppnås med de stromale celler. En ti-fold reduction i effektiviteten av T-celleproduksjon er funnet når FL eller BM hematopoetiske progenitorceller anvendes for FTOC som ikke er observert i OP9 delta lignende kulturer. Dette mindre effektiv utvikling tyder på at ikke alle BM eller FL celler med T-celle potensial kan kolonisere thymus.
Poding av koloniserte tymiske fliker gir en bedre nærings og oksygentilførselen til utvikling av thymus enn i FTOC, og muligheten for å følge skjebnen til avkommet av TSP, in vivo. Ved hjelp av disse to kombinerte strategier vi kunne beskrive trinnene differensiering og funksjonell potensialet i avkom av TSP-ene. Fordi CD3 - / - mus CD45.2 15, som ikke kan utvikle modne T-celler, ble brukt som verter, vi kunne sammen med CD45 allotypic forskjeller, entydig følge nylig generert T-celler i sine naturlige omgivelser
De nye aspektene ved den eksperimentelle fremgangsmåte som er beskrevet her er en kombinasjon av rekonstituert FTOCmed in vivo transplantasjon. Dette tillot å identifisere og spore avkom av definerte undergrupper av blodkreft stamceller. Vi fant at TSP fra de første og andre bølger generere forskjellige undergrupper av γδT celler, forskjellige antall αβT celler og har forskjellige kinetikken for differensiering.
Stadium av embryoene: dag 0 anses 18 timer etter parring til mus, i henhold til pluggen deteksjon. Disseksjoner av thymus krever en god kald lys 150 W, en kikkert disseksjon mikroskop og noen praksis for disseksjoner, anestesi og pode prosedyrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Støttet av Pasteur Institute, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant 'Lymphopoiesis'), REVIVE Future Investment Program og "La Ligue contre le Cancer".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture Petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26 G ⅜" 0.45 x 10 mm syringes with needles | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility actions |
| Ketamine 100 mg/ml (stock solution) | MERIAL | Anesthesic | |
| Xylazine 100 mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3 mg/ml stock solution | AXIENCE | Morphinic analgesic | |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | Eye protection | |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fetal calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2-Mercaptoethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine iris scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps: Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| 2 pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1x270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5 x 7.5 cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
- Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu Rev Immunol. 26, 355-388 (2008).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Douagi, I., Andre, I., Ferraz, J. C., Cumano, A. Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation. Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).
- Calderon, L., Boehm, T. Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments. Cell. 149, 159-172 (2012).
- Adolfsson, J., et al. Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment. Cell. 121, 295-306 (2005).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26, 678-689 (2007).
- Ramond, C., et al. Two waves of distinct hematopoietic progenitor cells colonize the fetal thymus. Nat Immunol. 15, 27-35 (2014).
- Allison, J. P., Havran, W. L. The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors. Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Barbee, S. D., et al. Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 3330-3335 (2011).
- Douagi, I., Colucci, F., Di Santo, J. P., Cumano, A. Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver. Blood. 99, 463-471 (2002).
- Malissen, M., et al. Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene. EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).
