Abstract
mRNA ofta lokaliserade till ryggradsdjur axoner och deras lokala översättning krävs för Axon pathfinding eller förgrening under utveckling och för underhåll, reparation eller neurodegeneration i postdevelopmental perioder. Hög genomströmning analyser har nyligen avslöjat att axoner har en mer dynamisk och komplex transkriptom än tidigare väntat. Dessa analyser, men har mestadels gjort i odlade nervceller där axoner kan isoleras från somato-dendritiska fack. Det är nästan omöjligt att uppnå en sådan isolering i hela vävnader in vivo. Således, för att kontrollera rekryteringen av mRNA och deras funktionella betydelse i ett helt djur, transkriptom analyser bör helst kombineras med tekniker som möjliggör visualisering av mRNA in situ. På senare tid har nya ISH teknik som upptäcker RNA på en enda molekyl nivå utvecklats. Detta är särskilt viktigt när man analyserar subcellulära lokalisering av mRNAEftersom lokaliserade RNA normalt återfinns på en låg nivå. Här beskriver vi två protokoll för detektion av axonally-lokaliserade mRNA användning av ett nytt ultrakänslig RNA ISH-teknik. Vi har kombinerat RNAscope ISH med axonal kontrast användning av fluorescens immunohistokemi eller histologiska färgämnen för att kontrollera rekryteringen av Atf4 mRNA till axoner in vivo i den mogna mus och mänskliga hjärnor.
Introduction
Axonal mRNA rekrytering och lokal översättning möjliggöra axoner att svara på extracellulära stimuli i en tidsmässigt och geografiskt akut sätt 1. Intra-axonal proteinsyntes förstås bäst i samband med nervsystemets utveckling där det spelar avgörande roller i tillväxten konen beteende 2-8, axon pathfinding 9-11 och bakåtsträvande signalering 12,13. Men mycket mindre är känt om den funktionella betydelsen av axonal proteinsyntes i post-utvecklings nervceller när axonal mRNA och ribosomen nivåer kraftigt reducerad 14,15. Mogna ryggradsdjur axoner har länge ansetts vara translationellt inaktiva 16. Men nya studier tyder på att lokal översättning återaktiveras i mogna axoner i patologiska tillstånd. Till exempel är en delmängd av mRNA rekryteras till regenererande axoner följande krävs nervskador och inom axonal proteinsyntes för korrekt regenerering av dessa axoner 17. Dessutom vår grupp haar visat att specifika mRNA rekryteras till axoner efter lokal exponering för Alzheimers sjukdom peptid Ap 1-42, och lokal översättning av transkriptionsfaktorn ATF4 krävs för att fortplanta de neurodegenerativa effekter av Ap 1-42 från axoner till den neuronala soma 18. Slutligen har hög genomströmning analyser visade att mogna axoner har en mer komplex och dynamisk transkriptom än väntat 18-21, speciellt under patologiska tillstånd. I ljuset av dessa studier, att en mycket känslig och specifik metod detektera axonally lokaliserade mRNA i den vuxna nervsystemet behövs.
En stor del av arbetet med mRNA rekrytering och lokal översättning i mogna axoner har utförts på odlade nervceller. Detta gäller särskilt för transkriptom analyser eftersom specialiserade odlingsmetoder finns som tillåter isolering av axoner från somato-dendritiska fack 18-20. Även om sådana studier har gett värdefulla insight in i rollen som lokal översättning i mogna axoner, frågan huruvida odlade nervceller troget representerar situationen in vivo eller om mRNA rekrytering är en adaptiv respons av axoner till odlingsbetingelser är fortfarande öppen. Få studier har gett bevis på mRNA rekrytering till mogna axoner in vivo. Till exempel har avskriften kodar för luktmarkörproteinet påvisats i axoner hos vuxna sensoriska neuroner 22. En transgen innehållande 3 'UTR av β-aktin mRNA transporteras till axoner i perifera och centrala nervsystemet nervceller hos möss och lokalt översatt efter utvecklingsperioder 23. Lamin b2 mRNA lokaliserad till retinala axoner i Xenopues laevis grodyngel och dess utarmning påverkar Axon underhåll efter axonal utveckling 21. Störningar med axonal transport av mRNA som kodar för cytokrom c oxidas IV förändrar mus beteende 24. Slutligen Atf4 mRNA hittas i vuxen enXons av möss och mänskliga hjärnor inom ramen för A-beta 1-42 inducerad neurodegeneration 18.
Hög genomströmning transkriptom analyser har visat sig vara användbara för att identifiera mRNA profiler i isolerade axoner in vitro men har begränsningar för in vivo-studier eftersom hela vävnader axoner är aldrig hittat isolerat utan blandas med neuronala cellkroppar, gliaceller och andra celltyper. Således sådana analyser måste kombineras med avbildningstekniker som bekräftar subcellulära lokalisering av mRNA. RNA in situ-hybridisering (RNA ISH) medger detektering och visualisering av specifika RNA-sekvenser i celler och vävnader. Men ursprungliga RNA ISH-analyser var lämplig endast för identifiering av mycket rikliga RNA 25, vilket sällan är fallet för axonally lokaliserade mRNA. Under de senaste årtiondena ökade ansträngningar har lagts på att utveckla ny teknik som möjliggör detektion av mRNA vid enda molekyl nivå
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök har godkänts av IACUC från Columbia University och gällande riktlinjer för vård och användning av försöksdjur följdes. Obs: Förbered alla buffertar som används för ISH förfaranden i RNas-fritt eller DEPC-behandlat vatten. Denna rekommendation är inte absolut nödvändigt efter ISH har slutförts, men det föreslås att buffertar fortfarande bereds i autoklaverat dubbel destillerat vatten och / eller steriliseras genom filtrering.
1. Detektion av Atf4 mRNA Lokaliserad till kolinerga Axoner i vuxen mus hjärnans med fluorescens in situ hybridisering (FISH) Följt av Immunohistokemi
- Provberedning för paraformaldehydfixerade frysta hjärnan skivor
- För följande exempel, förbereda skivor från fasta frysta mushjärnor.
- I korthet, offra 9 månader gamla möss genom anestesi med ketamin (100 mg kg -1 kroppsvikt) och xylazin (10 mg kg -1 kropp Weight) följt av transcardial infusion av 4% paraformaldehyd i PBS (pH 7,4).
- Ta hjärnor och efter korrigering i 4% paraformaldehyd under 24 timmar vid 4 ° C.
- Efter fixering, tvätta prover tre gånger i PBS och cryoprotect i 30% sackaros i PBS (pH 7,4) under 24 timmar vid 4 ° C
- Bädda hjärnor i oktober frysning förening, serie avsnitt på 20 pm på en kryostat och montera på poly-D-lysin behandlade objektglas. Håll hjärnan skivor vid -20 ° C fram till användning.
- Avlägsna paraformaldehyd-fixerade hjärnan skivor från frysen och lufttorka i 30 min vid RT.
- Tvätta tre gånger med 1 x PBS.
- I ett dragskåp, skär åter fix hjärnan 20 minuter med 4% paraformaldehyd vid RT.
OBS: VARNING: 4% paraformaldehyd är giftig och måste hanteras och kasseras på lämpligt sätt efter säkerhetsprotokoll. - Tvätta tre gånger med 1 x PBS.
- Torka hjärnan skivor.
- Förbered 50%, 75% och 100%etanollösningar.
- Doppa objektglasen i 50% etanol under 5 min vid RT.
- Doppa objektglasen i 75% etanol under 5 min vid RT.
- Doppa objektglasen i 100% etanol under 5 min vid RT.
- Doppa objektglasen i färska 100% etanol under 5 min vid RT. Obs: Alternativt kan diabilder förvaras i 100% etanol vid -20 ° C upp till 1 månad.
- För följande exempel, förbereda skivor från fasta frysta mushjärnor.
- FISH analys följt av immunhistokemi med användning av värme-inducerad antigen / RNA avslöjande
- Innan du börjar förbereda alla nödvändiga material:
- Värm hybridiseringsugn till 40 ° C och placera en kassett med destillerat vatten i ugnen för att skapa en fuktig miljö.
- Ta en bild låda och placera pappershanddukar indränkt i destillerat vatten inuti för att fukta glid rutan. Placera glid rutan i hybridiseringsugn.
- Avlägsna prober (både negativa och mål-sonder) från kylskåp och värma dem i hybridisering ugn under 10 minuter. Låt sonderna svalna down vid RT.
- Jämvikta amplifieringsreagens AMP 1-4 (ingår i Fluorescerande Multiplex reagenssatsen) vid RT.
- Bered antigenåtervinningslösning: 10 mM natriumcitrat (pH 6), 0,05% Tween 20. Notera: Lösning kan lagras vid rumstemperatur under obegränsad tid och att användas för framtida färgning.
- Bered 1x tvättbuffert späda 50x stamlösning (ingår i fluorescerande Multiplex Reagens Kit) i RNas-fritt eller DEPC-behandlat vatten.
OBS: 1x tvättbuffert kan förvaras vid rumstemperatur under en månad och att användas för framtida färgning. 50x tvättbuffert kan utfällas. Om så är fallet, värme 50x tvättbuffert vid 40 ° C under 10 min före framställning av 1x lösningen.
- Ta bort diabilder från 100% etanol och lufttorka under 5 minuter vid RT.
- Förbered en coplinkärlet innehållande 50 ml av antigenåtervinning lösning. Doppa objektglasen i antigenåtervinning lösning och koka dem i 10 minuter i en mikrovågsugn.
OBS: Alternativt plats glider horisontellt i en 100 mmdiameter rund glasskål innehållande 100 ml hämtning lösning.- Fyll en 1 L bägare med destillerat vatten och placera den i mikrovågsugnen.
OBS: Vattnet kommer att "buffert" värmen när du utför avslöjande. - Placera glasen i antigenåtervinning lösning inne i mikrovågsugn. Koka glider vid hög effekt under 5 minuter. Omedelbart efter prover har slutat kokning, värme glider igen på hög effekt för extra 5 min.
- Kyl ner diabilder vid RT.
OBS: kritiskt steg: kokande varaktighet och förfarande bör fastställas av användaren, beroende på mikrovågsugn egenskaper. Ju snabbare kokning börjar desto större är chanserna att lösning avdunstning. I detta fall rekommenderas att proverna kokas under kortare tidsperioder mer än två gånger för att slutföra en total avslöjande tid av 10 min. Tvärtom, om uppvärmningen sker vid medium eller låg effekt, kan utföras avslöjande en gång under 10 minuter. Men om proverna inte koka continuously under totalt cirka 10 minuter, kan detta resultera i partiell avslöjandet av både mål-RNA och protein som skall detekteras.
- Fyll en 1 L bägare med destillerat vatten och placera den i mikrovågsugnen.
- Tvätta objektglasen tre gånger med 1x PBS.
- Lägg 2-3 droppar (~ 100 | il) av dapB probuppsättning dessa hjärnan skivor som används för att bedöma bakgrundsfärgning. Obs! DapB sonduppsättningen riktar en bakteriell gen och bör inte erkänna någon däggdjurs RNA.
- Lägg 2-3 droppar av den målriktade probuppsättning till de hjärnan skivor används för att påvisa RNA: t av intresse. Obs: en sonduppsättningen targeting resterna 20 - 1381 av mus Atf4 mRNA användes i detta exempel.
- Täckskivor med parafilm för att undvika prob avdunstning, placera dem i fuktglid rutan inuti hybridiseringsugn och inkubera dem vid 40 ° C under 2 timmar.
OBS: EXTRA: ytterligare hjärnan skivor kan hybridiseras med en sond set inriktning mus Polr2A och används som positiva kontroller. - Tvätta slides två gånger med 1x tvättbuffert i 2 min vid RT.
- Lägg 2-3 droppar förstärkningsreagens AMP 1-FL till varje hjärna skiva, täckskivor med parafilm, placera dem i bild rutan och inkubera vid 40 ° C under 30 minuter i hybridiseringsugn.
- Tvätta glider två gånger med 1x tvättbuffert i 2 min vid RT.
- Lägg 2-3 droppar förstärkningsreagens AMP 2-FL till varje hjärna skiva, täckskivor med parafilm, placera dem i bild rutan och inkubera vid 40 ° C under 15 minuter i hybridiseringsugn.
- Tvätta glider två gånger med 1x tvättbuffert i 2 min vid RT.
- Lägg 2-3 droppar förstärkningsreagens AMP 3-FL till varje hjärna skiva, täckskivor med parafilm, placera dem i bild rutan och inkubera vid 40 ° C under 30 minuter i hybridiseringsugn.
- Tvätta glider två gånger med 1x tvättbuffert i 2 min vid RT.
- Lägg 2-3 droppar förstärkningsreagens AMP 4-FL till varje hjärna skiva, täckskivor med parafilm, placera dem iglidlåda och inkubera vid 40 ° C i 15 min i hybridiseringsugn.
- Tvätta objektglasen två gånger med 1 x tvättbuffert under 2 minuter vid RT och två gånger med 1 x PBS.
- Lägg 100-200 il (eller tillräcklig volym för att helt täcka skivor) av en blockeringslösning innehållande 3 mg / ml BSA, 100 mM glycin och 0,25% Triton X-100 i PBS (pH 7,4) till bilderna, täck dem med parafilm och inkubera i 30 min vid RT.
- Lägg 100-200 il anti-ChAT antikropp utspädd i blockeringslösning (1/100) till bilderna, täck dem med parafilm och inkubera i 2 dagar vid 4 ° C. Se till att hjärnsnitt inte torkar ut. Om det behövs, åter tillämpa anti-ChAT antikropp lösning på hjärnan skivor 24 timmar efter inkubation.
- Tvätta objektglasen tre gånger i 1 x PBS under 5 min vid RT.
- Lägg 100-200 pl av lämplig Alexa-konjugerad sekundär antikropp (. T.ex. Alexa-594 åsna anti-get för just detta exempel) till bilderna, täck med parafilm och incubåt under 1 h vid RT.
- Tvätta objektglasen tre gånger i 1 x PBS under 5 min vid RT.
- Tvätta glider en gång med destillerat vatten.
- Mount glider med DAPI-innehållande monteringsmedium.
- Visualisera hjärnan skivor under ett fluorescensmikroskop.
- Innan du börjar förbereda alla nödvändiga material:
2. Upptäckt av Atf4 mRNA lokaliserad till Axoner i mänskliga hjärnprover med hjälp av kromogen in situ hybridisering (CISH) Följt av Luxol Fast Blue och kresylviolett Motfärgning
- Provberedning för formalinfixerade paraffininbäddade humana hjärnprover
- Baka skivor i en torr ugn vid 60 ° C i 1 timme.
- Avparaffinera hjärnan skivor i ett dragskåp.
OBS: VARNING: reagenser är giftiga och måste hanteras och kasseras efter lämpliga riktlinjer säkerhets- Doppa objektglasen i xylen alternativ clearing agent två gånger under 10 minuter.
- Doppa objektglasen i 100% etanol två gånger under 1 minut.
- ENir-torra skivor 5 min vid rumstemperatur. Obs: Alternativt prover kan torkas vid RT O / N men måste användas inom 24 timmar.
- Diaminobensidin (DAB) -baserade kromogena ISH-analys följt av Luxol snabb blå och kresylviolett fläcken med hjälp av värme-inducerad och proteas-inducerad RNA avslöjande
- Innan du börjar förbereda nödvändiga material:
- Värm hybridiseringsugn till 40 ° C och placera en kassett med destillerat vatten för att skapa en fuktig miljö.
- Ta en bild låda och placera pappershanddukar indränkt i destillerat vatten inuti för att fukta glid rutan. Placera glid rutan i hybridiseringsugn.
- Bered 1x förbehandla 2 genom att späda 10x stamlösning (ingår i CISH reagenssatsen) i RNas-fri eller DEPC-behandlat vatten. Om förbehandling utförs på en värmeplatta, tillsätt 100 ml förbehandla lösning till en 100 mm glas diameter skålen att öka kontaktytan mellan skålen och värmeplattan (om förbehandlingutförs i en mikrovågsugn, kan en coplinkärlet användas i stället i enlighet med 1.2.3). Värm lösningen till 100 ° C och håll den kokande längre än 30 minuter innan kallsupar prover.
- Värme negativa och positiva sonder 10 min vid 40 ° C och svalna i rumstemperatur.
- Jämvikta amplifieringsreagens AMP 1-6 (ingår i CISH reagenskit) vid RT.
- Bered 1x tvättbuffert späda 50x stamlösning (ingår i CISH Reagens Kit) i destillerat vatten. Obs: 1x tvättbuffert kan förvaras vid rumstemperatur under en månad och att användas för framtida färgning.
- Lägg ~ 4 droppar (~ 120 | al) av förbehandla en till varje hjärna skiva, täck med parafilm och inkubera vid RT i 10 min.
- Tvätta 3 till 5 gånger med färskt destillerat vatten.
- Utför värmeinducerad avslöjande:
- Överför diabilder till varm förbehandla 2 (ingår i CISH reagenskit) lösning och koka i 15 minuter. Obs: Boiling kan utföras på en värmeplatta säkerställerkontinuerlig kokning eller i en mikrovågsugn efter kritiska steg som anges i 1.2.3).
- Omedelbart överföra bilderna till destillerat vatten och tvätta 3 till 5 gånger.
- Tvätta diabilder 3 till 5 gånger i färsk 100% etanol.
- Lufttorr skivor 5 min vid rumstemperatur. Obs: Alternativt skivor kan torkas O / N.
- Utför proteas-inducerad avslöjande:
- Tillsätt 4 droppar förbehandla 3 (ingår i CISH Reagens Kit), täck med parafilm och inkubera 30 minuter vid 40 ° C i hybridiseringsugn.
- Tvätta diabilder 3 till 5 gånger i färskt destillerat vatten.
- Lägg fyra droppar av dapB probuppsättning till de hjärnan skivor används för att bedöma bakgrundsfärgning.
- Lägg fyra droppar av den målsökande probuppsättning till de hjärnan skivor används för att detektera RNA av intresse.
OBS: Ett sonduppsättningen targeting resterna 15 - 1256 av den humana ATF4 mRNA användes i detta exempel. EXTRA: ytterligare hjärnan skivor kan vara hybridized med en sond set inriktning human PPIB och användes som positiva kontroller. - Placera objektglasen i glidlådan och inkubera i 2 h. vid 40 ° C i hybridiseringsugn.
- Tvätta glider två gånger med 1x tvättbuffert i 2 min vid RT.
- Tillsätt 4 droppar av AMP 1 reagens till varje hjärna skiva, täckskivor med parafilm, placera dem i bild rutan och inkubera vid 40 ° C under 30 minuter i hybridiseringsugn.
- Tvätta glider två gånger med 1x tvättbuffert i 2 min vid RT.
- Lägg fyra droppar av AMP två reagens i varje hjärna skiva, täckskivor med parafilm, placera dem i glidlådan och inkubera vid 40 ° C i 15 min i hybridiseringsugn.
- Tvätta glider två gånger med 1x tvättbuffert i 2 min vid RT.
- Tillsätt 4 droppar av AMP 3 reagens till varje hjärna skiva, täckskivor med parafilm, placera dem i bild rutan och inkubera vid 40 ° C under 30 minuter i hybridiseringsugn.
- Tvätta glider två gånger med 1x varh-buffert under 2 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt 4 droppar AMP 4 reagens till varje hjärna skiva, täckskivor med parafilm, placera dem i bild rutan och inkubera vid 40 ° C under 15 minuter i hybridiseringsugn.
- Tvätta glider två gånger med 1x tvättbuffert i 2 min vid RT.
- Tillsätt 4 droppar av AMP 5 reagens till varje hjärna skiva, täckskivor med parafilm och inkubera 30 minuter vid RT.
- Tvätta glider två gånger med 1x tvättbuffert i 2 min vid RT.
- Lägg fyra droppar av AMP 6 reagens i varje hjärna skiva, täckskivor med parafilm och inkubera 15 min vid RT.
- Tvätta glider två gånger med 1x tvättbuffert i 2 min vid RT.
- Blanda lika stor volym av BROWN-1 och BROWN-2 reagens (ingår i CISH Reagens Kit), tillsätt ~ 120 pl lösning till varje hjärna skiva, täck med parafilm och inkubera 10 minuter vid RT.
- Tvätta objektglasen två gånger med 1 x tvättbuffert under 2 minuter vid RT och skölj en gång i destillerat vatten.
OBS: Kritiska steg: Följande steg är avgörande förfå en optimal axonal kontrast utan maskering närvaro av RNA granulat. - Innan du utför motfärg kontrollera förekomsten av mRNA av intresse under en bright mikroskop. Definiera referensområden i hjärnan prover för att övervaka förekomsten av puncta hela motfärg förfarandet.
- Värm Luxol snabb blå lösning vid 60 ° C
- Placera objektglasen i Luxol snabb blå och inkubera 30 minuter vid 60 ° C.
- Skölj flera gånger i destillerat vatten.
- Dip glider flera gånger i 0,05% litiumkarbonatlösning för att starta differentiering.
- Doppa glider två gånger i färskt 75% etanol.
- Skölj i destillerat vatten.
- Kontrollera hjärnan skivor under ett bright mikroskop. Observera att grå och vit substans bör börja vara urskiljbara och RNA granulat fortfarande synliga som mörkblå / svart puncta. Kontrollera att axoner börjar visas som ljusblå fibrer.
- Upprepa steg 2.2.28 till 2.2.32. Utför litenm inkubationer med Luxol snabb blå lösning i 10 - 20 min steg, samt noga övervaka motfärg och närvaron av RNA-granulat. Obs: Normalt är optimal kontrast förvärvats i 60-90 minuter (total inkubationstid) men tiden kan förkortas om man misstänker att RNA granulat kan maskeras av Luxol snabbt blånad (se figur 2 för exempel).
- Inkubera objektglasen i kresylviolett lösning under 10 min vid RT.
- Skölj objektglasen i destillerat vatten.
- Dip glider 5 till 10 gånger i 70% etanol.
- Torka hjärnan skivor genom 3 snabba byten av 100% etanol.
- I ett dragskåp, tydliga hjärnan skivor genom inkubering två gånger i xylen alternativt renande ämne för 2 min och en tredje gång under 5 min vid RT.
- Mount hjärnan skivor i xylen baserade permanent monteringsmedium.
- Analysera prov under ett bright mikroskop.
- Innan du börjar förbereda nödvändiga material:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En kort sammanfattning av de förfaranden som beskrivs ovan visas i figur 1.
Optimal detektering av Atf4 mRNA granulat i kolinerga axoner använder värmeinducerad avslöjande
Vid bedömningen av axonal lokalisering av mRNA, är det viktigt att kunna identifiera de axoner och att kunna visualisera låga rikliga RNA. RNA ISH teknik som beskrivs här möjliggör detektion av RNA på en enda molekyl upplösning. Standardprotokoll med denna teknik föreslår kombinationen av två avslöjande förfaranden för att effektivt detektera mål-RNA: proteas-inducerad och värmeinducerad demaskering 28. Men när ISH kombineras med immunohistokemi att identifiera axoner, proteas-inducerad avslöjande kanske inte resulterar i optimal antigendetektering 29.
I det första protokollet som beskrivs här, proteasdigestion undvikas, eftersom den antikropp som används inte erkänna choline acetyltransferas (ChAT) normalt återfinns i axoner av gyrus gyrus härrör från septohippocampal vägen (Figur 2A och B), även om positiva mRNA granuler upptäcktes. Värmeinducerad hämtning med 10 mM citratbuffert (pH 6), å andra sidan, säker integritet epitop som känns igen av anti-ChAT antikropp och rikta mRNA effektivt detekteras i chatt färgade axoner (Figur 2C och D). De resultat som presenteras här (figur 2) visar närvaron av Atf4 i dentate gyrus hos vuxna möss där mRNA-rekrytering och lokal översättning inducerades genom infusion av Ap 1-42 oligomerer i hippocampus. Tidigare uppgifter tyder på att Atf4 mRNA inte upptäcks i axoner in vitro eller in vivo under basala förhållanden 18, och därmed en sådan experimentell paradigm inte visas.
Optimal detektering av ATF4mRNA granulat i axoner med både värme-inducerad och proteas-inducerad avslöjande
De resultat som beskrivs ovan visar att antikroppsbaserade proteindetektion är kompatibel med RNA ISH-teknik när de utför värmeinducerad avslöja det kanske inte vara bra om proteas förbehandling krävs. Avsnitt 2 beskriver påvisande av ATF4 mRNA inom axoner följande tidigare publicerade förfaranden 28,30 kombination med histologiska fläckar som vanligtvis används för hjärnprover 31,32.
Ett kritiskt steg i detta förfarande är den optimala kontrast av myeliniserade fibrer använder Luxol snabb blå (LFB) utan maskering närvaron av mRNA-granulat i axoner färgade av CISH. Reagens som används för detta ändamål låta optimalt motfärgning med LFB följande inkubationstider på 60 till 90 minuter. Motfärga kan misslyckas när både temperatur- och inkubationstider minskas (figur 3A och inlägg, och data ej visade) ennd även mRNA granulat kommer fortfarande att vara synlig, inte kan verifieras deras axonal lokalisering. Å andra sidan, inkubering hjärnprover för 60 min eller längre vid 60 ° C utan att övervaka närvaron av positiva granuler periodvis kan resultera i irreversibel maskering av mRNA av intresse genom färgämnet (figur 3B och infälld). Det rekommenderas därför att proven inkuberas i LFB under 30 min, och att ytterligare inkubation utförs stegvis kontroll av prover var 10 till 20 minuter för att erhålla en optimal infärgning av både de axoner och RNA-granulerna (figur 3D-F). Efter dessa riktlinjer Atf4 positiva granuler kan tydligt detekteras både kontroll (Figur 3D) och Alzheimers sjukdom (Figur 3F) hjärnprover.
Figur 1. Sammanfattad arbetsflödeRNA ISH följt av axonal kontrast. Stegen som visas i svart är gemensamma för de två förfaranden som exemplifieras. Steg markerade i blått är specifika för paraformaldehydfixerade prover färgade med fluorescerande ISH medan de markeras med rött är specifika för formalinfixerade paraffininbäddade prover som färgats av kromogen ISH. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. FISH för Atf4 mRNA lokaliserad till kolinerga axoner i dentate gyrus hos vuxna möss. FISH utfördes med användning av proteas-inducerad (l eft panel) eller värmeinducerad (högra panelen) avslöjande följt av antikropp upptäckt av kolinacetyltransferas (chatt) . Den AntibODY inte erkänna chatta när proteasbehandling utfördes. Exempel på resultat som erhållits med en icke-inriktning sond (dapB) och Atf4 -targeting sonden använder samma mikroskop inställningar och bildjusteringar visas. Atf4-positiva granuler med oklara axonal lokalisering indikeras med frågetecken medan lokala granulat är markerade som " OK ". Skala bar 20 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. CISH för ATF4 mRNA lokaliserad till myeliniserade axoner i människans hippocampus formation. Efter ISH har axoner motfärgades med Luxol snabb blå (LFB) och neuronala somata motfärgades med kresylviolett. Suboptimal LFB färgning kan uppstå om både temperatur (A och infälld representerar prover som färgats med LFB vid 40 ° C under 4 timmar.) Och inkubationstid (ej visad) minskas, eller när kontrast inte kontrolleras efter korta inkubationsperioder (B och infällda ). Exempel på optimala LFB färgning i kombination med ISH användning av en icke-målsökande sond (dapB) eller ATF4 -targeting proben visas (CF och infällningar). Bild Förvärvet justeras automatiskt för bästa signal-brusförhållande. ATF4 -positiva granuler med oklara axonal lokalisering indikeras med frågetecken medan lokala granulat är markerade som "ok". Skala bar 50 pm, inlägg 10 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna rapport beskriver vi användningen av en hög upplösning ISH teknik vid detektion av axonally lokaliserad Atf4 mRNA. Dessa och tidigare publicerade studier visar att denna teknik är kompatibel med antikroppsbaserad proteindetektion i vävnader eller till och med hela embryon 33. Viktigt Det har nyligen använts för detektion av Arc-mRNA i dendriter av hippocampusneuroner 34. Det kan också kombineras med histologiska färgämnen för vävnadsfärgning. Slutligen är det lämpligt för samtidig detektion av flera mål-RNA 28,30,33. Dessa upptäckter exemplifierar mångsidigheten högupplösta RNA ISH-teknik, och mindre ändringar till de ursprungliga protokollen inte minskar känsligheten för denna metod.
Original protokoll beskriver användningen av Z-struktur sönder för att detektera mRNA av intresse i vävnader vid en enda molekyl upplösning föreslår två steg för mRNA avslöja involverarproteasdigestion och prov kokande 30,35. Här visar vi hur proteas-inducerad avslöja negativt påverkar framgångsrik antikroppsbaserad detektering av ChAT i kolinerga axoner härrör från septo-hippocampus vägen (Figur 2A och B). Därför bestämde vi oss för att utesluta detta steg och endast utföra värmeinducerad avslöjande om axonal motfärgning involverade användningen av antikroppar. Som visas (Figur 2C och D), kan kolinerga axoner visualiseras med en anti-ChAT antikropp och Atf4 mRNA granulat var detekterbara undvika proteasspjälkning. Observera att positiv detektering av Atf4 mRNA baserad på bakgrundsfluorescens erhålles från negativa sonden. En extra kontroll kan inkluderas i detta skede genom att behandla hjärnprover med RNaser och sondera dem med musen Atf4 sonder för att testa deras specificitet. Detta steg är dock inte ingår i de förfaranden som diskuteras här sedantidigare åberopad bevisning visar, med samma teknik, ett komplett utarmning av Atf4 mRNA i axoner efter siRNA injektion i mus hippocampus 18. Sådana resultat visar specificiteten av ISH prober används här. Bör utvärderas Användning av kontroller, annat än de negativa prober baserade på specifika vetenskapliga frågor. Slutligen kan värmeinducerad hämtning vara substituerad med eller i kombination med proteas-inducerad avslöjande beroende på kraven för den antikropp som används för axonet motfärgning. Valet av användning av en eller annat förfarande eller kombinationen av båda bör bestämmas empiriskt av användaren.
När du utför proteas- och värmeinducerad avslöjande i mänskliga hjärnprover, kan histologiska färgämnen ersätta antikroppsbaserad axonal motfärgning. Även om den ursprungliga protokollet här följt föreslår användningen av hematoxylin för vävnads motfärgning 30, är sådant färgmedel inte lämplig för axonet färgning. Sålunda Luxol FASt blått användes för att färga myeliniserade axoner och kresylviolett användes för att visualisera neuronala cellkroppar. LFB, som utvecklats av Kluever och Barrera 31, valdes framför andra fläckar eftersom det kan genomföras på mindre än 2 timmar och om differentieringen optimeras (Figur 3C-F) den ljusblå fläcken inte störa mRNA granulat som visas som mörka brun-svarta prickar. Som visas (Figur 3), kan optimal LFB motfärgning åstadkommas när inkubation prover vid 60 ° C under 60-90 min. Det är dock rekommenderat att inkubation utförs stegvis så att differentieringen kan övervakas noggrant och mRNA granulat är alltid synliga. Andra histologiska tekniker såsom Bielchowsky s eller Bodian silverfärgning avkastning gråsvart axon färgning 36 som kanske inte är förenliga med DAB-baserade kromogen reaktion som valts i denna rapport. Troliga sådana färgningsteknik bör kombineras med RNA CISH analyseratt tillåta användning av alternativa färgämnen såsom snabb röd eller HRP grön 30. Välja lämplig kombination av RNA ISH analyser och axonal fläckar bör bestämmas empiriskt av användaren.
En begränsning av det första förfarande som beskrivs i denna rapport är den misslyckade proteindetektion genom immunhistokemi om proteasspjälkning utförs. Denna begränsning kan övervinnas genom att undvika proteas-inducerad avslöjande. I det speciella fallet med axonally-lokaliserad Atf4 utför värmeinducerad avslöjande var tillräckligt för att detektera mRNA-granuler över bakgrundsnivåerna i kolinerga axoner. Detta är dock kanske inte är fallet för andra mRNA av intresse och proteasspjälkning kan krävas. Om så är fallet bör axonal motfärgning utföras med andra än anti-ChAT antikropp här beskrivna antikroppar. Alternativt kan antikroppsbaserad motfärgning ersättas med histologiska färgämnen som beskrivs i avsnitt 2 i protokollet.
30.
Som framgår av protokollet avsnitt, en av de kritiska stegen i båda förfarandena är värmeinducerad avslöjande. Om kokning utförs i en mikrovågsugn, det finns chanser lösning avdunstning beroende på egenskaperna hos enheten. Följ stegen som anges i 1.2.3 och 2.2.4 för att undvika lösning avdunstning. För fast fryst vävnad 10 min avslöjande borde räcka, medan för paraffin inbäddadevävnader kokning under 15 minuter rekommenderas. Om proverna inte koka kontinuerligt under den rekommenderade tiden kan detta leda till partiell avslöjandet. Men ibland kan variera något om andra enheter såsom en riskokare eller en värmeplatta väljs i stället för en mikrovågsugn. Kokande varaktighet bör fastställas av användaren, beroende på vilken metod.
En annan avgörande steg är LFB motfärgning. Det är viktigt att intensiteten av det blåa färgämnet inte stör visualiseringen av mRNA granuler. Vissa ändringar i det ursprungliga protokollet 31 utfördes för att minska intensiteten av färgämnet, såsom minskning av temperaturen (Figur 3A) eller inkubationstiden (data visas inte), men vi misslyckades med att tydligt skilja myeliniserade axoner i mänskliga hjärnprover . Å andra sidan, inkubering av prover i LFB lösning vid den föreslagna temperaturen (60 ° C) resulterade i en optimal färgning av myeliniserade axoner. Denrekommenderas dock att motfärgning utförs stegvis noga övervaka förekomsten av RNA-granulat hela tiden för att säkerställa att LFB inte maskera mRNA av intresse som anges i steg 2.2.28-2.2.36.
Slutligen bör prover aldrig torka ut. De metoder som beskrivs i denna rapport omfattar flera inkubationssteg vid 40 ° C, vilket ökar chanserna för reagens avdunstning. Såsom anges i de protokoll bör proverna täckt med parafilm i alla steg för att undvika avdunstning.
Sammanfattningsvis är utvecklingen av högupplösta RNA ISH och andra ISH metoder som möjliggör visualisering av lågprisflyg riklig transkript, inklusive de lokaliserats till vuxna axoner in vivo. Detta är särskilt viktigt eftersom det för många år mRNA lokalisering till och översättning hos vuxna axoner var kraftigt förbises eftersom de ansågs translationellt inaktiva.
Sammanfattningsvis presenterar vi en ny och promising teknik för detektion av Atf4 och potentiellt många andra mRNA hos vuxna axoner av däggdjurshjärnan. RNAscope kommer att underlätta framtida studier på mRNA lokalisering och kommer att bidra till att riva upp den biologiska betydelsen av deras lokala översättning in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| custom probe targeting residues 20-1,381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) | Advanced Cell Diagnostics | - | probe |
| custom probe targeting residues 15-1,256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) | Advanced Cell Diagnostics | - | probe |
| negative control probe-DapB | Advanced Cell Diagnostics | 310043 | probe |
| positive control probe-mouse Polr2A (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 312471 | probe |
| positive control probe-human PPIB (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 313901 | probe |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | in situ hybridization kit |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection) | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | in situ hybridization kit |
| Goat polyclonal anti-ChAT antibody | Millipore | AB144P | |
| Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit | American MasterTech | KTLFB | |
| Clearify clearing agent (xylene substitute) | American MasterTech | CACLEGAL | |
| ProLong Gold mounting medium with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| DPX mounting medium | Sigma | 6522 |
References
- Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
- Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
- Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
- Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
- Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
- Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
- Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506 (2014).
- Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
- Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
- Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
- Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
- Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
- Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
- Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
- Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
- Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
- Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079 (2012).
- Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
- Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
- Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
- Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
- Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
- Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
- Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
- Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and Practice of Histotechnology. , 2nd edn, Battelle Press. (1987).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55 (2014).
- Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2d edn, Mosby. (1980).
