Abstract
ARNm sont souvent localisées aux axones vertébrés et leur traduction locale est nécessaire pour pathfinding axone ou de branchement pendant le développement et pour l'entretien, la réparation ou la neurodégénérescence dans les périodes postdevelopmental. Analyses à haut débit ont récemment révélé que les axones ont un transcriptome plus dynamique et plus complexe que prévu. Ces analyses, mais ont été principalement fait dans des neurones en culture, où les axones peuvent être isolées à partir des compartiments de somato-dendritique. Il est pratiquement impossible de réaliser une telle isolation dans les tissus entiers in vivo. Ainsi, afin de vérifier le recrutement d'ARNm et leur pertinence fonctionnelle dans un animal entier, les analyses de transcriptome devraient idéalement être combinées avec des techniques qui permettent la visualisation des ARNm in situ. Récemment, de nouvelles technologies de l'ISH qui détectent ARN au niveau d'une seule molécule ont été développés. Ceci est particulièrement important lors de l'analyse de la localisation subcellulaire de l'ARNm, ARN depuis localisées se trouvent généralement à des niveaux faibles. Nous décrivons ici deux protocoles pour la détection des ARNm axonaux-localisées en utilisant une technologie ultrasensible nouvel ARN ISH. Nous avons combiné RNAscope ISH avec de contraste axonale par immunohistochimie de fluorescence ou des colorants histologiques de vérifier le recrutement de ATF4 ARNm aux axones in vivo chez la souris adulte et les cerveaux humains.
Introduction
Le recrutement d'ARNm axonale et la traduction locale permettent axones à répondre à des stimuli extracellulaires d'une manière temporellement et spatialement aiguë 1. La synthèse des protéines intra-axonal est mieux compris dans le contexte de développement neurologique où elle joue un rôle crucial dans la croissance cône comportement 8.2, 11.9 et des axones signalisation rétrograde 12,13. Mais loin en sait moins sur la signification fonctionnelle de la synthèse des protéines axonale dans les neurones post-développement lorsque les niveaux d'ARNm et de ribosome axonales sont considérablement réduits 14,15. Axones vertébrés matures ont longtemps été pensé pour être inactive translation 16. Cependant, des études récentes indiquent que la traduction locale est réactivé dans les axones matures dans des conditions pathologiques. Par exemple, un sous-ensemble des ARNm est recruté pour axones après une lésion du nerf et de la synthèse des protéines intra-axonal est nécessaire pour la régénération correcte de ces axones 17. En outre, notre ha de groupes a montré que les ARNm spécifiques sont recrutés pour des axones après une exposition locale à la maladie d'Alzheimer peptide Aß 1-42, et de la traduction locale ATF4 facteur de transcription est nécessaire pour propager les effets neurodégénératifs de Aß 1-42 de axones au soma neuronal 18. Enfin, les analyses à haut débit ont révélé que les axones matures ont un transcriptome plus complexe et dynamique que prévu 18-21, en particulier dans des conditions pathologiques. À la lumière de ces études, une méthode hautement sensible et spécifique pour détecter les ARNm axonaux localisées dans le système nerveux adulte est nécessaire.
Une grande partie du travail sur le recrutement de l'ARNm et la traduction locale dans les axones matures a été effectuée sur des neurones en culture. Cela est particulièrement vrai pour les analyses de transcriptome car les méthodes de culture spécialisés existent qui permettent l'isolement des axones de la somato-dendritique compartiment 18-20. Bien que ces études ont donné ins précieusesight dans le rôle de la traduction locale dans les axones matures, la question de savoir si des neurones en culture représentent fidèlement la situation in vivo ou si le recrutement ARNm est une réponse adaptative des axones à conditions de culture est toujours ouverte. Peu d'études ont fourni des preuves de recrutement d'ARNm de mûrir axones in vivo. Par exemple, la transcription codant pour la protéine de marquage olfactif a été détectée dans les axones des neurones sensoriels adultes 22. Un transgène contenant l'extrémité 3 'UTR de l'ARNm de β-actine est transporté vers les axones des neurones du système nerveux central et périphérique chez des souris et se traduit localement après 23 périodes de développement. Lamin de l'ARNm est localisée aux axones de la rétine dans Xenopues laevis têtards et son épuisement affecte l'entretien de l'axone après le développement des axones 21. Interférence avec le transport axonal de l'ARNm codant pour la cytochrome C oxydase IV modifie le comportement de la souris 24. Enfin, ATF4 ARNm se trouve dans un adulteXons des souris et des cerveaux humains dans le contexte de Aß 1-42 induite par la neurodégénérescence 18.
Analyses du transcriptome à haut débit se sont avérées utiles pour identifier les profils d'ARNm dans les axones isolés in vitro, mais avoir des limites pour des études in vivo depuis dans les tissus entiers axones ne se trouvent jamais dans l'isolement, mais entremêlées avec les organes de cellules neuronales, cellules gliales et d'autres types de cellules. Ainsi, de telles analyses doivent être combinées avec des techniques d'imagerie qui confirment la localisation subcellulaire des ARNm. Hybridation in situ de l'ARN (ARN ISH) en permet la détection et la visualisation des séquences d'ARN spécifiques dans les cellules et les tissus. Cependant, les tests ARN ISH originaux étaient conviennent que pour l'identification des ARN très abondantes 25, ce qui est rarement le cas pour les ARNm axonaux localisées. Pour les dernières décennies des efforts accrus ont été mis en développant de nouvelles technologies qui permettent la détection des ARNm au niveau d'une seule molécule
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Protocol
Toutes les procédures d'animaux ont été approuvés par le IACUC de l'Université Columbia et de lignes directrices applicables pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire ont été suivies. Note: Préparer tous les tampons utilisés pour les procédures de ISH dans l'eau sans RNase ou traitée au DEPC. Cette recommandation est pas strictement nécessaire après ISH est achevée, mais il est suggéré que les tampons sont encore préparés dans de l'eau distillée deux autoclave et / ou stérilisés par filtration.
1. Détection de ATF4 ARNm localisée à cholinergique axones dans la fluorescence en utilisant la souris cerveau adulte hybridation in situ (FISH) Suivi par immunohistochimie
- La préparation des échantillons pour des tranches de cerveau congelés paraformaldehyde fixe
- Pour l'exemple suivant, préparer des tranches de cerveaux de souris congelées fixées.
- En bref, des souris sacrifier neuf mois âgé par l'anesthésie à la kétamine (100 mg kg -1 de poids corporel) et de xylazine (10 mg kg -1 weig du corpsht) suivie d'une perfusion transcardial de 4% de paraformaldehyde dans du PBS (pH 7,4).
- Retirer cerveaux et post-fix dans 4% de paraformaldehyde pendant 24 heures à 4 o C.
- Après fixation, les échantillons laver trois fois dans du PBS et cryoprotect à 30% de saccharose dans du PBS (pH 7,4) pendant 24 heures à 4 ° C
- Intégrer cerveaux en octobre gel composé, l'article en série à 20 um sur un cryostat et monter sur des lames de microscope traitées poly-D-lysine. Gardez des tranches de cerveau à -20 o C jusqu'à utilisation.
- Retirer les tranches de cerveau paraformaldehyde fixe du congélateur et sèche à l'air pendant 30 min à température ambiante.
- Laver trois fois avec PBS 1x.
- Dans une hotte, re-fix tranches de cerveau de 20 min avec du paraformaldéhyde 4% à la température ambiante.
NOTE: ATTENTION: 4% de paraformaldéhyde est toxique et doit être manipulée et éliminée de manière appropriée suivant les protocoles de sécurité. - Laver trois fois avec PBS 1x.
- Déshydrater des tranches de cerveau.
- Préparer 50%, 75% et 100%des solutions d'éthanol.
- Immerger les lames dans 50% d'éthanol pendant 5 min à température ambiante.
- Immerger les lames dans 75% d'éthanol pendant 5 min à température ambiante.
- Immerger les lames dans l'éthanol 100% pendant 5 min à température ambiante.
- Immerger les lames en frais 100% d'éthanol pendant 5 min à température ambiante. Remarque: En variante, les lames peuvent être stockées dans 100% d'éthanol à -20 ° C jusqu'à 1 mois.
- Pour l'exemple suivant, préparer des tranches de cerveaux de souris congelées fixées.
- test FISH suivie par immunohistochimie en utilisant l'antigène / ARN démasquage induite par la chaleur
- Avant de commencer de préparer tout le matériel requis:
- Chauffer le four d'hybridation à 40 ° C et placer un bac contenant de l'eau distillée dans le four pour créer un environnement humidifié.
- Prenez une boîte de diapositives et placer des serviettes en papier trempées dans de l'eau distillée pour humidifier l'intérieur de la boîte de diapositive. Placer le bloc coulissant dans le four à hybridation.
- Retirer sondes (les deux sondes négatives et cibles) du four et faites-les chauffer au four d'hybridation pendant 10 min. Laissez refroidir les sondes down à température ambiante.
- Stabiliser les réactifs d'amplification AMP 1-4 (inclus dans le Kit Fluorescent Multiplex réactif) à la température ambiante.
- Préparer la solution de récupération d'antigène: citrate de sodium 10 mM (pH 6), 0,05% de Tween 20. Remarque: Solution peut être conservé à température ambiante indéfiniment et être utilisé pour la coloration avenir.
- Préparer tampon de lavage 1x diluant la solution 50x stock (inclus dans le Kit Fluorescent Multiplex réactif) dans l'eau sans RNase ou traitée au DEPC.
NOTE: tampon de lavage 1x peut être conservé à température ambiante pendant 1 mois et être utilisé pour la coloration avenir. Tampon de lavage 50x pourrait précipiter. Si oui, la chaleur 50x tampon de lavage à 40 ° C pendant 10 min avant de préparer la solution 1x.
- Retirer les lames de 100% d'éthanol et sécher à l'air pendant 5 min à température ambiante.
- Préparer un bocal de Coplin contenant 50 ml de solution d'extraction d'antigène. Plonger les lames dans une solution de récupération d'antigène et les faire bouillir pendant 10 min dans un four à micro-ondes.
NOTE: Vous pouvez également lieu coulisse horizontalement dans un 100 mmplat rond en verre de diamètre contenant 100 ml de solution de récupération.- Remplir un bécher de 1 L avec de l'eau distillée et le placer dans le four micro-ondes.
REMARQUE: L'eau sera «tampon» lors de l'exécution de démasquer la chaleur. - Placer les lames dans une solution de récupération de l'antigène à l'intérieur du micro-ondes. Faire bouillir glisse à haute puissance pendant 5 min. Immédiatement après que les échantillons ont cessé de bouillir, la chaleur glisse à nouveau à haute puissance pour supplémentaire de 5 min.
- Refroidir diapositives à TA.
NOTE: ÉTAPE CRITIQUE: bouillante durée et de la procédure devraient être déterminés par l'utilisateur, en fonction des caractéristiques de micro-ondes. Le plus rapide de l'ébullition commence plus les chances d'une solution évaporation. Dans ce cas, il est recommandé que les échantillons sont portés à ebullition pendant des périodes de temps plus courts que deux fois plus de temps démasquage compléter un total de 10 min. Au contraire, si le chauffage est effectué à une puissance moyenne ou faible, démasquage peut être effectuée une fois pendant 10 min. Toutefois, si les échantillons ne se résument pas continuously pour un total d'environ 10 min, ce qui pourrait se traduire par démasquage partiel à la fois l'ARN cible et de la protéine à détecter.
- Remplir un bécher de 1 L avec de l'eau distillée et le placer dans le four micro-ondes.
- Laver les lames trois fois avec PBS 1x.
- Ajouter 2 - 3 gouttes (~ 100 pi) de la sonde dapB mis à ces tranches de cerveau utilisées pour évaluer la coloration de fond. Note: La sonde ensemble dapB cible un gène bactérien et ne devrait pas reconnaître tout ARN mammifère.
- Ajouter 2 - 3 gouttes de la sonde de ciblage mis à ces tranches de cerveau utilisées pour détecter l'ARN d'intérêt. Remarque: un ensemble de sondes ciblant les résidus 20 - 1381 de la souris ATF4 ARNm est utilisé dans cet exemple.
- Couvrir les lames avec du parafilm pour éviter l'évaporation sonde, placez-les dans la boîte de diapositives humidifié à l'intérieur du four d'hybridation et les incuber à 40 o C pendant 2 heures.
NOTE: OPTION: des tranches de cerveau supplémentaires peuvent être hybridés avec un ensemble de sondes ciblant souris Polr2A et utilisés comme témoins positifs. - Laver slides deux fois avec du tampon de lavage pour 1 x 2 min à température ambiante.
- Ajouter 2 - 3 gouttes de réactif d'amplification AMP 1-FL à chaque tranche de cerveau, couvrir avec du parafilm diapositives, placez-les dans la boîte de la lame et incuber à 40 o C pendant 30 min dans le four d'hybridation.
- Laver les lames deux fois avec le tampon de lavage 1x pour 2 min à température ambiante.
- Ajouter 2 - 3 gouttes de réactif d'amplification AMP 2-FL à chaque tranche de cerveau, couvrir avec du parafilm diapositives, placez-les dans la boîte de la lame et incuber à 40 o C pendant 15 min dans le four d'hybridation.
- Laver les lames deux fois avec le tampon de lavage 1x pour 2 min à température ambiante.
- Ajouter 2 - 3 gouttes de réactif d'amplification AMP 3-FL à chaque tranche de cerveau, couvrir avec du parafilm diapositives, placez-les dans la boîte de la lame et incuber à 40 o C pendant 30 min dans le four d'hybridation.
- Laver les lames deux fois avec le tampon de lavage 1x pour 2 min à température ambiante.
- Ajouter 2 - 3 gouttes de réactif d'amplification AMP 4-FL à chaque tranche de cerveau, couvrir diapositives avec parafilm, placez-les dans leBoîte à lames et incuber à 40 ° C pendant 15 min dans le four à hybridation.
- Laver les lames deux fois avec du tampon de lavage pour 1 x 2 min à température ambiante et deux fois avec PBS 1x.
- Ajouter 100 - 200 ul (ou un volume suffisant pour recouvrir complètement les tranches) d'une solution de blocage contenant 3 mg / ml de BSA, de la glycine 100 mM et 0,25% de Triton X-100 dans du PBS (pH 7,4) pour les lames, les recouvrir avec du parafilm et incuber pendant 30 min à température ambiante.
- Ajouter 100 - 200 pi d'anticorps anti-chat dilué dans une solution de blocage (1/100) pour les diapositives, les couvrir avec du parafilm et incuber pendant 2 jours à 4 o C. Assurez-vous que des tranches de cerveau ne se dessèchent pas. Si nécessaire, re-appliquer la solution d'anticorps anti-chat pour des tranches de cerveau de 24 heures après l'incubation.
- Laver les lames trois fois dans 1 x PBS pendant 5 min à température ambiante.
- Ajouter 100 - 200 pi de l'anticorps secondaire Alexa approprié conjugué (. Par exemple, Alexa-594 d'âne anti-chèvre pour cet exemple particulier) pour les diapositives, couvrir avec du parafilm et Incubmangé pendant 1 heure à température ambiante.
- Laver les lames trois fois dans 1 x PBS pendant 5 min à température ambiante.
- Laver les lames une fois avec de l'eau distillée.
- Mont glisse avec un milieu de montage contenant DAPI.
- Visualiser des tranches de cerveau sous un microscope à fluorescence.
- Avant de commencer de préparer tout le matériel requis:
2. Détection de ATF4 ARNm localisé aux axones dans les échantillons de cerveau humain en utilisant l'hybridation in situ chromogénique (CISH) Suivi par Luxol Fast Blue et le violet de crésyl contre-coloration
- La préparation des échantillons pour les échantillons de cerveau humain fixés au formol paraffine
- Tranches Cuire dans un four sec à 60 ° C pendant 1 h.
- Déparaffiner tranches de cerveau dans une hotte.
NOTE: ATTENTION: réactifs sont toxiques et doivent être manipulés et jetés en suivant les lignes directrices de sécurité appropriées- Immerger les lames dans le xylène agent de compensation alternatif à deux reprises pendant 10 min.
- Immerger les lames dans l'éthanol 100% à deux reprises pendant 1 min.
- UNEtranches de ir-sec 5 min à température ambiante. Remarque: vous pouvez échantillons peuvent être séchés à RT O / N, mais doivent être utilisés dans les 24 heures.
- Diaminobenzidine (DAB) à base de test de ISH chromogène suivie par luxol rapide bleu et le violet de crésyl tache en utilisant l'ARN démasquage induite protéase-induite par la chaleur et
- Avant de commencer préparer le matériel requis:
- Chauffer le four d'hybridation à 40 ° C et placer un bac contenant de l'eau distillée pour créer un environnement humidifié.
- Prenez une boîte de diapositives et placer des serviettes en papier trempées dans de l'eau distillée pour humidifier l'intérieur de la boîte de diapositive. Placer le bloc coulissant dans le four à hybridation.
- Préparer 1x Prétraiter 2 en diluant la solution 10x de stock (inclus dans le Kit CISH réactif) dans l'eau sans RNase ou traitée au DEPC. Si prétraitement est effectuée sur une plaque chaude, ajouter 100 ml de solution détachant dans un plat en verre de 100 mm de diamètre pour augmenter la surface de contact entre le plat et la plaque chaude (si prétraitementest réalisée dans un four micro-ondes, un bocal de Coplin peut être utilisé à la place comme spécifié au point 1.2.3). solution de la chaleur à 100 ° C et garder plus de 30 min bouillante avant de submerger échantillons.
- Sondes thermiques négatifs et positifs 10 min à 40 ° C et refroidir à température ambiante.
- Stabiliser les réactifs d'amplification AMP 1-6 (inclus dans le Kit CISH réactif) à la température ambiante.
- Préparer tampon de lavage 1x diluant la solution 50x de stock (inclus dans le kit de réactifs CISH) dans de l'eau distillée. Remarque: 1x tampon de lavage peut être conservé à température ambiante pendant 1 mois et être utilisé pour la coloration avenir.
- Ajouter ~ 4 gouttes (~ 120 pi) de Prétraiter 1 à chaque tranche de cerveau, couvrir avec du parafilm et incuber à température ambiante pendant 10 min.
- Laver 3 à 5 fois dans de l'eau distillée fraîche.
- Effectuer démasquage induite par la chaleur:
- diapositives de transfert à chaud Prétraiter 2 (inclus dans le kit de réactifs CISH) de solution et faire bouillir pendant 15 minutes. Remarque: ébullition peut être effectuée sur une plaque chauffante assurantébullition continue ou au micro-ondes en suivant les étapes critiques spécifiés dans 1.2.3).
- Transférer immédiatement les lames à l'eau distillée et laver 3 à 5 fois.
- Laver les lames 3 à 5 fois en frais 100% d'éthanol.
- tranches de sécher à l'air 5 min à température ambiante. Remarque: O Alternativement tranches peuvent être séchés / N.
- Effectuer démasquage induite protéase:
- Ajouter 4 gouttes de Prétraiter 3 (inclus dans le kit de réactifs CISH), couvrir avec du parafilm et incuber 30 min à 40 ° C dans le four d'hybridation.
- Laver les lames 3 à 5 fois dans de l'eau distillée fraîche.
- Ajouter 4 gouttes de la sonde de dapB mis à ces tranches de cerveau utilisées pour évaluer la coloration de fond.
- Ajouter 4 gouttes de la sonde ciblage mis à ces tranches de cerveau utilisées pour détecter l'ARN d'intérêt.
NOTE: Un ensemble de sondes ciblant les résidus 15 - 1256 de l'humain ATF4 ARNm est utilisé dans cet exemple. OPTION: des tranches de cerveau supplémentaires peuvent être hybridized avec un ensemble de sondes ciblant PPIB humaine et utilisés comme témoins positifs. - Placez les diapositives dans la zone de la lame et incuber pendant 2 heures. à 40 ° C dans le four à hybridation.
- Laver les lames deux fois avec le tampon de lavage 1x pour 2 min à température ambiante.
- Ajouter 4 gouttes de réactif 1 AMP à chaque tranche de cerveau, couvrir diapositives avec parafilm, placez-les dans la boîte de lame et incuber à 40 o C pendant 30 min dans le four d'hybridation.
- Laver les lames deux fois avec le tampon de lavage 1x pour 2 min à température ambiante.
- Ajouter 4 gouttes de réactif 2 AMP à chaque tranche de cerveau, couvrir diapositives avec parafilm, placez-les dans la boîte de lame et incuber à 40 o C pendant 15 min dans le four d'hybridation.
- Laver les lames deux fois avec le tampon de lavage 1x pour 2 min à température ambiante.
- Ajouter 4 gouttes de réactif 3 AMP à chaque tranche de cerveau, couvrir diapositives avec parafilm, placez-les dans la boîte de lame et incuber à 40 o C pendant 30 min dans le four d'hybridation.
- Laver les lames à deux reprises avec 1x étaith tampon pendant 2 min à température ambiante.
- Ajouter 4 gouttes de réactif 4 AMP à chaque tranche de cerveau, couvrir diapositives avec parafilm, placez-les dans la boîte de lame et incuber à 40 o C pendant 15 min dans le four d'hybridation.
- Laver les lames deux fois avec le tampon de lavage 1x pour 2 min à température ambiante.
- Ajouter 4 gouttes de réactif 5 AMP pour chaque tranche de cerveau, couvrir diapositives avec du parafilm et incuber 30 min à température ambiante.
- Laver les lames deux fois avec le tampon de lavage 1x pour 2 min à température ambiante.
- Ajouter 4 gouttes de réactif 6 AMP à chaque tranche de cerveau, couvrir diapositives avec du parafilm et incuber 15 min à température ambiante.
- Laver les lames deux fois avec le tampon de lavage 1x pour 2 min à température ambiante.
- Mélanger volume égal de BROWN-1 et 2 BROWN-réactifs (inclus dans le kit de réactifs CISH), ajouter ~ 120 pi de solution à chaque tranche de cerveau, couvrir avec du parafilm et incuber 10 min à température ambiante.
- Laver les lames deux fois avec le tampon de lavage 1x pour 2 min à température ambiante et rincer une fois dans l'eau distillée.
REMARQUE: Les étapes critiques: les étapes suivantes sont essentielles pourobtenir un contre-colorant axonale optimale sans masquer la présence de granules d'ARN. - Avant d'effectuer de contraste de vérifier la présence d'ARNm d'intérêt sous un microscope à fond clair. Définir les zones de référence dans les échantillons de cerveau dans lequel pour surveiller la présence de points lacrymaux pendant toute la procédure de contre-coloration.
- Solution de bleu rapide luxol Préchauffer à 60 o C.
- Placer les lames dans luxol bleu rapide et incuber 30 min à 60 o C.
- Rincez plusieurs fois à l'eau distillée.
- Dip glisse plusieurs fois dans une solution de carbonate de lithium de 0,05% à démarrer la différenciation.
- Tremper les lames à deux reprises en frais de 75% d'éthanol.
- Rincer à l'eau distillée.
- Vérifiez tranches de cerveau sous un microscope à fond clair. Notez que la matière grise et blanc devrait commencer à être granules distinctes et ARN encore visibles comme bleu foncé / noir lacrymaux. Vérifiez que les axones commencent à apparaître en tant que fibres bleu clair.
- Répétez les étapes 2.2.28 à 2.2.32. Perform incubations avec luxol solution de bleu rapide en 10 - 20 min étapes, surveillant attentivement la coloration de contraste et de la présence de granules d'ARN. Remarque: En règle générale, de contraste optimal est acquis en 60 à 90 minutes (temps total d'incubation) mais le temps peut être raccourcie si l'on soupçonne que les granules d'ARN peuvent être masqués par le bleuissement rapide luxol (voir Figure 2 pour des exemples).
- Incuber les lames dans une solution de violet de crésyl pendant 10 min à température ambiante.
- Rincer les lames dans de l'eau distillée.
- Tremper les lames 5 à 10 fois dans 70% d'éthanol.
- Déshydrater des tranches de cerveau à travers 3 changements rapides de 100% d'éthanol.
- Dans une hotte de laboratoire, des tranches de cerveau claires par incubation dans du xylene deux fois agent de compensation alternatif pendant 2 min et une troisième fois pendant 5 min à température ambiante.
- Mont tranches de cerveau dans un milieu de montage permanent basé xylène.
- Analyser des échantillons au microscope sur fond clair.
- Avant de commencer préparer le matériel requis:
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Representative Results
Un bref résumé des procédures décrites ci-dessus est représentée sur la figure 1.
Détection optimale des ATF4 ARNm granules dans les axones cholinergiques utilisant démasquage induite par la chaleur
Lors de l'évaluation localisation axonale des ARNm, il est essentiel de pouvoir identifier les axones et d'être en mesure de visualiser faibles ARN abondantes. La technologie de l'ARN ISH décrit ici permet la détection d'ARN à une résolution seule molécule. Des protocoles standard utilisant cette technologie suggèrent la combinaison de deux procédures de démasquage pour détecter efficacement ARN cibles, et la chaleur induite par le démasquage 28 induite protease. Toutefois, lorsque ISH est combiné avec l'immunohistochimie pour identifier les axones, démasquage induite protéase pourrait ne pas aboutir à la détection de l'antigène optimal 29.
Dans le premier protocole décrit ici, la protéase digestion a été évité, puisque l'anticorps utilisé omis de reconnaître choline acétyltransférase (ChAT) on trouve généralement dans les axones du gyrus denté provenant de la voie septohippocampique (figure 2A et B), bien que des granules d'ARNm positifs ont été détectés. Extraction avec 10 mM de tampon citrate (pH 6) induite par la chaleur, d'autre part, a assuré l'intégrité de l'épitope reconnu par l'anticorps anti-Chat et de cibler les ARNm a été efficacement détectée dans les axones de Chat-teinté (figure 2C et D). Les résultats présentés ici (figure 2) montrent la présence de ATF4 dans le gyrus denté de souris adultes où ARNm recrutement et la traduction locale ont été induites par perfusion de Aß 1-42 oligomères dans l'hippocampe. Les preuves antérieures suggère que ATF4 ARNm est pas détecté dans les axones in vitro ou in vivo dans des conditions basales 18, et donc un tel paradigme expérimental est pas représenté.
Détection optimale des ATF4granules d'ARNm en utilisant à la fois les axones démasquage induite par la chaleur et induits protéase-
Considérant que les résultats décrits ci-dessus montrent que la détection de protéines à base d'anticorps est compatible avec la technologie de l'ARN ISH lors de l'exécution de la chaleur induite démasquage il pourrait ne pas être utile si protéase pré-traitement est nécessaire. La section 2 décrit la détection de l'ARNm dans les axones ATF4 suivant les procédures publiées antérieurement 28,30 combinés avec des taches histologiques généralement utilisés pour des échantillons de cerveau 31,32.
Une étape cruciale dans cette procédure est la contre-coloration optimale des fibres myélinisées utilisant luxol bleu rapide (LFB) sans masquer la présence de granules d'ARNm dans les axones colorés par CISH. Les réactifs utilisés à cet effet permettent de contraste optimal avec LFB suite des temps d'incubation de 60 à 90 min. Counterstain peut échouer lorsque les deux fois de température et d'incubation sont diminués (figure 3A et encadré, et des données non représenté) unnd bien granules d'ARNm seront toujours visibles, leur localisation axonal peut pas être vérifiée. D'autre part, l'incubation des échantillons de cerveau pendant 60 minutes ou plus à 60 ° C sans contrôle de la présence de granules positifs périodiquement pourrait se traduire par masquage irréversible de l'ARNm d'intérêt par le colorant (figure 3B et encart). Il est donc recommandé que les échantillons sont incubés dans LFB pendant 30 min et que la poursuite de l'incubation est réalisée par étapes vérification des échantillons toutes les 10 à 20 min pour obtenir une coloration optimale à la fois des axones et les granules d'ARN (Figure 3D-F). Suite à ces directives granules positifs ATF4 peuvent être clairement détectées à la fois dans le contrôle (Figure 3D) et la maladie (figure 3F) les échantillons de cerveau de la maladie d'Alzheimer.
Figure 1. flux de travail succinctsde l'ARN ISH suivie de contraste axonale. étapes décrites en noir sont communes aux deux procédures illustrés. Étapes surlignées en bleu sont spécifiques à des échantillons de paraformaldehyde fixe colorées par ISH fluorescente tandis que ceux mis en évidence en rouge sont spécifiques à des échantillons inclus en paraffine fixés au formol colorées par ISH chromogène. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. FISH pour ATF4 ARNm localisé aux axones cholinergiques dans le gyrus denté de souris adultes. FISH a été effectuée à l'aide induite protéase (l du panneau de auche) ou induite par la chaleur (panneau de droite) démasquage suivie par la détection des anticorps de la choline acétyltransférase (ChAT) . Le antibOdy omis de reconnaître ChAT lorsque le traitement de la protéase a été effectuée. Des exemples de résultats obtenus avec une sonde non-ciblage (dapB) et la sonde du ATF4 utilisant le même réglages du microscope et des réglages d'image sont présentés. ATF4 granules -positifs avec localisation axonale clair sont indiqués par des points d'interrogation tout en granules localisées sont marqués comme " OK ". Barre d'échelle 20 pm. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. CISH pour ATF4 ARNm localisée à axones myélinisés dans la formation hippocampique humain. Après ISH, les axones ont été contre luxol bleu rapide (LFB) et soma neuronale ont été contre le violet de crésyl. Suboptimal coloration LFB pourrait résulter si les deux température (A et encadré représentent des échantillons colorés avec LFB à 40 o C pendant 4 h.) Et le temps d'incubation (non représenté) sont diminuées, ou lorsque de contraste est pas vérifié après des périodes d'incubation courtes (B et encadré ). Exemples de coloration optimale LFB combiné avec ISH utilisant une sonde non-ciblage (dapB) ou de la sonde de ATF4 ciblé vers sont présentés (CF et encarts). L'acquisition des images a été réglée automatiquement pour les meilleurs rapport signal sur bruit. ATF4 granules -positifs avec une localisation incertaine axonale sont indiqués par des points d'interrogation tout en granules localisées sont marqués comme "ok". Barre d'échelle 50 um, Enveloppes 10 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Dans ce rapport, nous décrivons l'utilisation d'une technologie de ISH haute résolution dans la détection de l'ARNm axonaux localisée ATF4. Ces précédentes et les études publiées montrent que cette technologie est compatible avec la détection de protéines à base d'anticorps dans les tissus ou même des embryons entiers 33. Surtout, il a été récemment utilisée pour la détection de l'ARNm de l'arc à l'intérieur de dendrites des neurones de l'hippocampe 34. Il peut également être combiné avec des colorants histologiques pour la coloration des tissus. Enfin, il est adapté pour la détection simultanée de multiples ARN cible 28,30,33. Ces résultats illustrent la polyvalence de haute résolution technologies ARN ISH, et des modifications mineures aux protocoles originaux ne diminuent pas la sensibilité de cette méthode.
Protocoles publiés qui décrivent l'utilisation de sondes Z-structure pour détecter des ARNm d'intérêt dans les tissus à une seule molécule résolution suggèrent deux étapes pour démasquer l'ARNm impliquantdigestion de protease et de l'échantillon d'ébullition 30,35. Ici, nous montrons comment démasquer négativement induite protéase affecte la détection à base d'anticorps réussie de ChAT dans les axones cholinergiques découlant de la voie septo-hippocampique (figure 2A et B). Ainsi, nous avons décidé d'exclure cette étape et effectuer uniquement démasquage induite par la chaleur si contre-coloration axonale impliqué l'utilisation d'anticorps. Comme le montre (figure 2C et D), les axones cholinergiques pourraient être visualisées avec un anticorps anti-Chat et de granules ATF4 ARNm étaient détectables évitant protéase digestion. A noter que la détection positive de l'ARNm ATF4 est basée sur la fluorescence de fond obtenu à partir de la sonde négative. Un contrôle supplémentaire peut être incluse à ce point en traitant des échantillons de cerveau avec RNases et de les sonder avec les sondes souris ATF4 afin de tester leur spécificité. Cette étape est cependant pas inclus dans les procédures décrites ici depuisprécédente émission de preuves, en utilisant cette même technologie, un épuisement complet des ATF4 ARNm dans les axones après injection siRNA dans l'hippocampe de souris 18. Ces résultats démontrent la spécificité des sondes ISH utilisées ici. L'utilisation de contrôles, autre que les sondes négatives doit être évaluée sur la base de questions scientifiques particulières. Enfin, l'extraction induite par la chaleur peut être substitué par ou combiné avec démasquage protease induite en fonction des exigences de l'anticorps utilisé pour la contre-coloration axone. Le choix d'utiliser une procédure ou d'un autre ou la combinaison des deux devrait être déterminée de manière empirique par l'utilisateur.
Lorsque vous effectuez la protéase et démasquage induite par la chaleur dans les échantillons de cerveau humain, colorants histologiques peuvent se substituer à base d'anticorps contre-coloration axonale. Bien que le protocole initial ici suivi suggère l'utilisation de contre-coloration à l'hématoxyline pour tissu 30, tel colorant ne convient pas pour la coloration axone. Ainsi, luxol fast bleu a été utilisé pour colorer axones myélinisés et violet de crésyl a été utilisé pour visualiser corps des cellules neuronales. LFB, développé par Kluever et Barrera 31, a été choisi parmi d'autres taches, car il peut être complété en moins de 2 heures et si la différenciation est optimisée (figure 3C-F) la tache bleu clair ne pas interférer avec les granules d'ARNm qui apparaissent aussi sombre points brun-noir. Comme le montre (Figure 3), optimale contre-coloration LFB peut être accompli lorsque l'incubation des échantillons à 60 ° C pendant 60 à 90 min. Il est toutefois recommandé que l'incubation est effectuée par étapes afin que la différenciation peut être soigneusement contrôlée et granules d'ARNm sont toujours visibles. Autres techniques histologiques tels que le rendement de coloration à l'argent axone gris-noir de ce Bielchowsky ou Bodian coloration 36 qui pourrait ne pas être compatible avec la réaction chromogène DAB base choisie dans le présent rapport. , Ces techniques de coloration probables devraient être combinées avec l'ARN CISH dosagesqui permettent l'utilisation de colorants alternatives telles que le rouge rapide ou HRP vert 30. Le choix de la combinaison appropriée de l'ARN ISH dosages et les taches axonales devrait être déterminée empiriquement par l'utilisateur.
Une limitation de la première procédure décrite dans ce rapport est la détection de la protéine échec par immunohistochimie si protéase digestion est effectuée. Cette limitation peut être surmontée en évitant démasquage induite par la protease. Dans le cas particulier de axonaux-localisée ATF4 effectuer démasquage induite par la chaleur était suffisante pour détecter des granules d'ARNm-dessus des niveaux de fond dans les axones cholinergiques. Cela pourrait toutefois ne pas être le cas pour d'autres ARNm d'intérêt et la protéase digestion pourrait être nécessaire. Si oui, contre-coloration axonale doit être effectuée en utilisant des anticorps autres que l'anticorps anti-chat décrit ici. Alternativement, contre-coloration à base d'anticorps peut être substitué par des colorants histologiques comme décrit dans l'article 2 du protocole.
30.
Comme indiqué dans la section de protocole, l'une des étapes critiques des deux procédures est le démasquage induite par la chaleur. Si l'ébullition est réalisée dans un four micro-ondes, il existe des risques d'évaporation solution en fonction des caractéristiques du dispositif. Suivez les étapes indiquées au point 1.2.3 et 2.2.4 pour éviter évaporation de la solution. Pour fixe tissu congelé 10 min de démasquage devrait suffire, alors que pour inclus en paraffinetissus bouillante pendant 15 min est recommandée. Si les échantillons ne se résument pas en permanence pendant la durée recommandée cela pourrait entraîner démasquage partielle. Cependant les temps peuvent varier légèrement si d'autres périphériques tels que un cuiseur à riz ou une plaque chauffante sont choisis à la place d'un micro-ondes. Durée d'ébullition doit être déterminée par l'utilisateur, en fonction de la méthode.
Une autre étape critique est la contre-coloration LFB. Il est important que l'intensité du colorant bleu ne pas interférer avec la visualisation des granules d'ARNm. Certaines modifications au protocole original 31 ont été effectuées dans le but de réduire l'intensité de la teinture, tels que la diminution de la température (figure 3A) ou le temps d'incubation (données non présentées), mais on n'a pas réussi à distinguer clairement les axones myélinisés dans des échantillons de cerveau humain . D'autre part, l'incubation des échantillons dans LFB solution à la température suggérée (60 ° C) a donné lieu à une coloration optimale des axones myélinisés. Ilest toutefois recommandé que les contre-coloration est réalisée par étapes surveillant attentivement la présence de granules d'ARN en tout temps pour assurer que LFB ne masque pas l'ARNm d'intérêt comme indiqué dans les étapes 2.2.28-2.2.36.
Enfin, les échantillons ne doivent jamais se dessécher. Les méthodes décrites dans le présent rapport comporte plusieurs étapes d'incubation à 40 ° C, ce qui augmente les chances de réactif évaporation. Comme indiqué dans les protocoles, les échantillons doivent être recouverts de parafilm dans toutes les étapes pour éviter l'évaporation.
En résumé, le développement de la haute résolution ARN ISH et d'autres méthodes de ISH activez la visualisation des transcriptions de faible abondance, y compris ceux localisés aux axones adultes in vivo. Ceci est particulièrement important depuis de nombreuses années à la localisation des ARNm et la traduction dans les axones adultes a été grandement négligés car ils étaient considérés translation inactive.
En conclusion, nous présentons un roman et promising technologie pour la détection de ATF4 et potentiellement de nombreux autres ARNm dans les axones adultes du cerveau des mammifères. RNAscope facilitera les futures études sur la localisation des ARNm et aidera à démêler la signification biologique de leur traduction locale in vivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| custom probe targeting residues 20-1,381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) | Advanced Cell Diagnostics | - | probe |
| custom probe targeting residues 15-1,256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) | Advanced Cell Diagnostics | - | probe |
| negative control probe-DapB | Advanced Cell Diagnostics | 310043 | probe |
| positive control probe-mouse Polr2A (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 312471 | probe |
| positive control probe-human PPIB (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 313901 | probe |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | in situ hybridization kit |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection) | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | in situ hybridization kit |
| Goat polyclonal anti-ChAT antibody | Millipore | AB144P | |
| Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit | American MasterTech | KTLFB | |
| Clearify clearing agent (xylene substitute) | American MasterTech | CACLEGAL | |
| ProLong Gold mounting medium with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| DPX mounting medium | Sigma | 6522 |
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