Summary
In diesem Video zeigen wir, wie man mononukleären Zellen aus dem zentralen Nervensystem von Ratten mit experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis isolieren.
Abstract
Ob das Studium eine Autoimmunerkrankung gerichtet an das zentrale Nervensystem (ZNS), wie experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE, 1), oder die Immunantwort auf eine Infektion des ZNS, wie Kinderlähmung, Lyme Neuroborreliose oder Neurosyphilis, ist es oft notwendig, um die ZNS-infiltrierenden Immunzellen zu isolieren.
In diesem Video-Protokoll zeigen wir, wie man mononukleären Zellen (MNC) aus dem ZNS der Ratte mit EAE zu isolieren. Der erste Schritt dieses Verfahrens erfordert eine kardiale Perfusion der Nager mit einer Kochsalzlösung, um sicherzustellen, dass kein Blut in den Blutgefäßen Bewässerung des ZNS bleibt. Jede Kontamination mit Blut wird künstlich erhöhen die Anzahl der scheinbaren ZNS-infiltrierenden multinationalen Unternehmen und kann die scheinbare Zusammensetzung des Immunsystems zu infiltrieren ändern. Wir haben dann zeigen, wie das Gehirn und das Rückenmark der Ratte für nachfolgende Kanalkrümmung entfernen, um ein Single-Cell-Suspension herzustellen. Diese Suspension wird auf einem Zwei-Schicht-Percoll-Gradienten getrennt, um die Multis zu isolieren. Nach dem Waschen werden diese Zellen dann bereit, alle erforderlichen Verfahren zu unterziehen.
Mononukleären Zellen isoliert mit diesem Verfahren sind lebensfähig und können für die Elektrophysiologie, Durchflusszytometrie (FACS), oder der Biochemie eingesetzt werden. Wenn die Technik unter sterilen Bedingungen durchgeführt wird (unter Verwendung von sterilen Instrumenten in einer Gewebekultur Haube) können die Zellen auch in Gewebekultur gezüchtet werden. Eine bestimmte Zellpopulation kann weiter gereinigt werden entweder mit magnetischen Trennverfahren oder eine FACS.
Protocol
- Tief betäuben Ratten. Spray mit 70% Ethanol und machen Sie einen kardialen Perfusion mit PBS für 10 min, um Zellen aus den Blutgefäßen (cut dem rechten Vorhof und perfuse durch den linken Ventrikel) zu entfernen.
- Entfernen Sie die Gehirn und Rückenmark und in ein 50 ml Röhrchen mit eiskaltem PBS. Schneiden Sie die Gehirn und Rückenmark in einem 70 mm Zellsieb in einer 10 cm Petrischale mit 10 ml eiskaltem PBS gelegt. Drücken Sie jedes Stück Orgel durch die Zelle Sieb mit der Rückseite einer sterilen 1 ml Spritzenkolben. Sammeln Sie die einzelnen Zellsuspension in ein 50 ml Röhrchen auf Eis. Waschen Sie die Zell-Sieb mit PBS und fügen Sie die Röhre, bis die Lösung klar ist.
- Zentrifuge für 8-10 min bei 390 g.
- Resuspendieren der Zellen in 20 ml PBS + 30% Percoll und Overlay auf 10 ml PBS + 70% Percoll.
- Zentrifugation bei 390 g für 20 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie das Fett am oberen Ende der Röhre. Sammeln Sie die Zellen aus der Schnittstelle und zwei Waschgänge mit PBS. Count.
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Discussion
Dieses Verfahren, da alle Verfahren mit lebenden Tieren, muss von Ihrer Institution Tier Nutzung und Pflege Ausschuss genehmigt werden. Wir empfehlen, einen Tierarzt oder eine tierärztliche Techniker anwesend sein bei der Durchführung der ersten Herz-Infusionen auf ein ausreichendes Niveau der Anästhesie zu gewährleisten ist, um das Tier vor und während des Verfahrens gegeben, und dass die Tiere nicht unterziehen unnötige Schmerzen oder Leiden.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS, 1x, sterile | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-250 | |
| Cell strainer, 70 um | Tool | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Percoll | Reagent | Sigma-Aldrich | P1644 |
References
- Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. 5, Forthcoming.
