Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

בידוד של תאים mononuclear ממערכת העצבים המרכזית של חולדות עם EAE

doi: 10.3791/527 Published: December 4, 2007

Summary

בסרטון הזה אנחנו מדגימים כיצד לבודד תאים mononuclear ממערכת העצבים המרכזית של חולדות עם Encephalomyelitis אוטואימונית ניסיונית.

Abstract

אם לומד מחלה אוטואימונית מכוונת למערכת העצבים המרכזית (CNS), כגון Encephalomyelitis אוטואימונית ניסויית (EAE, 1), או את התגובה החיסונית לזיהום של מערכת העצבים המרכזית, כגון שיתוק ילדים, ליים neuroborreliosis, או הנאורוסיפיליס, היא לעתים קרובות יש צורך לבודד את CNS-הסתננות תאים חיסוניים.

בפרוטוקול-video זה אנו מדגימים כיצד לבודד תאים mononuclear (MNCs) של מערכת העצבים המרכזית של עכבר עם EAE. השלב הראשון של הליך זה דורש זלוף הלב של מכרסם עם מלוחים פתרון על מנת להבטיח כי לא נשאר דם בכלי הדם להשקיית העצבים המרכזית. כל זיהום דם מלאכותי יהיה להגדיל את מספר ניכר CNS-הסתננות MNCs ועשויים לשנות את הרכב לכאורה של החיסון לחדור. לאחר מכן, אנו מדגימים כיצד להסיר את המוח ואת חוט השדרה של חולדה על dilaceration הבאים להכין ההשעיה תא בודד. השעיה זו מופרדים על שיפוע Percoll שתי שכבות על מנת לבודד את MNCs. לאחר כביסה, תאים אלה אז מוכן לעבור כל הליך הנדרש.

Mononuclear תאים מבודדים באמצעות הליך זה הם קיימא יכול לשמש electrophysiology, cytometry זרימה (FACS), או ביוכימיה. אם הטכניקה מבוצעת בתנאים סטריליים (בעזרת מכשירים סטריליים במנדף בתרבית רקמה) תאים יכול גם להיות מבוגר בינוני בתרבית רקמה. האוכלוסייה תא נתון יכול להיות מטוהרים נוסף או באמצעות הליכים הפרדה מגנטית או FACS.

Protocol

  1. עמוק להרדים חולדות. תרסיס עם אתנול 70% ולעשות זלוף לב עם PBS עבור 10 דקות להסיר תאים כלי הדם (לחתוך את הפרוזדורים perfuse ימין דרך החדר השמאלי).
  2. הסר את המוח ואת חוט השדרה מקום בתוך שפופרת המכילה 50 מ"ל קר כקרח PBS. חותכים את המוח ואת חוט השדרה במסננת תא 70 מ"מ להציב צלחת פטרי 10 ס"מ המכיל 10 מ"ל של קר כקרח PBS. לחץ על כל פיסת איבר דרך מסננת התא באמצעות האחורי של הבוכנה סטרילי 1 מ"ל במזרק. אסוף את ההשעיה תא בודד לתוך שפופרת 50 מ"ל על הקרח. לשטוף את התא מסננת עם PBS ולהוסיף הצינור עד הפתרון הוא ברור.
  3. צנטריפוגה 8-10 דקות ב 390 גרם
  4. Resuspend התאים Percoll PBS 20 מ"ל + 30% ו כיסוי על 10 מ"ל של Percoll PBS + 70%.
  5. צנטריפוגה ב 390 גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. הסר את השומן על גבי הצינור. איסוף התאים מממשק ולשטוף פעמיים עם PBS. הרוזן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הליך זה, כמו כל ההליכים הקשורים בבעלי חיים, חייב להיות מאושר על ידי שימוש בבעלי חיים המוסד שלך וועדת אכפת. אנו ממליצים כי וטרינר או טכנאי וטרינרי להיות נוכח בעת ביצוע perfusions הלב הראשון, כדי להבטיח רמה מספקת של ההרדמה ניתנת לבעל החיים לפני ובמהלך ההליך, וכי בעלי החיים אינם עוברים כאב מיותר או מצוקה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PBS, 1x, sterile Reagent GIBCO, by Life Technologies 14190-250
Cell strainer, 70 um Tool Fisher Scientific 08-771-2
Percoll Reagent Sigma-Aldrich P1644

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. 5, Forthcoming.
בידוד של תאים mononuclear ממערכת העצבים המרכזית של חולדות עם EAE
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Beeton, C., Chandy, K. G. Isolation of Mononuclear Cells from the Central Nervous System of Rats with EAE. J. Vis. Exp. (10), e527, doi:10.3791/527 (2007).More

Beeton, C., Chandy, K. G. Isolation of Mononuclear Cells from the Central Nervous System of Rats with EAE. J. Vis. Exp. (10), e527, doi:10.3791/527 (2007).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter