Aislamiento de células mononucleares de la del sistema nervioso central de ratas con EAE

Summary

En este video se demuestra la forma de aislar las células mononucleares del sistema nervioso central de ratones con encefalomielitis autoinmune experimental.

Abstract

Si el estudio de una enfermedad autoinmune dirigido al sistema nervioso central (SNC), tales como la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE, 1), o la respuesta inmunológica a una infección del sistema nervioso central, como la poliomielitis, neuroborreliosis de Lyme, neurosífilis o, a menudo es necesario aislar las células del SNC se infiltran inmunológico.

En este video se demuestra cómo el protocolo para aislar células mononucleares (MNC) del sistema nervioso central de ratas con EAE. El primer paso de este procedimiento requiere una perfusión cardiaca de los roedores con una solución salina para asegurarse de que no sangre, permanece en los vasos sanguíneos de irrigación del sistema nervioso central. Cualquier contaminación de la sangre artificial se incrementará el número de aparente infiltración de las corporaciones multinacionales sobre el SNC y puede alterar la composición de la aparente inmunidad se infiltran. A continuación se muestra cómo extraer el cerebro y la médula espinal de la rata para dislaceración posterior para preparar una suspensión de una sola célula. Esta suspensión se separa en un gradiente de dos capas de Percoll para aislar a las multinacionales. Después del lavado, estas células están listas para someterse a cualquier procedimiento requerido.

Las células mononucleares aisladas con este procedimiento son viables y pueden ser utilizados para la electrofisiología, la citometría de flujo (FACS), o la bioquímica. Si la técnica se realiza en condiciones estériles (con instrumentos estériles en una campana de cultivo de tejidos), las células también pueden ser cultivadas en un medio de cultivo de tejidos. Una población celular determinada puede ser purificado utilizando los procedimientos de separación magnética o un FACS.

Protocol

1. Profundamente anestesiar a las ratas. Rocíe con el 70% de etanol y hacer una perfusión cardiaca con PBS durante 10 minutos para eliminar las células de los vasos sanguíneos (corte de la aurícula derecha y la perfusión a través del ventrículo izquierdo).
2. Quitar el cerebro y la médula espinal y el lugar en un tubo de 50 ml que contiene helado de PBS. Cortar el cerebro y la médula espinal en un colador celular de 70 mm colocado en una placa de Petri de 10 cm con 10 ml de helado de PBS. Presione cada pieza de órgano a través del filtro de células usando la parte de atrás de un estéril de 1 ml émbolo de la jeringa. Recoger la única suspensión de células en un tubo de 50 ml en hielo. Lave el filtro de las células con PBS y añadir a la sonda hasta que la solución es clara.
3. Centrifugar durante 80-10 minutos a 390 g.
4. Resuspender las células en 20 ml de Percoll PBS + 30% y la superposición en 10 ml de Percoll PBS + 70%.
5. Centrifugar a 390 g durante 20 minutos a temperatura ambiente.
6. Quitar la grasa en la parte superior del tubo. Recoger las células de la interfaz y lavar dos veces con PBS. Contar.

Discussion

Este procedimiento, como todos los procedimientos con animales vivos, deben ser aprobados por el uso de animales de su institución y el comité de atención. Le recomendamos que un veterinario o un técnico veterinario estar presente cuando se realiza la perfusión cardiaca primero en asegurar un nivel suficiente de anestesia se administra a los animales antes y durante el procedimiento, y que los animales no sufren dolor innecesario o sufrimiento.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PBS, 1x, sterile	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14190-250
Cell strainer, 70 um	Tool	Fisher Scientific	08-771-2
Percoll	Reagent	Sigma-Aldrich	P1644