Introduction
Au cours des 30+ dernières années, les progrès dans les médicaments immunosuppresseurs ont diminué rejet de greffe en raison de rejet aigu, mais le rejet chronique reste un défi majeur. La principale manifestation de rejet de greffe cardiaque chronique est l'artériosclérose de transplantation (TA) 1,2. Cette condition est caractérisée par une hyperplasie de l'intima et la dysfonction vasomotrice des artères d'allogreffe et se développe en raison de ciblage immunologique des cellules musculaires lisses et endotheliales par le système immunitaire du receveur. Le ciblage spécifique de la vascularisation du greffon due à la reconnaissance du complexe d'histocompatibilité majeur de peptide étranger (MHC) est mise en évidence par le développement de l'AT dans les artères exclusivement greffés tout en épargnant les navires hôtes 3. En accord avec ceci est l'observation que TA ne se produit pas expérimentalement lorsque le destinataire est génétiquement identique au donneur ou lorsque le destinataire n'a pas les cellules B et T 4. Blessures et dysfunctio vasculaire à médiation immunitairen provoque le développement de l'épaississement de l'intima et la fibrose, ainsi que l'accumulation aberrante de lipides et de protéines de la MEC, en 5 TA. Épaississement de l'intima a tendance à être concentrique sur l'ensemble du 6/4 de l'arbre artériel. Une perte du greffon et la mort surviennent habituellement à la suite d'une ischémie progressive résultant d'une occlusion luminale des artères d'allogreffes 4.
En 1991, Mennander et al. 7 pionnier d'un modèle d'interposition aortique chez les rats pour modéliser TA. Plusieurs groupes ont ensuite adapté cette procédure pour une utilisation chez les souris. Dans ce modèle, les segments de l'aorte allogreffe développent des lésions qui ont des caractéristiques comparables à TA observés dans les greffes cliniques. Cela comprend l'épaississement de l'intima caractérisée par l'accumulation des cellules des muscles lisses, comme les leucocytes et les bénéficiaires 7. Au cours des deux dernières décennies, ce modèle a été utilisé pour générer des informations importantes sur les mécanismes de la lésion vasculaire, le rejet et la TA. Il peut nous êtreed pour examiner les questions relatives à des réponses immunitaires et vasculaires au cours pathologie artérielle. Le choix des impacts antigène de désadaptation la capacité de répondre de manière appropriée à ces questions.
Transplantation à travers les barrières complètes CMH permet une évaluation complète des réponses immunitaires qui sont connus pour être impliqués dans le rejet de greffe d'organe. Cela inclut la reconnaissance directe de cellules T CD4 et CD8 et le ciblage des étranger peptide-CMH présentés par des cellules greffés dérivés, CD4 indirect (et peut-CD8) la reconnaissance des cellules T et le ciblage des alloantigènes greffés dérivés présentés par antigène destinataire présentant des cellules, et anticorps reconnaissance médiée par des allo-antigènes sur la surface des cellules vasculaires 8. Cependant, la réponse vasculaire à des blessures dans des expériences complètes MHC-incompatibles peut être différente de celle observée cliniquement. Johnson et al. 9 a montré que, dans les greffes d'interposition aortiques transplantés à travers une barrière complète CMH de discordance, la plupart desles cellules néointimales sont d'origine bénéficiaire et non de l'origine des bailleurs de fonds. Ceci est différent de celui observé chez les humains, où la plupart des greffes de cellules musculaires lisses de l'intima sont d'origine donneur 9,10. Pour tenir compte de cette limitation, des modèles expérimentaux alternatifs qui impliquent greffage travers mineures inadéquation des antigènes d'histocompatibilité ont été développés qui déclenchent les réponses vasculaires qui ressemblent davantage à ceux observés dans la transplantation clinique 11. Bien que ces modèles alternatifs permettent de tirer des conclusions importantes à faire en ce qui concerne les réponses vasculaires qui poussent le développement de l'assistance technique, les processus immunologiques qui provoquent un rejet vasculaire en antigène mineur d'histocompatibilité greffes incompatibles ne capituler complètement re-pas celles qui se produisent dans le cadre clinique. Par exemple, les antigènes mineurs d'histocompatibilité sont reconnus mal par greffage des anticorps réagissant 12. Compte tenu des considérations qui précèdent, il est important de considérer la questi pathologiquesur cours d'examen au moment de choisir le type d'antigène décalage utilisé dans un modèle d'interposition aortique. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour murin aortique interposition greffage. Nous décrivons interposition greffage entre les souris MHC-incompatibles complets mais le même protocole est utilisé pour le greffage sur d'autres souches de souris ne correspondent pas à l'antigène.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tous les protocoles de cette étude ont été examinés et approuvés par le comité d'éthique de soins aux animaux de l'Université Simon Fraser. Utiliser Balb / CYJ (H2 d) Les souris donneuses et / 6 souris (H2 b) bénéficiaires C57Bl d'examiner les réactions allogéniques. Les souris sont utilisés pour des expériences entre les âges de 8 à 12 semaines. Utilisez la souris soit féminins ou masculins. Contrôles syngéniques sont constitués de segments aortiques de C57BL / 6 donateurs dans C57BL / 6 destinataires.
1. donneur et le receveur Préparation
Remarque: Tant le donneur et le receveur sont anesthésiés et préparés avant la chirurgie afin de minimiser l'ischémie du greffon. Anesthésiques injectables sont utilisés dans le protocole pour éviter l'obstruction de l'animal par l'équipement nécessaire pour la livraison des anesthésiques inhalés. Cependant, si on le souhaite, un anesthésique inhalé est une alternative appropriée. De l'injection initiale des anesthésiques, toute la procédure prend environ 90 minutes à compléter. Temps d'ischémie du greffon est moins than 30 min.
- Anesthésier les souris avec des injections intraperitoneales de kétamine (100 mg / kg; 10 mg / ml) et de xylazine (10 mg / kg; 1 mg / ml). La souris sera sous sédation dans les 10 à 15 min. Évaluer la profondeur de l'anesthésie en pinçant la partie grasse du coussinet plantaire de l'animal. Administrer 1/3 de la dose initiale du cocktail anesthésique, au besoin, jusqu'à ce que l'animal ne présente pas de réflexe de retrait. Surveiller la fréquence respiratoire de près après chaque cocktail est administré. Pendant la chirurgie, évaluer le niveau d'anesthésie toutes les 15 minutes en pinçant la paroi abdominale antérieure avec une paire de forceps. La souris doit rester profondément anesthésié pour 60 à 90 min.
- Lubrifier les yeux de la souris avec une pommade ophtalmique pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
- Raser les poils au plus près possible de la peau sur la région ventrale abdominale à partir de la mi-thorax au pubis. Soyez particulièrement attentif à ne pas entailler la peau tout. Ne pas utiliser de la crème dépilatoire, car il peut être absorbé iNto la peau et pourrait être inflammatoire.
- Placez l'animal en position couchée sur une serviette dessus de la table chauffante ou un coussin.
- Nettoyer le site chirurgical avec un gommage préliminaire avec 2% de chlorhexidine. Préparer une grande zone de travail afin de maximiser le champ opératoire. Lancer de lavage au centre du site chirurgical et se déplacer vers l'extérieur de manière linéaire ou circulaire. Disposer de la gaze. Répétez cette procédure au moins cinq fois plus. Appliquer un tampon à l'alcool à la même zone. Une fois que l'alcool est sec, préparer la zone propre avec une solution Betadine et drapé avec une gaze stérile.
2. End-to-end procédure anastomose
- Opération des donateurs
- Maintenir une technique aseptique pendant l'opération. Nettoyez toutes comptoir et de table chirurgicale surfaces avec une solution à 0,5% de peroxyde d'hydrogène accéléré avant de les utiliser. Envelopper et autoclave tous les instruments chirurgicaux, gazes, blouses et champs avant de les utiliser. Vérifiez la stérilité des instruments avec une vapeurbande d'indicateur de stérilisation placé dans chaque pack. Gants chirurgicaux stériles sont utilisés et éliminés entre chirurgies. Pour de multiples interventions chirurgicales, stériliser les instruments chirurgicaux entre les utilisations de la perle de verre chaud stérilisateur.
- Placez la souris donneuse dans une position couchée sur une surface propre, un mince panneau de plexiglas enveloppé avec drap stérile sous le microscope opératoire à 8-30X grossissement.
- Après avoir vérifié l'anesthésie chirurgicale adéquats comme indiqué à la section 1.1, procéder à une chirurgie.
- Avec des ciseaux stériles, faire une seule ligne médiane inférieure incision abdominale longitudinale, du pubis au processus xiphoïde.
- L'utilisation d'un petit écarteur, ouvrir la paroi abdominale pour exposer la cavité.
- Utilisation de coton stérile à pointe applicateurs, retirer délicatement les intestins supérieurement à l'animal de gauche et couvrir avec de la gaze humidifiée avec une solution saline. Déplacez les organes de reproduction bas et localiser l'aorte et la veine cave inférieure (VCI). Moisdix les tissus exposés périodiquement avec une solution saline.
- Utilisation des forceps No. 5 médical, séparer l'aorte à partir de la veine cave inférieure, par rapport au niveau de l'artère rénale gauche à la bifurcation. Utilisez 10-0 sutures monofilament polyamide pour ligaturer les petites branches près de la aorte.
- Une fois l'aorte du donneur a été séparé de la VCI, saturer la cuve avec une solution saline, couvrir la cavité exposée avec gaze humide et mettre de côté le donateur sur une zone stérile. Vérifiez l'état du donneur (fonction respiratoire et cardiovasculaire, et la profondeur de l'anesthésie) toutes les 15 min. Commencer à fonctionner sur le destinataire, l'isolement de l'aorte comme décrit ci-dessous (les étapes 2.2.1 à 2.2.7).
- Une fois l'aorte bénéficiaire a été séparé de la VCI et mettre de côté, retourner au donateur sous le microscope. Clampage (proximale et distale au segment d'intérêt) de l'aorte des donateurs, environ 5 mm, avec deux 4 mm de pinces microvasculaires.
- En utilisant les microciseaux Vannas-Tübingen,sectionner un petit segment de membrane (3 à 4 mm de longueur) de l'aorte abdominale.
- En utilisant une aiguille de 25 G 5/8 fixé à une seringue, rincer l'aorte excisée avec héparine (100 U / ml) de solution saline. Veiller à la pointe de l'aiguille ne vient pas en contact avec le navire.
- La place aorte en héparine (100 U / ml) de solution saline sur la glace et mis de côté. Alors qu'il était encore sous anesthésie profonde, libérer les pinces microvasculaires. Euthanasier le donateur par exsanguination.
- Implanter le navire donneur dans les 30 min de l'excision. Bien qu'il soit possible d'utiliser un navire donneur pour plusieurs destinataires par excision une longueur supérieure de l'aorte, garder le temps d'ischémie à moins de 30 min.
- Opération du bénéficiaire
- Maintenir une technique aseptique pendant l'opération, comme dans le fonctionnement des bailleurs de fonds.
- Placez la souris sur le destinataire dans une position couchée sur une mince planche de plexiglas enveloppé avec drap stérile sous le microscope opératoire à 8-30X grossissement.
- After assurer une anesthésie adéquate, procéder à une chirurgie lorsque l'animal ne présente pas de réflexe de retrait.
- Avec des ciseaux stériles, faire une seule ligne médiane inférieure incision abdominale longitudinale, du pubis au processus xiphoïde.
- L'utilisation d'un petit écarteur, ouvrir la paroi abdominale pour exposer la cavité.
- Utilisation de coton stérile à pointe applicateurs, retirer délicatement les intestins supérieurement à l'animal de gauche et couvrir avec de la gaze humidifiée avec une solution saline. Déplacez les organes de reproduction bas et localiser l'aorte et la veine cave inférieure. Humidifiez les tissus exposés périodiquement avec une solution saline.
- Séparer l'aorte à partir de la veine cave inférieure, par rapport au niveau de l'artère rénale gauche à la bifurcation. Si nécessaire, utilisez 10-0 sutures polyamide monofilament pour ligaturer les petites branches près de l'aorte.
- Clampage (proximale et distale au segment d'intérêt) de l'aorte, environ 5 mm, avec deux 4 mm de pinces microvasculaires.
- En utilisant les microciseaux Vannas-Tübingen, faire une seule aortotomie horizontale et réséquer un petit segment (pas plus de 0,5 mm) de l'aorte abdominale pour accueillir le greffon aortique de donneur.
- Rincer l'aorte excisée avec héparine (100 U / ml) de solution saline. La greffe aortique de donneur doit être d'une longueur appropriée pour relier les extrémités de l'aorte sectionnés du destinataire.
- Placez le donateur greffon aortique en position orthotopique et anastomoser la fin du greffon du donneur à la fin de la destinataire, correspondant à la greffe orientation anatomique respectifs avec celui du receveur.
- Saisir doucement la tunique externe du navire et Evert à l'aide de la pince légèrement No.5 médicaux. En utilisant les forceps, conduire l'aiguille fixée à l'10-0 polyamide monofilament suture à travers toute l'épaisseur de la paroi du vaisseau afin de garantir la greffe donneur d'aortique navire résection du destinataire. Prenez soin de veiller à ce que l'ouverture du vaisseau ne sont pas fermées en raison to piqûre accidentelle de la paroi arrière de la cuve.
- Pour les points continus, placer son séjour sutures à 09 heures dans les deux extrémités supérieure et inférieure de la greffe. À partir de l'extrémité supérieure de la greffe à partir de 03 heures, anastomoser les extrémités réséquées avec 2 sutures de fonctionnement et de fixer la suture au séjour suture.
- Retournez la greffe et poursuivre la suture de course à la partie dorsale du navire, rencontrer le séjour d'origine suture. Fixer sans appliquer beaucoup de pression sur le navire. Répéter la suture de l'anastomose inférieure.
Remarque: Les sutures interrompues commencent de la même façon que la suture continue à l'exception que le navire est anastomosée avec trois points de suture séparés entre les sutures séjour. temps d'anastomose est généralement 20 min.
- Retournez la greffe et poursuivre la suture de course à la partie dorsale du navire, rencontrer le séjour d'origine suture. Fixer sans appliquer beaucoup de pression sur le navire. Répéter la suture de l'anastomose inférieure.
- Une fois l'anastomose est terminée, relâchez le microvasculaire pince distale pour permettre au sang de circuler rétrograde et vérifier l'étanchéité des sites anastomosés. Si il existe une fuite, immediately placer un point de fermer le site défectueux. Si il n'y a pas de saignement au niveau des sites, puis relâchez la pince proximale.
- Examinez la greffe et vérifier qu'il n'y a pas d'obstruction de sang dans le greffon, et la partie proximale et la partie distale du vaisseau du destinataire. Motif d'impulsion vigoureuse dans le navire de fois le donneur et le receveur de l'indication principale est que le sang coule à flots. Utilisation de la paire de pinces, saisir délicatement une extrémité du séjour sutures et Evert légèrement le navire pour inspecter la paroi arrière du navire.
Remarque: Il ne faut pas plissement de la paroi de la cuve aux deux extrémités des sites anastomosés. Mauvaise circulation sanguine après le retrait des colliers est un signe de la thrombose. - En utilisant un coton-tige applicateurs, retourner les intestins dans la cavité abdominale.
- Avec le porte-aiguille Castroviejo et pince Graefe, fermer la paroi abdominale avec 5-0 sutures de polypropylène en utilisant couture continue. Fermez la couche de la peau avec le mêmesutures utilisant fermeture sous-cutanée.
- Administrer Torbugesic (1 mg / kg) im immédiatement après l'achèvement de la greffe.
- Donnez immédiatement, dans l'ordre, Atipamézole (1 mg / kg), le kétoprofène (5 mg / kg) et réchauffé la solution de Ringer lactate voie sous-cutanée.
- Immédiatement après la chirurgie, placer la souris dans une cage chauffé sous une couverture d'eau pendant une nuit (12 heures). Pendant la période d'anesthésie-récupération, placer les animaux seuls dans une zone dégagée propre et sec. Ligne de la cage (autoclave) avec des serviettes en papier propre et ajuster la température de la couverture de l'eau à environ 20 à 22 ° C. Fournir croquettes sèches et humides ad libitum sur le sol de la cage.
Remarque: Une composante importante des soins post-chirurgicale est l'observation de l'intervention de l'animal et appropriée, au besoin, lors de la récupération de l'anesthésie et de la chirurgie. L'intensité de la surveillance nécessaire varie avec l'animal et peut-être plus au cours de la période de récupération anesthésique immédiate en tant que compared plus tard dans la récupération post-opératoire. - Surveiller continuellement les animaux ayant subi une anesthésie surveillés jusqu'à ce qu'ils se rétablissent complètement. L'animal doit être en mesure de maintenir décubitus sternal sans aide et il doit apparaître calme et sans douleur avant qu'il ne puisse être laissé sans surveillance.
- Donnez buprénorphine (0,1 mg / kg BID) et le kétoprofène (5 mg / kg SID) pour une période de trois jours, à la fois sous-cutanée.
- Surveiller cardiovasculaire et la fonction respiratoire, la température corporelle, et la douleur post-opératoire ou d'inconfort lors de la récupération de l'anesthésie pendant au moins trois jours. Des précautions supplémentaires peuvent être nécessaires, telles que l'administration d'analgésiques et d'autres médicaments et liquides par voie parentérale pour minimiser la déshydratation et la perte d'électrolytes.
- Évaluer la réussite de la chirurgie de transplantation par l'observation de la fonction motrice des membres postérieurs. Réussite complète de la greffe implique non obstrué le flux sanguin vers la branche arrière et la queue, qui doit être immédiatement lors de la récupération de la animal, et une récupération complète sans paralysie des membres postérieurs, le deuxième jour
3. Collection de tissus
Remarque: Les points terminaux prédéterminés varient de 3 à 60 jours en fonction du type d'analyse désiré et de la nature de la non-concordance de l'antigène. Généralement, un épaississement intima est robuste au jour 30 après la transplantation dans des souches de souris complètes CMH dépareillés.
- Anesthésier les souris avec des injections intraperitoneales de kétamine (100 mg / kg; 10 mg / ml) et de xylazine (10 mg / kg; 1 mg / ml). Évaluer la profondeur de l'anesthésie en pinçant la partie grasse du coussinet plantaire de l'animal. Procéder à une chirurgie lorsque l'animal ne présente pas de réflexe de retrait.
- Nettoyer le site chirurgical avec de l'eau et se terminant avec 70% d'alcool.
- Placez l'animal en position couchée sur un plateau bordé de tampon absorbant.
- Ouvrez la cavité abdominale par une incision longitudinale à grande médiane. Placer un écarteur auto-retenue pour exposer la cavité, l'un IVCD l'aorte abdominale.
- Séparez délicatement le segment donneur d'aortique transplanté de la VCI voisin en utilisant une paire de n ° médicale 5 forceps. Soyez particulièrement prudent de ne pas dépouiller l'adventice du vaisseau greffé.
- Exposer la cavité thoracique en coupant à travers les nervures le long des deux côtés de la colonne vertébrale thoracique tout le chemin vers l'orifice supérieur du thorax. Refléter la paroi thoracique antérieure supérieurement pour exposer le péricarde et sécuriser la cage thoracique avec une paire de pinces hémostatiques.
- Une fois que le coeur est exposé, insérer une aiguille de 25 G 5/8 (fixé à une seringue) dans le ventricule gauche et rincer avec 0,1 ml d'héparine (100 U / ml) de la solution saline.
- En utilisant une paire de ciseaux, retirez l'oreillette droite pour permettre au sang, sérum physiologique hépariné, et fixateur de quitter le corps pendant la perfusion. Perfuser l'animal avec 5 ml de paraformaldéhyde 4% ou jusqu'à ce que les pistes liquide clair. Retirer le cœur d'assurer l'euthanasie.
- Accise transplanté segment de vaisseau et de plonger dans 4% parformaldéhyde pour pas plus d'une heure. Réglez le navire transplanté dans l'OCT (température de coupe optimale) et la matrice de gel flash. Section du navire en vertu d'un cryostat fixé à 8 um d'épaisseur. sections de tache avec hématoxyline & éosine et / ou Verhoeff-van Gieson (van Gieson) Teinture élastique.
4. Analyse morphologique des greffes
Note: TA se caractérise par un épaississement intima 13. Dans ce modèle, l'épaississement de l'intima et une réduction résultante de la taille de la lumière sont le reflet de la gravité de la lésion vasculaire à médiation immunitaire. Syngraft contrôles sont utilisés pour déterminer les caractéristiques de base des navires en l'absence de réponses immunitaires allogéniques. Ces contrôles permettent également l'évaluation des lésions artérielles qui se produit à la suite de l'intervention chirurgicale. Il devrait y avoir aucun épaississement de l'intima dans syngrafts.
- Pour examiner épaississement de l'intima et de l'occlusion luminale, mesurer la surface dans la cellule endothélialecouche, interne lamina élastique (IEL) et limitante élastique externe (EEL) sur élastiques van Gieson segments d'artère teinté avec un logiciel d'analyse d'image. Les paramètres ci-dessous peuvent être utilisés pour déterminer les changements artériels réfléchissantes de TA.
- Mesurer la surface de l'intima absolu: zone à l'intérieur de la limitante élastique interne - la zone à l'intérieur de la couche de cellules endotheliales. Cela fournit une mesure absolue de l'expansion de l'intima, qui est la marque de TA.
- Mesurer la surface absolue médiane: zone à l'intérieur de la lamina élastique externe - zone dans la limitante élastique interne. Ceci permet d'obtenir une mesure absolue de la dégradation de la médiane ou de la croissance, ce qui peut parfois se produire à la suite de changements à médiation immunitaire à cette région de la paroi du vaisseau.
- Mesurer l'aire totale de la cuve à l'intérieur de la région comme la lamina élastique externe. Ceci permet d'obtenir une mesure de récipient remodelage qui implique l'expansion ou la contraction de l'artère à la suite de dommages immunologique.
- Mesurel'intima / média: (zone à l'intérieur de la limitante élastique interne - zone à l'intérieur de la couche de cellules endotheliales) / (aire à l'intérieur de la lamina élastique externe - zone à l'intérieur de la limitante élastique interne). Ceci permet d'obtenir une mesure relative de l'expansion de l'intima et normalise les différences de taille de la cuve.
- Mesurer le rétrécissement luminal%: [(zone à l'intérieur de la limitante élastique interne - domaine dans la couche de cellules endotheliales) / zone de la lamina élastique interne)] * 100. Ceci permet d'obtenir une mesure du degré d'occlusion luminale, qui résulte d'une combinaison de dilatation et le remodelage de l'intima (vers l'intérieur ou vers l'extérieur) de la paroi du vaisseau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dans ce modèle, l'aorte abdominale d'une souris Balb / CYJ est interposé dans l'aorte sous-rénale d'une souris C57BL / 6 destinataire. Cela permet une évaluation complète des allo réponses qui ciblent les artères d'allogreffes. Une lésion vasculaire à médiation immunitaire dans ce modèle initie les réponses vasculaires réparatrices qui aboutissent à épaississement de l'intima, le rétrécissement luminal et le recrutement de cellules immunitaires (figures 1 et 2). Ces critères servent ensuite de lire-out de la gravité de allo-réponses, un rejet vasculaire, et TA. Succès de la procédure peut être évaluée par le développement de robustes épaississement de l'intima des allogreffes segments d'artère et l'absence d'épaississement de l'intima dans les contrôles de syngraft. Cliniquement pertinents immunosuppression peut être utilisé avec ce modèle à ressembler de plus près transplantation clinique. Ce modèle peut également être utilisé avec des animaux transgéniques pour étudier l'effet des protéines / voies spécifiques dans un allo-réponsess que nous avons fait 14.
Allogreffe segments aortiques développent épaississement de l'intima
Le montant de l'allogreffe dommages vasculaires à médiation immunitaire a été examiné par la quantification épaississement de l'intima et de rétrécissement de la lumière dans les segments de l'aorte greffés au jour 30 post-transplantation. Allogreffe segments d'artère importante développent un épaississement de l'intima et de l'occlusion luminale et aucun des changements observés dans syngraft segments de contrôle de l'artère (Figure 1).
Accumulation de leucocytes dans les segments de l'aorte allogreffe.
L'accumulation de leucocytes dans les artères d'allogreffes a été examinée par quantification du nombre de cellules T CD4, lymphocytes T CD8, et les macrophages (Mac-3) 15 par immunohistochimie. Mac-3 a été utilisé pour colorer de macrophages dans cette étude, bien que d'autres marqueurs, tels que F4 / 80, peuvent également être utilisés 16. Les cellules T CD4, les cellules T CD8 et les macrophages ont été détectés dans l'intima des artères d'allogreffe (Figure 2)
Figure 1: L'analyse histologique des artères greffées (A) de l'aorte abdominale segments de syngéniques et allogéniques souris ont été intercalés dans les aorte abdominale résection de souris C57Bl / 6.. Les artères greffées ont été récoltés à 30 jours post-transplantation. Photomicrographies représentatives de van Giesen artères élastiques colorés sont présentés. La barre d'échelle = 0,1 mm = 100 um (B) Schéma montrant comment les différentes couches de la cuve sont mesurés, L:. lumière, E: couche endothéliale, I: intima, M: médias, A:. adventice (C) Quantification des rapport intima / média et de rétrécissement de la lumière% de 30 jours syngénique (n = 3) et allogéniques (n = 6) greffes, * P <0,05.= "_ Blank"> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: accumulation de cellules immunitaires dans les artères d'allogreffes. Photomicrographies représentatives d'allogreffe aortique segments colorés pour l'immunohistochimie (A) CD4, (B) CD8, et (C) Mac-3 et contre-colorées avec de l'hématoxyline ont été représentés. Barre d'échelle = 0,1 mm = 100 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nous avons décrit un protocole de greffe aortique interposition chez les souris qui est utile pour étudier le rejet vasculaire à médiation immunitaire et TA. Ce modèle peut être utilisé pour enquêter sur les causes de la TA ainsi que le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Il a été utilisé dans le passé pour établir un rôle essentiel de l'immunité adaptative, les réponses des lymphocytes T cytotoxiques, les réponses effectrices CD4 des cellules T à médiation par des cytokines, et des lésions de la greffe médiée par les anticorps dans TA 14,17-21. Artère transplantation chez la souris est difficile en raison de la petite taille évident de l'animal; Cependant, avec la pratique et la diligence raisonnable, les chirurgies réussies peuvent être accomplies. Le succès dépend de la perméabilité du vaisseau. Cela implique en sorte que le greffon ne soit pas endommagé par la manipulation du récipient incorrectement avec une pince, une constriction de la lumière vasculaire, suture de la paroi arrière de la cuve, et la suture répétitive du même site. La fuite de la cuve est également problématique et nécessite des soins à eNsure que le nombre et la position des points de suture sont répartis uniformément autour de la paroi de la cuve. Il est également essentiel que la corruption ischémie est minimisée à moins de 30 minutes. Avec cela, une vitesse de plus de 95% de succès peut être atteint.
L'aorte est la plus grande artère de la souris si cette procédure est l'approche la plus simple de microchirurgie pour enquêter rejet vasculaire dans ce modèle animal. En outre, le segment aortique est greffé à un emplacement physiologiquement pertinent, éprouve le flux sanguin normal, épaississement de l'intima et se développe rapidement. L'autre modèle principal utilisé pour l'évaluation du rejet vasculaire et TA est la transplantation cardiaque hétérotopique, ce qui présente l'avantage d'examiner le développement de l'AT dans les artères coronaires et dans le contexte de la transplantation cardiaque qui est le scénario clinique le plus pertinent pour l'AT. Cependant, les transplantations cardiaques hétérotopiques sont placés dans un emplacement non physiologique à l'intérieur du corps (habituellement anastamosed de la veine cave etaorte dans l'abdomen) et le cœur ne pompe pas le sang dans les ventricules en raison de la nature rétrograde de l'approvisionnement en sang dans le cœur transplanté. En tant que tel, la nature de l'écoulement sanguin à travers l'arbre coronarien peut être différent de ce qui est normalement expérimenté par le système vasculaire coronaire 22,23. En outre, des stratégies pour surmonter le rejet aigu du cœur doit être incorporé afin d'évaluer les changements artériels. Dans les deux modèles, il est important de bien choisir le type d'antigène inadéquation utilisé afin d'être en mesure de traiter de manière appropriée les questions spécifiques liées à un rejet vasculaire et TA.
En résumé, l'aorte interposition greffage est une technique puissante pour étudier les lésions artérielles à médiation immunitaire et TA. Il peut être systématiquement maîtrisé avec la pratique et la diligence de la part du chercheur. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être modifiée pour le greffage d'interposition d'autres segments artériels, tels que l'artère carotide, epeut permettre à l'examen des questions scientifiques supplémentaires. En outre, l'utilisation de ce modèle peut être étendu au-delà de l'étude de la transplantation. Interposition greffe des artères peut être utilisé pour introduire des segments artériels de mise à jour (par exemple transgénique ou lipide-fed) chez la souris dans leurs homologues non modifiés, ou vice versa, afin d'isoler les effets biologiques des molécules aux cellules de la paroi de l'artère par rapport aux cellules de la paroi non-artérielles 24 , 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions des Instituts de recherche en santé et Heart and Stroke Foundation of BC & Yukon (JCC) canadiennes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories, Bar Harbour ME | Strain# 000664 | |
| Balb/cBYJ | Jackson Laboratories, Bar Harbour ME | Strain# 001026 | |
| Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ml | Ketalean | DIN 00612316 | |
| Xylazine Injection 20 mg/ml | Rompum | DIN 02169592 | |
| Ketoprofen Injection 100 mg/ml | Anafen | DIN 01938126 | |
| Butorphanol Tartrate injection 10 mg/ml | Torbugesic | DIN 008450000 | |
| Buprenorphine Injection 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser | B.N. 5241 | |
| Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution | Antisedan | DIN 02237744 | |
| Heparin Sodium Injection, USP, 1,000 units/ml | McKesson Distribution | DIN 02264315 | |
| Tears naturale ophthalmic ointment | Alcon | DIN 02082519 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| 0.9% Sodium Chloride, sterile | Baxter Corporation | ||
| Lactated Ringer’s solution, sterile | Baxter Corporation | ||
| 0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 ml | Baxter Corporation | ||
| Alcohol Prep Pads | Loris | ||
| Povidone Iodine | Betadine | ||
| Chlorohexidine Gluconate 4% w/v | Germi-Stat | ||
| Black Polyamide Monofilament | AROSurgical Instruments | T4A10Q07 | |
| Suture, 10-0 suture, 70 microns | Corporation | ||
| Blue monofilament suture 5-0, P3 needle | Ethicon | 8698G | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 1cc TB insulin syringe with 28 G 1/2 | BD | REF 309309 | |
| 25 G 7/8, hypodermic needle | BD | REF 305124 | |
| 27 G 1/2, hypodermic needle | BD | REF 305109 | |
| Colibri Retractor- 1.5 cm spread 4 cm | Fine Science Tools | 17000-04 | |
| S&T CAF-4 Clip applying forceps, without lock | Fine Science Tools | 00072-14 | |
| Supergrip forceps, S&T | Fine Science Tools | 00632-11 | |
| Medical No.5 forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Lexer Baby Scissors | Fine Science Tools | 14078-10 | |
| Micro Adson forceps serrated | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Vannas-Tubingen microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length | Fine Science Tools | 00396-01 | |
| Graefe-forceps, 10cm 1x2 teeth | Fine Science Tools | 11054-10 | |
| Castroviejo with lock and tungsten jaws | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Hot glass bead sterilizer | Inotech 250 | IS-250 - Steri-250 | |
| Non-woven gauzes | Progene | ||
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | ||
| Beard Trimmer | Wahl | ||
| Heating pad | Sunbeam |
References
- Billingham, M. E. Graft coronary disease: the lesions and the patients. Transplant Proc. 21, 3665-3666 (1989).
- Foegh, M. L. Chronic rejection--graft arteriosclerosis. Transplant Proc. 22, 119-122 (1990).
- Libby, P., Pober, J. S. Chronic rejection. Immunity. 14, 387-397 (2001).
- Tellides, G., Pober, J. S. Interferon-gamma axis in graft arteriosclerosis. Circulation research. 100, 622-632 (2007).
- Johnson, D. E., Gao, S. Z., Schroeder, J. S., DeCampli, W. M., Billingham, M. E. The spectrum of coronary artery pathologic findings in human cardiac allografts. The Journal of heart transplantation. 8, 349-359 (1989).
- Gao, S. Z., Alderman, E. L., Schroeder, J. S., Silverman, J. F., Hunt, S. A. Accelerated coronary vascular disease in the heart transplant patient: coronary arteriographic findings. Journal of the American College of Cardiology. 12, 334-340 (1988).
- Mennander, A., et al. Chronic rejection in rat aortic allografts. An experimental model for transplant arteriosclerosis. Arterioscler Thromb. 11, 671-680 (1991).
- Choy, J. C. Granzymes and perforin in solid organ transplant rejection. Cell Death Differ. 17, 567-576 (2010).
- Johnson, P., Carpenter, M., Hirsch, G., Lee, T. Recipient cells form the intimal proliferative lesion in the rat aortic model of allograft arteriosclerosis. Am J Transplant. 2, 207-214 (2002).
- Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
- Yu, L., et al. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting interferon-gamma-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Circ Res. 109, 418-427 (2011).
- Miller, C., DeWitt, C. W. Cellular and humoral responses to major and minor histocompatibility antigens. Transplant Proc. 5, 303-305 (1973).
- Tsutsui, H., et al. Lumen loss in transplant coronary artery disease is a biphasic process involving early intimal thickening and late constrictive remodeling: results from a 5-year serial intravascular ultrasound study. Circulation. 104, 653-657 (2001).
- Rossum, A., Enns, W., Shi, P., MacEwan, G. E., Choy, J. C. Bim regulates allogeneic immune responses and transplant arteriosclerosis through effects on T cell activation and death. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 1290-1297 (2014).
- Ho, M. K., Springer, T. A. Tissue distribution, structural characterization, and biosynthesis of Mac-3, a macrophage surface glycoprotein exhibiting molecular weight heterogeneity. J Biol Chem. 258, 636-642 (1983).
- Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney international. 67, 2488-2493 (2005).
- Shi, C., et al. Immunologic basis of transplant-associated arteriosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 4051-4056 (1996).
- Skaro, A. I., et al. CD8+ T cells mediate aortic allograft vasculopathy by direct killing and an interferon-gamma-dependent indirect pathway. Cardiovasc Res. 65, 283-291 (2005).
- Tellides, G., et al. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
- Wang, Y., et al. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ Res. 101, 560-569 (2007).
- Soulez, M., et al. The perlecan fragment LG3 is a novel regulator of obliterative remodeling associated with allograft vascular rejection. Circ Res. 110, 94-104 (2012).
- Choy, J. C., Kerjner, A., Wong, B. W., McManus, B. M., Granville, D. J. Perforin mediates endothelial cell death and resultant transplant vascular disease in cardiac allografts. Am J Pathol. 165, 127-133 (2004).
- Choy, J. C., et al. Granzyme B induces endothelial cell apoptosis and contributes to the development of transplant vascular disease. Am J Transplant. 5, 494-499 (2005).
- Reis, E. D., et al. Dramatic remodeling of advanced atherosclerotic plaques of the apolipoprotein E-deficient mouse in a novel transplantation model. Journal of vascular surgery. 34, 541-547 (2001).
- Potteaux, S., et al. Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe-/- mice during disease regression. J Clin Invest. 121, 2025-2036 (2011).
