Introduction
מעל 30 + השנים האחרונות, התקדמות בתרופות לדיכוי המערכת החיסונית הצטמצמה דחיית שתל בשל דחייה חריפה אבל דחייה כרונית עדיין מהווה אתגר עיקרי. הביטוי העיקרי של דחיית השתלת לב הכרונית הוא טרשת עורקים השתלה (ת"א) 1,2. מצב זה מאופיין על ידי היפרפלזיה intimal וחוסר תפקוד של עורקי vasomotor שתל ומתפתח כתוצאה של מיקוד חיסוני של תאי שריר אנדותל וחלק על ידי המערכת החיסונית הנמען. המיקוד הספציפי של כלי דם השתל בשל הכרה מורכבת הזר פפטיד-גדול histocompatibility (MHC) מודגש על ידי הפיתוח של ת"א באופן בלעדי בעורקי שתל תוך חוסך כלי מארח 3. בקנה אחד עם זה הוא התצפית שת"א אינה מתרחשת באופן ניסיוני כאשר הנמען הוא זהה מבחינה גנטית לתורם או כאשר הנמען חסר תאי T ו- B 4. פציעה של כלי דם בתיווך חיסוני וdysfunction גורם להתפתחות של עיבוי intimal וסיסטיק, כמו גם ההצטברות החריגה של שומנים וחלבוני ECM, בת"א 5. עיבוי intimal נוטה להיות קונצנטריים לאורך 4-6 עץ עורקים כולו. אובדן שתל ומוות מתרחשים בדרך כלל כתוצאה מאיסכמיה מתקדמת כתוצאה מחסימה של עורקי luminal שתל 4.
בשינה 1991, Mennander et al. 7 חלוצים מודל חציצת אב העורקים בחולדות מודל ת"א. מספר קבוצות שלאחר מכן מותאמות הליך זה לשימוש בעכברים. במודל זה, מגזרי אב העורקים שתל לפתח נגעים שיש להם תכונות דומות לת"א נצפו בהשתלות קליניות. זה כולל עיבוי intimal המאופיין בהצטברות של תאים כמו שריר חלק ולויקוציטים נמען 7. מעל 2 העשורים האחרונים מודל זה נעשה שימוש כדי ליצור תובנה חשובה למנגנונים של פגיעה בכלי הדם, דחייה ות"א. זה יכול להיות לנואד לבחון שאלות הקשורות למערכת חיסונית וכלי דם במהלך פתולוגיה עורקים. הבחירה של השפעות חוסר התאמת אנטיגן היכולת לטפל כראוי על שאלות אלה.
השתלה פני מחסומי MHC מלאים מאפשרת הערכה מקיפה של תגובות חיסוניות שידועים כי הם יהיו מעורבים בדחיית השתלות איברים. זה כולל הכרה ישירה CD4 ו CD8 T תא ומיקוד של פפטיד הזר-MHC שהוצג על ידי תאים שמקורם שתל, CD4 העקיף (ואולי CD8) הכרת T תא ומיקוד של alloantigens נגזר שתל שהוצג על ידי אנטיגן נמען מציג תאים, וantibody- הכרה בתיווך של alloantigens על משטחי תא כלי דם 8. עם זאת, התגובה של כלי הדם לפגיעה בניסויים הלא תואמים-MHC מלאים עשויה להיות שונה מזה שנצפה קליני. ג'ונסון et al. 9 הראה כי, בשתלי אב העורקים חציצה מושתלים על פני מחסום חוסר התאמת MHC מלא, רובתאי neointimal הם ממוצא נמען ולא ממוצא תורם. זה שונה מזה שנצפה בהשתלות אנושיות שבו רוב תאי שריר חלק intimal הם ממוצא תורם 9,10. כדי להסביר למגבלה זו, מודלים ניסיוניים חלופיים שכרוכים בהשתלה על פני חוסר ההתאמה אנטיגן histocompatibility קטין פותחו כי לעורר תגובות של כלי דם שדומים יותר לאלו שנצפו בהשתלת קלינית 11. בעוד מודלים החלופיים אלה מאפשרים למסקנות חשובים להתבצע לגבי התגובות של כלי דם המניע את ההתפתחות של ת"א, התהליכים החיסוניים הגורמים לדחייה של כלי דם בשתלים תואמים אנטיגן histocompatibility קטין לא לגמרי מחדש להיכנע אלה המתרחשים בסביבה הקלינית. לדוגמא, אנטיגנים histocompatibility קטין מוכרים היטב על ידי נוגדנים תגובתי שתל 12. בהתחשב בשיקולים שפורט לעיל, חשוב לשקול את Questi פתולוגיעל נבחן בעת בחירת הסוג של חוסר התאמת אנטיגן בשימוש במודל חציצת אב העורקים. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט להשתלת חציצת אב העורקים בעכברים. אנו מתארים השתלת חציצה בין עכברי MHC-תואמים מלאים אבל באותו הפרוטוקול משמש להשתלה על פני זני עכבר אחרים אנטיגן תואמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים במחקר זה נבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה טיפול בבעלי חיים באוניברסיטת סיימון פרייזר. השימוש BALB / cYJ (ד H2) עכברי תורם ו / 6 עכברי נמען (H2 ב) C57Bl לבחון תגובות אלוגנאית. עכברים המשמשים לניסויים בגילאי 8 עד 12 שבועות. השתמש עכברים או נקבה או זכר. בקרות syngeneic מורכבות ממגזרי אב העורקים מC57Bl / 6 תורמים לC57Bl / 6 נמענים.
1. תורם ומקבל הכנה
הערה: שני התורם והמקבל מורדמים ומוכן לפני הניתוח כדי למזער איסכמיה של השתל. הרדמה בזריקות המשמשות בפרוטוקול כדי למנוע חסימה של בעלי החיים על ידי ציוד הדרוש עבור המשלוח של חומרי הרדמה בשאיפה. עם זאת, אם תרצה בכך, הרדמה בשאיפה היא חלופה מתאימה. מההזרקה הראשונית של ההרדמה, ההליך כולו אורך כ 90 דקות כדי להשלים. זמן איסכמי של השתל הוא פחות than 30 דקות.
- להרדים את העכבר עם זריקות intraperitoneal של קטמין (100 מ"ג / קילוגרם; 10 מ"ג / מיליליטר) ו xylazine (10 מ"ג / קילוגרם; 1 מ"ג / מיליליטר). העכבר יהיה מסומם בתוך 10 עד 15 דקות. להעריך את עומק ההרדמה על ידי צובט את החלק השומני של כרית כף רגל בעלי החיים. לנהל 1/3 מהמינון המקורי של קוקטייל ההרדמה, לפי צורך, עד שהחיה אינה התערוכה רפלקס נסיגה. צג קצב הנשימה מקרוב אחרי כל קוקטייל מנוהל. במהלך ניתוח, להעריך את רמת ההרדמה כל 15 דקות על ידי צובט את דופן הבטן הקדמית עם זוג המלקחיים. העכברים צריכים להישאר מורדמים עמוק 60 עד 90 דקות.
- לשמן את עיניו של העכבר עם משחת עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
- לגלח את השיער קרוב לעור ככל האפשר על אזור בטן הגחון מאמצע בית החזה-לחיק. היזהר שלא במיוחד לניק כל עור. אין להשתמש בקרם מקריח כי זה יכול להיספג אניn כדי העור ויכול להיות דלקתי.
- מניחים את החיה במצב שכיבה במגבת מעל שולחן החימום או כרית.
- נקה את האתר כירורגית עם לשפשף ראשוני עם chlorohexidine 2%. הכן שטח עבודה גדול על מנת למקסם את שדה הניתוח. התחל קרצוף במרכז האתר כירורגית ולעבור למחוץ בצורה ליניארית או עגולה. השלך את הגזה. חזור על תהליך זה 5 יותר לפחות פעמים. החל משטח הכנת אלכוהול לאותו האזור. ברגע שהאלכוהול הוא יבש, להכין את השטח הנקי עם תמיסת פולידין ווילון עם גזה סטרילית.
2. מקצה לקצה השקה נוהל
- מבצע תורם
- לשמור על טכניקת aseptic בכל הפעולה. לנקות את כל משטחי השיש ושולחן כירורגית עם 0.5% פתרון מי חמצן מואץ לפני השימוש. לעטוף וחיטוי כל מכשירים, מלמלה, וילונות כירורגית ושמלות לפני השימוש. ודא סטריליות של המכשירים עם קיטוררצועת מחוון מעקר להציב בכל חבילה. כפפות מנתחים סטרילית משמשות ומסולקות בין ניתוחים. לניתוחים מרובים, לעקר את מכשירי הניתוח בין שימושים עם מעקר חרוז זכוכית החם.
- מניחים את עכבר התורם במצב שכיבה על לוח נקי, דק פרספקס עטוף בוילון סטרילי תחת מיקרוסקופ בהגדלה ההפעלה 8-30X.
- לאחר הבטחת הרדמה כירורגית נאותה כפי שתואר בסעיף 1.1, להמשיך בניתוח.
- בעזרת המספריים סטרילי, לעשות חתך בבטן אורך קו האמצע אחת נמוך יותר, מהחיק לתהליך xyphoid.
- באמצעות מפשק קטן, פתח את קירות הבטן לחשוף את החלל.
- השימוש בצמר גפן סטרילי הטה החלת, בעדינות לחזור המעיים superiorly לבעלי החיים של שמאל ולכסות עם הגזה טבולה בתמיסת מלח. הזז את איברי הרבייה inferiorly ולאתר את אב העורקים infrarenal ונחות הווריד הנבוב (IVC). מואיזעשר רקמות חשופות מעת לעת עם תמיסת מלח.
- באמצעות 5 המלקחיים מס 'הרפואי, להפריד את אב העורקים מIVC, מהרמה של עורק הכליה השמאלי להסתעפות. השתמש 10-0 תפרי monofilament פוליאמיד ולקשור את הענפים הקטנים ליד אב העורקים.
- ברגע שאב העורקים של התורם הופרד מIVC, להרוות את הכלי עם מי מלח, לכסות את החלל החשוף עם גזה לחה ולהגדיר את התורם בצד על אזור סטרילי. בדוק את מצבו של התורם (נשימה ותפקוד לב וכלי דם, ועומק ההרדמה) כל 15 דקות. להתחיל לפעול על הנמען, בידוד אב העורקים כמתואר להלן (שלבי 2.2.1 ל2.2.7).
- ברגע שאב עורקי הנמען הופרד מIVC ומניחים בצד, להחזיר את התורם מתחת למיקרוסקופ. מהדק צלב (פרוקסימלי ודיסטלי למגזר של ריבית) אב העורקים התורם, כ 5 גזרי מ"מ, עם שני 4 מ"מ מהדק כלי דם.
- שימוש microscissors Vannas-טובינגן,תחצה קטע קטן שתל (3 עד 4 מ"מ אורך) של אב העורקים בבטן.
- שימוש במחט 25 G 5/8 מצורפת מזרק, לשטוף את אב העורקים נכרת עם heparinized (100 U / ml) תמיסת מלח. ודא קצה המחט אינו בא במגע עם הכלי.
- אב העורקים מקום בheparinized (100 U / ml) תמיסת מלח על קרח ומניח בצד. אמנם עדיין תחת הרדמה עמוקה, לשחרר את מהדק כלי הדם. להרדים את התורם על ידי exsanguination.
- שתל כלי התורם בתוך 30 דקות של כריתה. למרות שניתן להשתמש בכלי תורם אחד למספר נמענים על ידי כריתת אורך גדול יותר של אב העורקים, לשמור על זמן איסכמי פחות מ 30 דקות.
- מבצע נמען
- לשמור על טכניקת aseptic בכל הפעולה, כמו במבצע תורם.
- מניחים את עכבר הנמען במצב שכיבה על לוח פרספקס דק עטוף בוילון סטרילי תחת מיקרוסקופ בהגדלה ההפעלה 8-30X.
- אפter להבטיח הרדמה נאותה, להמשיך בניתוח כאשר בעלי החיים אינו תערוכה רפלקס נסיגה.
- בעזרת המספריים סטרילי, לעשות חתך בבטן אורך קו האמצע אחת נמוך יותר, מהחיק לתהליך xyphoid.
- באמצעות מפשק קטן, פתח את קירות הבטן לחשוף את החלל.
- השימוש בצמר גפן סטרילי הטה החלת, בעדינות לחזור המעיים superiorly לבעלי החיים של שמאל ולכסות עם הגזה טבולה בתמיסת מלח. הזז את איברי הרבייה inferiorly ולאתר את אב העורקים infrarenal וIVC. להרטיב את הרקמות החשופות מעת לעת עם תמיסת מלח.
- הפרד את אב העורקים מIVC, מהרמה של עורק הכליה השמאלי להסתעפות. במידת צורך, להשתמש 10-0 תפרי monofilament פוליאמיד ולקשור את הענפים הקטנים ליד אב העורקים.
- מהדק צלב (פרוקסימלי ודיסטלי למגזר של ריבית) אב העורקים, כ 5 גזרי מ"מ, עם שני 4 מ"מ מהדק כלי דם.
- שימוש microscissors Vannas-טובינגן, לעשות aortotomy אופקי אחת ולכרות קטע קטן (לא יותר מ 0.5 מ"מ) של אב העורקים בבטן כדי להתאים את שתל אב העורקים התורם.
- לשטוף את אב העורקים נכרת עם heparinized (100 U / ml) תמיסת מלח. שתל אב העורקים התורם צריך להיות באורך המתאים כדי להתחבר קצות אב העורקים transected של הנמען.
- מניחים את שתל אב העורקים התורם בעמדת orthotopic וanastomose סוף השתל של התורם לסוף של הנמען, את הכיוון אנטומיים השתל המתאים לזה של נמען התאמה.
- בעדינות לתפוס פנימית וחיצוני Tunica של כלי השיט ואוורט אותו מעט באמצעות המלקחיים No.5 הרפואיים. שימוש במלקחיים, לנהוג המחט מחוברת לתפר monofilament 10-0 פוליאמיד דרך העובי המלא של קיר הכלי כדי להבטיח את שתל אב העורקים תורם לכלי resected של הנמען. תשמור על מנת להבטיח כי פתיחת הכלי לא סגורה לא בשלo תפרים מכוונים של הקיר האחורי של הספינה.
- לתפרים רציפים, למקם את תפרי שהות בשעה 9 בשני הקצוות העליונים ותחתונים של השתל. החל בקצה העליון של השתל מ03:00, anastomose קצות כריתה עם 2 תפרי ריצה ולהבטיח את התפר לתפר השהייה.
- הפוך את השתל מעל ולהמשיך תפר הריצה להגבה חלק מכלי השיט, עמידה בתפר שהות מוצא. Secure ללא הפעלת לחץ רב על הספינה. חזור על התפירה להשקה נמוכה יותר.
הערה: תפרי קטע מתחילים באותה צורה כמו התפר הרציף עם היוצא מן הכלל שהכלי הוא anastomosed עם שלושה תפרים מופרדים בין תפרי השהייה. זמן השקה הוא בדרך כלל 20 דקות.
- הפוך את השתל מעל ולהמשיך תפר הריצה להגבה חלק מכלי השיט, עמידה בתפר שהות מוצא. Secure ללא הפעלת לחץ רב על הספינה. חזור על התפירה להשקה נמוכה יותר.
- ברגע ההשקה היא מלאה, לשחרר את מהדק כלי דם דיסטלי כדי לאפשר דם מדרדר לזרום ולבדוק דליפה של אתרי anastomosed. אם יש דליפה, immediately מקום תפר לסגור את האתר הפגום. אם אין דימום באתרים, ולאחר מכן שחרר את המהדק הפרוקסימלי.
- בדוק את ההשתלה ולבדוק שאין חסימת דם בשתל, והפרוקסימלי וחלק הדיסטלי של הכלי של הנמען. דפוס דופק נמרץ בכלי של שני התורם והמקבל של אינדיקציה ראשונית שהדם זורם בחופשיות. שימוש בזוג מלקחיים, בעדינות לתפוס קצה אחד של תפרי שהייה ומעט אוורט הכלי לבדוק את הקיר האחורי של הספינה.
הערה: לא צריך להיות שום כיווץ של כלי הקיר בשני הקצוות של אתרי anastomosed. זרימת דם לקויה לאחר הסרת מהדק היא סימן של פקקת. - באמצעות החלת כותנה הטתה, להחזיר את המעיים לתוך חלל הבטן.
- עם בעל מחט Castroviejo ומלקחיים גרפה, לסגור את דופן הבטן עם 5-0 תפרי פוליפרופילן באמצעות תפרים רציפים. סגור את שכבת העור עם אותותפרים באמצעות סגירת subcuticular.
- לנהל Torbugesic im (1 מ"ג / קילוגרם) מייד עם סיום ההשתלה.
- תן מייד, בצו, Atipamezole (1 מ"ג / קילוגרם), ketoprofen (5 מ"ג / קילוגרם) וחימם תת עורי הפתרון של Lactated רינגר.
- מייד לאחר ניתוח, מקום עכברים בכלוב מחומם מתחת לשמיכת מים למשך הלילה (12 שעות). במהלך תקופת הרדמה-ההתאוששות, למקם את החיות לבד באזור נקי, יבש בלא הפרעה. קו הכלוב (autoclaved) עם מגבות נייר נקיות ולהתאים את הטמפרטורה של המים לשמיכה כ 20-22 מעלות צלזיוס. לספק kibbles היבש ורטוב כרצונך על רצפת הכלוב.
הערה: מרכיב חשוב בטיפול לאחר ניתוח הוא ההתבוננות בבעלי החיים וההתערבות מתאימה, כנדרש, במהלך התאוששות מן ההרדמה וניתוח. עוצמת הצורך של ניטור תשתנה עם בעלי החיים והוא עשוי להיות גדול יותר בתקופת התאוששות ההרדמה המיידית כשיתוףmpared להמשך התאוששות לאחר ניתוח. - הרף לפקח בעלי חיים שיש הרדמה עברה במעקב עד שהם להתאושש לחלוטין. בעלי החיים חייבים להיות מסוגלים לשמור על כיבית sternal ללא עזרה וזה חייב להיראות רגוע וחופשי מכאב לפני שניתן יהיה השאירו אותו ללא השגחה.
- תן עצירות (0.1 מ"ג / קילוגרם BID) וketoprofen (5 מ"ג / קילוגרם SID) לתקופה של שלושה ימים, שני תת עורי.
- לפקח לב וכלי דם ותפקוד נשימה, טמפרטורת גוף, וכאב שלאחר ניתוח או אי נוחות במהלך התאוששות מהרדמה למינימום של שלושה ימים. ייתכן שיידרש טיפול נוסף, כגון ניהול של משככי כאבים ותרופות אחרות, ונוזלי parenteral כדי להקטין את איבוד התייבשות ואלקטרוליטים.
- להעריך את ההצלחה של הניתוח להשתלה על ידי התבוננות בתפקוד המוטורי של הגפיים האחורי. הצלחה מלאה של ההשתלה כרוכה בזרימת דם בלא הפרעה לגפיים האחוריות וזנב, שאמורה להיות מיידי על התאוששות של עניםאל, והחלמה מלאה ללא שיתוק של הגפיים האחוריות ביום השני
אוסף 3. רקמות
הערה: נקודות קצה שנקבעו מראש נעות 3-60 ימים בהתאם לסוג של הניתוח הרצוי והטבע של חוסר התאמת אנטיגן. בדרך כלל, עיבוי intimal הוא חזק ביום 30 לאחר השתלה על פני זני עכבר תואם מלאים MHC.
- להרדים את העכבר עם זריקות intraperitoneal של קטמין (100 מ"ג / קילוגרם; 10 מ"ג / מיליליטר) ו xylazine (10 מ"ג / קילוגרם; 1 מ"ג / מיליליטר). להעריך את עומק ההרדמה על ידי צובט את החלק השומני של כרית כף רגל בעלי החיים. להמשיך בניתוח כאשר בעלי החיים אינו תערוכה רפלקס נסיגה.
- נקה את האתר כירורגית עם מים וכלה באלכוהול 70%.
- מניחים את החיה במצב שכיבה על מגש מרופד במשטח סופג.
- פתח את חלל הבטן עם חתך אורכי קו האמצע גדול. הנח מפשק שמירה עצמית לחשוף את החלל, IVCד אב העורקים בבטן.
- בעדינות להפריד את קטע אב העורקים תורם הושתל מIVC השכן באמצעות זוג מס '5 מלקחיים רפואיים. להיות זהיר במיוחד לא להתפשט adventitia של כלי השיט המושתל.
- לחשוף את חלל בית החזה על ידי חיתוך דרך הצלעות לאורך שני צידי עמוד השדרה החזי כל הדרך לכניסת בית החזה. משקף את קיר החזה הקדמי superiorly לחשוף את קרום הלב ולאבטח את בית החזה עם זוג hemostat.
- ברגע שהלב חשוף, להכניס מחט 25 G 5/8 (מצורפת מזרק) לתוך החדר השמאלי ולשטוף עם 0.1 מיליליטר של תמיסת מלח heparinized (100 U / ml).
- שימוש במספריים, להסיר את העלייה הימנית כדי לאפשר לדם, מלוח heparinized, ומקבע לעזוב את הגוף במהלך זלוף. Perfuse את החיה עם 5 מיליליטר של paraformaldehyde 4% או עד ריצות הנוזל צלולים. הסר את הלב על מנת להבטיח המתת חסד.
- בלו מושתל מגזר כלי ולטבול בסעיף 4%פורמלדהיד לא יותר משעה. הגדר את הכלי המושתל באוקטובר (טמפרטורה אופטימלית חיתוך) מטריצה ובזק הקפאה. סעיף הכלי תחת cryostat נקבע על 8 עובי אום. סעיפי כתם עם Haematoxylin & Eosin ו / או Verhoeff-אן Gieson (אן Gieson) כתם אלסטי.
4. ניתוח מורפולוגי של תל
הערה: ת"א מאופיינת בעיבוי intimal 13. במודל זה, עיבוי intimal והפחתת תוצאה בגודל של לומן הם שיקוף של חומרת פגיעה בכלי הדם בתיווך חיסונית. בקרות Syngraft משמשות כדי לקבוע את המאפיינים הבסיסיים של כלי שיט בהעדר תגובה חיסונית אלוגנאית. בקרות אלה גם מאפשרות הערכה של נזק עורקים המתרחש כתוצאה מההליך כירורגי. לא צריך להיות שום עיבוי intimal בsyngrafts.
- כדי לבחון עיבוי intimal וחסימת luminal, למדוד את השטח בתוך התא אנדותלשכבה, lamina הפנימי אלסטי (IEL) וlamina החיצוני אלסטי (צלופח) במגזרי עורק מוכתם אלסטי ואן Gieson עם תוכנת ניתוח תמונה. הפרמטרים להלן יכולים לשמש כדי לקבוע שינויי עורקים רעיוני של ת"א.
- למדוד את שטח intimal המוחלט: אזור בתוך lamina האלסטיות הפנימי - האזור בתוך שכבת תאי האנדותל. זה מספק מדידה מוחלטת של התרחבות intimal, המהווה את סימן ההיכר של ת"א.
- למדוד את השטח המוחלט המדיאלי: אזור בתוך lamina האלסטיות החיצוני - אזור בתוך lamina האלסטיות הפנימי. זה מספק מדידה מוחלטת של השפלה המדיאלי או צמיחה, שלעתים יכול להתרחש כתוצאה משינויים בתיווך חיסוני לאזור זה של קיר הכלי.
- למדוד את השטח הכולל כלי כמו האזור בתוך lamina האלסטיות החיצוני. זה מספק מדידה של שיפוץ כלי שיט הכוללת התרחבות או התכווצות של עורק כתוצאה מניזק חיסוני.
- מדד/ (אזור בתוך lamina האלסטיות החיצוני - אזור בתוך lamina האלסטיות הפנימי) - (אזור בתוך שכבת תאי האנדותל אזור בתוך lamina האלסטיות הפנימי): אינטימה / מדיה. זה מספק מדד יחסי של הרחבת intimal ומנרמל להבדלים בגודל כלי.
- מדוד את צמצום Luminal%: [(אזור בתוך lamina האלסטיות הפנימי - אזור בתוך שכבת תאי האנדותל) / אזור עם lamina האלסטיות הפנימי)] * 100. זה מספק מדד של היקף חסימת luminal, הנובע משילוב של הרחבת intimal ושיפוץ (פנימה או החוצה) של קיר הכלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במודל זה, אב העורקים בבטן מעכבר BALB / cYJ הוא התערב לאב עורקי infrarenal של נמען C57Bl / 6. זה מאפשר הערכה מקיפה של alloimmune תגובות כי יעד עורקי שתל. פציעה של כלי דם בתיווך חיסוני במודל זה יוזמת תגובות מתקן כלי דם שמגיעות לשיא בעיבוי intimal, צמצום luminal וגיוס של תאים חיסוניים (איורים 1 ו -2). אז קריטריונים אלו משמשים כקריאה החוצה לחומרת alloimmune תגובות, דחייה של כלי דם, ות"א. הצלחה של ההליך ניתן להעריך על ידי הפיתוח של עיבוי intimal חזק של מגזרי עורק שתל והעדר עיבוי intimal בבקרת syngraft. מבחינה קלינית דיכוי חיסוני רלוונטי ניתן להשתמש במודל זה דומה השתלה קלינית באופן הדוק יותר. גם מודל זה ניתן להשתמש בבעלי חיים מהונדסים כדי לחקור את ההשפעה של חלבונים / מסלולים ספציפיים בalloimmune תגובותים שעשינו 14.
מגזרי אב העורקים שתל לפתח עיבוי intimal
סכום הנזק בכלי הדם של שתל בתיווך חיסוני נבדק על ידי כימות עיבוי intimal וצמצום luminal במגזרי אב העורקים מורכבים ביום 30 לאחר ההשתלה. מגזרי עורק שתל לפתח עיבוי intimal משמעותי וחסימת luminal ולא שינויים שנצפו בקטעי syngraft עורק שליטה (איור 1).
הצטברות של לויקוציטים במגזרי אב העורקים של שתל.
ההצטברות של לויקוציטים בעורקי שתל נבדקה על ידי כימות מספר תאי CD4 T, תאי CD8 T, ומקרופאגים (מק-3) 15 על ידי אימונוהיסטוכימיה. מק-3 שימש להכתים למקרופאגים במחקר זה למרות סמנים אחרים, כגון F4 / 80, יכולים לשמש גם 16. תאי CD4 T, תאי CD8 T ומקרופאגים אותרו ב אינטימה של עורקי שתל (איור 2)
איור 1: ניתוח היסטולוגית של עורקים מורכבים () מגזרי אב העורקים בבטן מsyngeneic ועכברים אלוגנאית היו התערב לaortas בטן הכריתה של C57Bl / 6 עכברים.. העורקים המורכבים נקצרו ביום 30 לאחר ההשתלה. photomicrographs נציג של עורקים מוכתמים ואן אלסטי Giesen מוצג. כימות adventitia (ג): בר סולם = 0.1 מ"מ = 100 מיקרומטר תרשים (ב ') מתאר כיצד השכבות השונות של כלי השיט נמדדות, L:. לום, E: שכבת האנדותל, אני: אינטימה, M: תקשורת,. אינטימה / יחס תקשורת וluminal% מצמצום syngeneic היום 30 (n = 3) ואלוגנאית (n = 6) השתלות, * P <0.05.= "_ Blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: הצטברות תאים חיסונית בעורקים של שתל. photomicrographs נציג של מגזרי אב העורקים שתל מוכתם immunohistochemically ל() CD4, (ב) CD8, ו- (ג) מק-3 וcounterstained עם hematoxylin מוצג. בר סולם = 0.1 מ"מ = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש לנו תיארנו פרוטוקול לחציצת אב העורקים השתלה בעכברים שהם שימושי ללימוד דחייה של כלי דם בתיווך חיסוני ות"א. מודל זה יכול לשמש כדי לחקור את הסיבות לת"א, כמו גם את הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות חדשניות. זה כבר נעשה שימוש בעבר להקים תפקיד חיוני של חסינות אדפטיבית, תגובות תא T ציטוטוקסי, תגובות מפעיל תאי CD4 T בתיווך ציטוקינים, ונזק שתל בתיווך נוגדנים בת"א 14,17-21. השתלת עורק בעכברים קשה בשל הגודל הקטן הברור של בעלי החיים; עם זאת, עם תרגול ובדיקה נאות, יכולים להיות מושלם ניתוחים מוצלחים. הצלחה תלויה בפתיחות של כלי השיט. זה כרוך בהבטחה שהשתל לא נפגע בצורה לא נכונה טיפול הספינה עם מלקחיים, התכווצות של כלי לומן, תפירת הקיר האחורי של הספינה, ותפירה חוזרת ונשנית של אותו האתר. דליפה של הכלי היא גם בעייתית ודורשת טיפול לדוארNsure כי המספר והמיקום של התפרים מחולקים באופן שווה סביב קיר הכלי. כמו כן הוא חיוני כי איסכמיה שתל ממוזערת פחות מ -30 דקות. עם זה, שיעור הצלחה של יותר מ 95% ניתן להשיג.
אב העורקים הוא העורק הגדול ביותר בעכבר כדי הליך זה הוא גישת מייקרו הפשוטה לחקירת דחייה של כלי דם בבעלי חי מודל זה. כמו כן, מגזר אב העורקים הוא מורכבים במיקום רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, חווה את זרימת דם נורמלית, ועיבוי intimal מתפתח במהירות. המודל העיקרי האחר המשמש להערכה של דחיית כלי דם ות"א הוא השתלת לב heterotopic, שבו יש את היתרון של בחינת ההתפתחות של ת"א בעורקים הכליליים ובהקשר של השתלת לב שהוא התרחיש הקליני הרלוונטי ביותר לת"א. עם זאת, השתלות לב heterotopic ממוקמות במיקום שאינו פיסיולוגי בגוף (בדרך כלל anastamosed לווריד הנבוב ואב העורקים בבטן) והלב לא לשאוב דם דרך חדרי הלב בשל האופי המדרדר של אספקת הדם ללב המושתל. ככזה, אופי זרימת דם דרך העץ כלילית עשוי להיות שונה ממה שרגיל חווה על ידי כלי הדם הכליליים 22,23. כמו כן, אסטרטגיות כדי להתגבר על דחייה חריפה של הלב חייבת להיות משולבות כדי להעריך את השינויים בעורקים. בשני המודלים, חשוב לבחור בקפידה את סוג אי התאמת אנטיגן מנוצלת כדי להיות מסוגל לתת מענה הולם לשאלות ספציפיות הנוגעות לדחייה של כלי דם ות"א.
לסיכום, השתלת חציצת אב העורקים היא טכניקה רבת עוצמה לחקירת נזק עורקים בתיווך חיסוני ות"א. זה ניתן לשלוט באופן שיגרתי עם תרגול והתמדה מצד החוקר. שולט ברגע, הליך זה יכול להיות שונה עבור השתלת החציצה של מגזרי עורקים אחרים, כגון עורק תרדמה, הבעשוי לאפשר הבדיקה של שאלות מדעיות נוספות. כמו כן, השימוש במודל זה יכול להתארך מעבר למחקר של השתלה. השתלת חציצה של עורקים יכולה לשמש כדי להציג קטעים מעורקים שונה (למשל מהונדס או האכלה בשומנים) עכברים לעמיתים שונה שאינם, או להיפך, כדי לבודד את ההשפעות הביולוגיות של מולקולות לקיר עורק תאים לעומת קיר תאים שאינם עורקים 24 , 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הקנדי לבריאות מחקר ולב ושבץ קרן של BC ויוקון (JCC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories, Bar Harbour ME | Strain# 000664 | |
| Balb/cBYJ | Jackson Laboratories, Bar Harbour ME | Strain# 001026 | |
| Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ml | Ketalean | DIN 00612316 | |
| Xylazine Injection 20 mg/ml | Rompum | DIN 02169592 | |
| Ketoprofen Injection 100 mg/ml | Anafen | DIN 01938126 | |
| Butorphanol Tartrate injection 10 mg/ml | Torbugesic | DIN 008450000 | |
| Buprenorphine Injection 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser | B.N. 5241 | |
| Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution | Antisedan | DIN 02237744 | |
| Heparin Sodium Injection, USP, 1,000 units/ml | McKesson Distribution | DIN 02264315 | |
| Tears naturale ophthalmic ointment | Alcon | DIN 02082519 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| 0.9% Sodium Chloride, sterile | Baxter Corporation | ||
| Lactated Ringer’s solution, sterile | Baxter Corporation | ||
| 0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 ml | Baxter Corporation | ||
| Alcohol Prep Pads | Loris | ||
| Povidone Iodine | Betadine | ||
| Chlorohexidine Gluconate 4% w/v | Germi-Stat | ||
| Black Polyamide Monofilament | AROSurgical Instruments | T4A10Q07 | |
| Suture, 10-0 suture, 70 microns | Corporation | ||
| Blue monofilament suture 5-0, P3 needle | Ethicon | 8698G | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 1cc TB insulin syringe with 28 G 1/2 | BD | REF 309309 | |
| 25 G 7/8, hypodermic needle | BD | REF 305124 | |
| 27 G 1/2, hypodermic needle | BD | REF 305109 | |
| Colibri Retractor- 1.5 cm spread 4 cm | Fine Science Tools | 17000-04 | |
| S&T CAF-4 Clip applying forceps, without lock | Fine Science Tools | 00072-14 | |
| Supergrip forceps, S&T | Fine Science Tools | 00632-11 | |
| Medical No.5 forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Lexer Baby Scissors | Fine Science Tools | 14078-10 | |
| Micro Adson forceps serrated | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Vannas-Tubingen microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length | Fine Science Tools | 00396-01 | |
| Graefe-forceps, 10cm 1x2 teeth | Fine Science Tools | 11054-10 | |
| Castroviejo with lock and tungsten jaws | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Hot glass bead sterilizer | Inotech 250 | IS-250 - Steri-250 | |
| Non-woven gauzes | Progene | ||
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | ||
| Beard Trimmer | Wahl | ||
| Heating pad | Sunbeam |
References
- Billingham, M. E. Graft coronary disease: the lesions and the patients. Transplant Proc. 21, 3665-3666 (1989).
- Foegh, M. L. Chronic rejection--graft arteriosclerosis. Transplant Proc. 22, 119-122 (1990).
- Libby, P., Pober, J. S. Chronic rejection. Immunity. 14, 387-397 (2001).
- Tellides, G., Pober, J. S. Interferon-gamma axis in graft arteriosclerosis. Circulation research. 100, 622-632 (2007).
- Johnson, D. E., Gao, S. Z., Schroeder, J. S., DeCampli, W. M., Billingham, M. E. The spectrum of coronary artery pathologic findings in human cardiac allografts. The Journal of heart transplantation. 8, 349-359 (1989).
- Gao, S. Z., Alderman, E. L., Schroeder, J. S., Silverman, J. F., Hunt, S. A. Accelerated coronary vascular disease in the heart transplant patient: coronary arteriographic findings. Journal of the American College of Cardiology. 12, 334-340 (1988).
- Mennander, A., et al. Chronic rejection in rat aortic allografts. An experimental model for transplant arteriosclerosis. Arterioscler Thromb. 11, 671-680 (1991).
- Choy, J. C. Granzymes and perforin in solid organ transplant rejection. Cell Death Differ. 17, 567-576 (2010).
- Johnson, P., Carpenter, M., Hirsch, G., Lee, T. Recipient cells form the intimal proliferative lesion in the rat aortic model of allograft arteriosclerosis. Am J Transplant. 2, 207-214 (2002).
- Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
- Yu, L., et al. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting interferon-gamma-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Circ Res. 109, 418-427 (2011).
- Miller, C., DeWitt, C. W. Cellular and humoral responses to major and minor histocompatibility antigens. Transplant Proc. 5, 303-305 (1973).
- Tsutsui, H., et al. Lumen loss in transplant coronary artery disease is a biphasic process involving early intimal thickening and late constrictive remodeling: results from a 5-year serial intravascular ultrasound study. Circulation. 104, 653-657 (2001).
- Rossum, A., Enns, W., Shi, P., MacEwan, G. E., Choy, J. C. Bim regulates allogeneic immune responses and transplant arteriosclerosis through effects on T cell activation and death. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 1290-1297 (2014).
- Ho, M. K., Springer, T. A. Tissue distribution, structural characterization, and biosynthesis of Mac-3, a macrophage surface glycoprotein exhibiting molecular weight heterogeneity. J Biol Chem. 258, 636-642 (1983).
- Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney international. 67, 2488-2493 (2005).
- Shi, C., et al. Immunologic basis of transplant-associated arteriosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 4051-4056 (1996).
- Skaro, A. I., et al. CD8+ T cells mediate aortic allograft vasculopathy by direct killing and an interferon-gamma-dependent indirect pathway. Cardiovasc Res. 65, 283-291 (2005).
- Tellides, G., et al. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
- Wang, Y., et al. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ Res. 101, 560-569 (2007).
- Soulez, M., et al. The perlecan fragment LG3 is a novel regulator of obliterative remodeling associated with allograft vascular rejection. Circ Res. 110, 94-104 (2012).
- Choy, J. C., Kerjner, A., Wong, B. W., McManus, B. M., Granville, D. J. Perforin mediates endothelial cell death and resultant transplant vascular disease in cardiac allografts. Am J Pathol. 165, 127-133 (2004).
- Choy, J. C., et al. Granzyme B induces endothelial cell apoptosis and contributes to the development of transplant vascular disease. Am J Transplant. 5, 494-499 (2005).
- Reis, E. D., et al. Dramatic remodeling of advanced atherosclerotic plaques of the apolipoprotein E-deficient mouse in a novel transplantation model. Journal of vascular surgery. 34, 541-547 (2001).
- Potteaux, S., et al. Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe-/- mice during disease regression. J Clin Invest. 121, 2025-2036 (2011).
