Abstract
Pankreatisk duktal adenokarcinom (PDAC) innehåller en delmängd av uteslutande tumörogena cancerstamceller (CSCS) som har visat att driva tumörinitiering, metastas och motståndskraft mot radio- och kemoterapi. Här beskriver vi en särskild metod för odling av primära humana pankreas CSCs som tumör sfärer i förankringsoberoende förhållanden. Celler odlas i serumfria, icke vidhäftande betingelser i syfte att anrika för CSCs medan deras mera differentierade avkommor inte överlever och prolifererar under den inledande fasen efter sådd av enskilda celler. Denna analys kan användas för att uppskatta procentandelen av CSCs närvarande i en population av tumörceller. Både storlek (som kan variera från 35 till 250 mikrometer) och antalet tumör sfärer bildade representerar CSC aktivitet hyste antingen bulk populationer av odlade cancerceller eller nyskördade och smält tumörer 1,2. Med hjälp av denna analys fann vi nyligen att metformin ablates selektivt pancreatic CSCs; ett konstaterande som senare bekräftas ytterligare genom att visa minskad expression av pluripotens associerade gener / ytmarkörer och minskad in vivo tumorigenicitet av metformin-behandlade celler. Som det sista steget för preklinisk utveckling vi behandlade möss med etablerade tumörer med metformin och fann signifikant förlängd överlevnad. Kliniska studier som testar användningen av metformin hos patienter med PDAC pågår (t.ex. NCT01210911, NCT01167738 och NCT01488552). Mekanistiskt, fann vi att metformin inducerar en dödlig energikris i CSCs genom att öka reaktiva syreradikaler (ROS) produktionen och minska mitokondriell transmembranpotentialen. Däremot var icke-CSCs inte elimineras genom metforminbehandling, utan snarare genomgick reversibel cellcykelstopp. Därför tjänar vår studie som ett framgångsrikt exempel på de möjligheter som in vitro sfär bildningen som en screeningmetod för att identifiera föreningar som potentiellt riktar CSCar, men kommer denna teknik att kräva ytterligare in vitro och in validerings vivo för att eliminera falska upptäckter.
Introduction
Pankreatisk duktal adenokarcinom (PDAC) är en av de mest aggressiva fasta tumörer. Det är för närvarande den 4: e vanligaste cancerrelaterade dödsfall i det västerländska samhället och förutspås stiga till 2: a vanligaste orsaken inom de närmaste tio åren (~ 400.000 dödsfall per år i hela världen) 3 .Vid tidpunkten för diagnos 90% av patienterna som före med avancerad sjukdom, som har en 5-års överlevnad på mindre än 5%. Denna överlevnad har tyvärr varit oförändrad under de senaste 50 åren, trots allt intensivare forskningsverksamhet 4. Av de återstående 10% av patienterna som har potentiellt "botas" sjukdomen genom kirurgisk resektion, kommer 80% dör av återfall inom fem år. För många år standardbehandling för avancerad sjukdom har varit gemcitabin monoterapi, men detta endast ger en marginell överlevnadsfördel 5. Små förbättringar i kortsiktig överlevnad har uppnåtts genom tillsatsav erlotinib 6 eller capecitabin 7, men överlevnad är i storleksordningen veckor med medianöverlevnaden fortfarande ~ 6 månader. På senare tid har mer uppmuntrande resultat framkommit för gemcitabin / NAB -paclitaxel 8 och FOLFIRINOX kombinationsregimen 9,10. Dessa behandlingar förbättra medianöverlevnad med måttliga 2 och 4 månader respektive, men är mycket giftiga och långsiktiga överlevande är fortfarande ett sällsynt undantag. Även behandling ger potential för förbättringar, dessa är giftiga regimer som många patienter inte svarar eller endast visar stegvis förbättring i total överlevnad. Som en följd av detta finns det ett akut behov av att komplettera nuvarande terapier och att utveckla nya, troligen multimodala terapeutiska metoder.
Tumör Heterogenitet
Det blir allt mer uppenbart att cancer heterogenitet inte bara är begränsad till distinkta evolutionära subkloner within varje tumör 11, men också till följd av fenotypiska och funktionella heterogenitet och plasticitet inom varje subklon 12. Så kallade cancerstamceller (CSCS) eller tumörbefrämjande celler är ansvariga för intraclonal heterogenitet 13-16. Specifikt CSCs utgör en delmängd av cancercell, som vi och andra har lämnat avgörande bevis, ner till en enda cell, att de utgör roten till sjukdomen genom att ge upphov till alla differentierade avkommor inom varje cancer subklon 17. Ännu viktigare, dessa celler är nödvändiga för metastaserande beteende och också utgör en viktig källa för återfall efter behandling, även med relativt effektiva läkemedel som kan inducera initial tumörregression (t.ex. NAB -paclitaxel) 15,18-20. Det är viktigt att notera att CSCs inte nödvändigtvis representera bona fide stamceller, inte heller uppstår från vävnads stamceller i många fall, utan snarare har de ACQuired vissa funktioner i stamceller. De flesta av dessa är funktionellt definierade, exempelvis CSCs är utrustade med obestämd självförnyelse kapacitet gör dem resistenta mot konventionell kemoterapi, och visar ökad invasiv som främjar metastaserande aktivitet.
Funktionella Cancer Stem Cell Fenotyper
Den funktionella fenotypen av CSCs är baserat på deras förmåga att själv förnya, som kan testas in vitro med hjälp av serie sfär bildning och kolonibildningsanalyser respektive. Ännu viktigare, CSCs kan självförnyelse björn in vivo tumorigenicitet som kan testas genom begränsande utspädning in vivo som den ultimata funktionella avläsning, företrädesvis under serie transplantation indikerar exklusiva långtids tumorigenicitet. Dessutom finns det heterogenitet inom CSC utrymmet, med en distinkt underpopulation av CSCs försedda med exklusiv förmåga att ge upphov till metastaser som inte bara är endirekt följd av deras exklusiva in vivo tumorigenicitet. I själva verket, metastastitic CSCs förvärva förmågan att kringgå den primära tumören, överleva anoikis och så småningom translokerar och utsäde sekundära platser. Dessa avancerade funktionsförmåga kan testas in vitro med användning av modifierade invasionsanalyser och in vivo med hjälp av metastaser analyser.
Inriktning cancerstamceller
Vi och andra har gett övertygande bevis för att behandling med fokus på bulk tumör i differentierade PDAC celler, även i kombination med stroma-målsökande medel, inte har en stor inverkan på tumörprogression och efterföljande utfall inte kombineras med en CSC-inriktning strategi 21, 22. Således, baserat på de viktiga funktionerna i CSCs i sjukdomsprogression och resistens mot behandling, bör dessa celler innebära en väsentlig komponent för varje ny behandlingsform 18,20, men kommer att kräva en mycket mer grundlig förståelse of reglerings maskineri CSCs. Även CSCs och deras mer differentierade avkommor bära identiska genetiska grundtillstånd med avseende på genetiska förändringar, CSCs uppvisar tydliga och därmed epigenetiskt bestämda genuttryck profiler som delar moduler med pluripotenta stamceller. De flesta av de inblandade i genere inducerade pluripotenta stamceller (NANOG, Oct3 / 4, Klf4, Sox2) gener har bara inte kopplats till cancer, men deras uttryck är oftast begränsad till CSCs facket. Dessutom har den funktionella betydelsen av CSCs genom förlust-of-funktion experiment med genetiska verktyg för att rikta CSCs nu etablerat CSC koncept för flera cancertyper 23-25. Medan de flesta av dessa metoder är baserade på musmodeller och därmed inte lätt kan överföras till kliniken, de ger proof-of-concept för den potentiella kliniska relevansen av inriktning CSCs i kombination med bulktumörceller.
Studera cancerstamceller i Vitro att identifiera sina akilleshäl
För att identifiera nya och kliniskt tillämpliga sätt för att rikta CSCs är deras funktioner regelbundet studerade in vitro och sfär bildning används ofta i detta sammanhang. Utvecklades ursprungligen för att studera normal stamcellsbiologi, inklusive självförnyelse och differentiering kapacitet, var denna analys anpassades senare för att studera CSCs in vitro och har använts för att undersöka CSCs isolerade från PDAC 20. Vi har funnit att tumör sfärer bildade från primära humana PDAC celler stå för alla olika funktioner i CSCs, vilket tyder på att de innehåller bona fide bukspottkörteln CSCs 21. Således representerar tumörområdet analysen ett kraftfullt verktyg för att screena för effektivare behandlingsmetoder in vitro, men resultaten måste utvärderas ytterligare på strängare in vivo. Faktum är att data som genereras med detta in vitro bör behandlas med stor försiktighet eftersom the-analysen kan bli föremål för betydande fel. Mycket standardiserade protokoll, inklusive automatisk räkning av formade sfärer, bör inrättas för att säkerställa reproducerbara och prediktiva data.
I detta sammanhang använde vi nyligen denna analys för att screena bukspottkörteln CSCs härrör från en mångfald av primära humana PDACs och visade att dessa celler är mycket känsliga för metabolisk omprogrammering av anti-diabetesförening metformin. Tidigare hade metformin visats hämma cancerceller expansion genom indirekt aktivering av AMP-aktiverat proteinkinas (AMPK) signalering och efterföljande hämning av mTOR 26, vilket resulterar i minskad proteinsyntes och celltillväxt 27. Utöver dessa effekter på bulktumör befolkningen, har vi och andra funnit att metformin kan rikta och faktiskt eliminera CSCs subpopulation i ett antal fasta tumörer såsom bröst-, matstrupscancer, glioblastom och pankreascancer 28-31 </ Sup>. Således representerar metformin en lovande och säker ny terapeutisk strategi för flera cancerformer med för närvarande stora medicinska behov. Dessutom använder sfär bildning som ett sätt att berika för CSCs, visade vi att metformin primära effekter på bukspottkörteln CSCs var oberoende av AMPK aktivering och förlitade sig främst på sin blygsamma mitokondriell toxicitet (via hämning av komplex I), som uppenbarligen var dödlig för delmängd av CSCs endast. För den senare kunde vi bedöma deras cellulära syreförbrukning och mitokondrie ROS produktion som indikatorer på läkemedlets toxicitet på cellnivå. Därefter kan dessa in vitro-data valideras i prekliniska musmodeller och faktiskt resulterat i signifikant förlängd överlevnad 31. Den metod som presenteras här möjliggör snabb generering av läkemedelskänslighetsprofiler för CSCs, inklusive studier av deras effekt på CSC metabolism. Vi har nu ger utökad experimentella detaljer om den utnyttjade completterande in vitro och in vivo-förfaranden.
Protocol
Mänskliga PDAC tumörer erhölls med skriftligt informerat samtycke (Comunidad de Madrid, Spanien (CP CNIO-CTC-11 -. CI 11/103-E) Implantation av humana pankreastumörer i immundefekta möss kräver godkännande av Institutional Review Board samt institutionella . Djurvård och användning kommittén (IACUC) Tillvägagångssättet för xenograft pankreasmodeller tumör mus måste utföras i enlighet med de institutionella och nationella bestämmelser (här etikkommitté Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spanien, protokoll PA 34_2012).
1. Kultur Media
- Förbered Komplett Medium.
- Supplement RPMI-medium med 10% FBS, 100 enheter / ml penicillin / streptomycin. För 500 ml RPMI till 55 ml värmeinaktiverat FBS och 6 ml penicillin / streptomycin (10000 U / ml, 100X).
- Förvara komplett medium vid 4 ° C.
- Förbered CSCs Medium.
- Komplettera serumfritt DMEM / F12 medium med 100 enheter / ml penicillin / streptomycin och 2 mM glutamin.
- Förvara CSC-medium vid 4 ° C. B27 (01:50) och 20 ng / ml bFGF är nyligen till mediet före varje experiment.
OBS: Tillsats av B27 har visat sig öka tumörområdet bildning och att upprätthålla flera passager av sfärkulturer 32. Mediet kompositionen är ett avgörande steg och måste testas för varje celltyp i odling. Vi rekommenderar att testa självförnyelse och differentiering kapacitet av sfärer och analysera uttryck av CSC markörer med flödescytometri (dvs CD133 + och CD44 +).
- Förbered Extracellulärt Flux analysmedium.
- Denna specifika medium är basal DMEM 5030 innehåller vitaminer, aminosyror och andra kosttillskott, men saknar glutamin, glukos, pyruvat och bikarbonat.
- För den nuvarande analysen, komplettera medium med 2 mM glutamin, 8 mM glukos och 2 mM natriumpyruvat till en fullständig mitokondrie metabolisk aktivitet.
OBS: Avsaknaden av natriumbikarbonat är nödvändig för att noggrant mäta extracellulära försurning av celler som växer i kultur, eftersom vanlig medium innehållande bikarbonat kommer pH variationer under analysen. Dessutom, användningen av ett basmedium tillåter en noggrann kontroll av koncentrationen av L-glutamin (såsom L-alanyl-glutamin) glukos, eller natriumpyruvat som behövs för olika analysbetingelser och / eller program.
2. Sphere Forming analys och analys
OBS: Alla vävnadsodlingsprotokoll och manipulationer måste utföras med sterila tekniker med stor uppmärksamhet med rent, tvättmedel-fri, steril glas. Före användning, pre-varma hela mediet och lösning i ett 37 ° C vattenbad (som ett alternativ, kan du använda mediet och lösningar förvärmda vid RT). Skaffa Human PDAC tumörer som beskrivits tidigare 21.
- Isolering av CSCs från Human PDAC (Figur1)
- I en steril biosäkerhet skåp överföra den humana PDAC vävnad till en 60 x 15 mm odlingsskål innehållande en ml sterilt 1X fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Finhacka tumören i små bitar (1 - 5 mm) med användning av en steril skalpell och pincett.
- Tillsätt 1 ml steril 1X PBS till odlingsskålen och upprepa triturering steget tills vävnaden är helt dissocierad, regelbundet detta kräver 3-4 rundor. Överför vävnadssuspension (topp upp till en slutlig volym av 5 ml med 1 x PBS) i ett sterilt rör och mekaniskt homogenisera den med en dissociator såsom gentleMACS.
- Inkubera den homogeniserade vävnaden med kollagenas (använd 2,5 mg / ml kollagenas i 1X PBS) under 60 min vid 37 ° C och centrifugera sedan i 5 minuter vid 900 x g. Dekantera supernatanten och resuspendera cellpelletar i 10 ml komplett medium. Filtrera cellsuspensionen genom en 40 | im sil och centrifugera i 5 minuter vid 900 x g.
- Dekantera supernatanten och resuspenderapellet med 5 ml röda blodkroppar lyseringsbuffert (ammonium-klorid-kalium-, ACK), och inkubera
- Återsuspendera pelleten i CSCs medium plattan på en gelatinbelagd skål, och inkubera vid 37 ° C under 1 timme. Detta steg kommer att avlägsna det mesta av de fibroblastceller som snabbt fäster till plattan.
- Avlägsna plattan från kuvösen och försiktigt återhämta cellsuspensionen och kvantifiera antalet livskraftiga (trypanblått-negativa) celler med hjälp av en hemocytometer. För detta ändamål försiktigt blanda suspensionen och pipettera 20 ul av suspensionen till ett Eppendorf-rör. Lägg 20 | il (1: 1 förhållande) av trypanblått till cellerna i mikrocentrifugrör och blanda väl. Pipett cirka 10 pl av blandningen på hemocytometer.
- Räkna alla tydliga celler inom de fyra hörn kvadranter räknekammaren för livskraftiga cellräkning. Obs! Lönsamhet och avkastning av celler kan variera kraftigt mellan tumörprover. För PDAC prover viabilitet varierar regelbundet betwesv 45-70%, och vävnadsbitar från en makroskopisk tumörprov med en diameter på 3 - 5 mm bör ge till cirka 5x10 6 levande celler.
- Sphere Formation analys och metforminbehandling
- Ta det nödvändiga antalet celler och tillsätt lämplig volym av CSCs medium för att framställa en cellkoncentration av 2000 celler / ml. Förvara inte cellsuspensionen på is under en längre tid än 1 timme och blandades väl före plätering.
- Lägg 500 pl av 1 x PBS till den första och sista raden av en 24-brunnsplatta för befuktning för att hjälpa till att minimera medel avdunstning. Ympa cellerna till ultralåga fäst celler plattor vid en densitet av 2000 celler per brunn i 1 ml tumör sfär-medium (2000 celler / ml).
OBS: Det antal celler som används för tumör sphere bildningsanalyser kan variera mellan tumörtyper. - Behandla åtminstone fyra brunnar med vehikel (negativ kontroll) och fyra brunnar med varje allokerad behandling, t ex., 3 mM av metformin. Place cellerna i en inkubator inställd på 37 ° C och förse cellerna med 5% CO2 under en vecka.
OBS: Mediet ska inte ändras så att den ostörda bildandet av tumör sfärer, men kan fyllas på med tillväxtfaktorer på en daglig basis, eftersom de inte är stabila i odlingsmedium. - Varannan dag lägga behandling, till exempel., 3 mM av metformin eller fordon till var och en av brunnarna. Utvärdera antalet bildade tumör sfärer efter 5 och / eller 7 dagar med hjälp av en automatiserad cellräknare som gör det möjligt för räkning av större strukturer (Figur 2).
OBS: Endast tumör sfärer med åtminstone 40 um bör övervägas och kan kategoriseras som små (40-80 um) eller stora (80-120 pm), respektive. Resultaten kan illustreras som den procentuella andelen av tumör sfärer delat med den ursprungliga antalet celler sådda (t.ex. 2000 celler).
- Seriepassage av Generation tumör sfärer
- Dissociera pellet av tumör sfärer till enskilda celler med hjälp av trypsin, och sedan utöka den erhållna encelliga celler fjädring igen för ytterligare 7 dagar som beskrivits ovan (se 2.2).
3. Metabolism Analysis (ROS produktion och syreförbrukning)
- ROS Produktion
- I detta protokoll, har vi använt karboxi-DCFDA som ett exempel för att mäta ROS produktion eftersom det är en prisvärd, snabb och mest använda sond för ROS upptäckt. Det finns emellertid flera andra sönder och metoder som kan användas för denna analys.
- Behandla tumör sfärer med metformin som beskrivs i 2.2 för den tilldelade tid. Vid slutet av behandlingen, skörd tumörsfärer med användning av en 40 | im cellfilter, centrifugera cellerna vid 900 xg under 5 min och återsuspendera pelleten i 1 ml Trypsi. Inkubera under 20 minuter vid 37 ° C.
- När cellerna singularized, centrifugera vid 900 xg och suspendera cellerna i HBSS innehållande 2,5 iM karboxi-DCFDA. Inkubera cellerna under 20 min vid 37 ° C i mörker.
- Före flödescytometrianalys skyddar färgade celler från ljus som karboxi-DCFDA kan vara fotooxideras ger falska positiva resultat. Placera rören på is tills analys.
OBS: karboxi-DCFDA är fluorescerande efter reaktion med en mängd olika reaktiva syre- och kvävearter, detekteras i FL1 (fd 488nm, em 520 nm..).
- Syreförbrukning Mätning
- För detta protokoll kommer vi att använda den extracellulära Flux Analyzer system från Seahorse Biosciences, som ett exempel. Coat önskad cellodlingsplatta med en lösning av 22,4 ^ g / ml av cell- och vävnads lim för 20 min vid RT. Skölj brunnarna med vatten 2 - 3 gånger före sådd cellerna.
- I slutet av behandlingen, skörd tumör sfärer med en 40 ìm cell sil, centrifugera cellerna vid 900 xg under 5 minuter och suspendera pelleten i 1 ml trypsin. Inkubera under 20 minuter vid 37 ° C.
- Tavla singularized celler i cellodlingsplatta vid en densitet av 30.000 celler / brunn under en 96-brunnsplatta (slutvolym: 150 ul). Resuspendera cellerna i Syreförbrukning analysmedium innehållande 8 mM glukos och 2 mM natriumpyruvat.
- Centrifugera cellerna till botten av brunnen genom spinncentrifugering av brunnarna tills 100 xg har nåtts och sedan låta centrifug stopp med broms av. Omvänd orientering av plattan och upprepa processen. Överför plattan till en 37 ° C inkubator utan tillsats av CO2 under 30 minuter.
- Under tiden, förbereda kassetten för analysen. Varje brunn har 4 olika injektorer att ladda (25 ul / port):
- Port A: metformin. För att erhålla en slutlig koncentration av 3 mM i brunnen, förbereda en 8x-lösning (24 mM) som den slutliga volymen blir 175il efter injektion av hamn A.
- Port B: metformin. För att lägga till 3 mM och få en slutlig koncentration av 6 mM i brunnen, förbereda en 9x lösning (27 mM) som den slutliga volymen blir 200 l efter injektion av hamn B.
- Port C: metformin. För att lägga till 3 mM och få en slutlig koncentration av 9 mM i brunnen, förbereda en 10x lösning (30 mM) som den slutliga volymen blir 225 pl efter injektion av hamn C.
- Port D: rotenon 11 pM, för erhållande av 1 pM som slutlig koncentration i brunnen (11x). Obs: rotenon hämmar fullständigt eventuellt kvarvarande mitokondriell aktivitet.
- Kalibrera kassetten och ladda cellodlingsplatta. Utföra analysen med standardprotokollet för blandning och mätning.
- Beräkna den procentuella hämningen av den totala mitokondriella andning uppnås genom metformin som den procentuella inhiberingen som erhålles med rotenon (satt som 100%).
4.Xenograftmodell för human pankreascancer i nedsatt immunförsvar möss
OBS: Beställ tillräckligt många kvinnliga atymiska nakna eller andra, mer immunförsvar musmodeller såsom NOD-SCID, SCID-Beige eller NSG för försöken 33. Autoklav alla kirurgiska instrument före experimentet och låt dem svalna till RT före användning. För subkutana tumörer använde vi ett minimum av 4 möss per tillstånd med en tumör per flank för totalt 8 tumörer.
- Xenograft Transplantation
- Förbered tumörstycken från humana pankreascancer vävnadsprover. Överför tumören i en petriskål och dissekera vävnaden i små bitar (2 mm i diameter, ~ 8 mm 3) med användning av en skalpell och pincett för att hålla vävnaden. Doppa de erhållna bitarna i geléform proteinblandning lösningen hölls på is.
- Söva möss med 1 - 3% isofluoran eller andra inhalativ eller injicerbara bedövningsmedel.
OBS: Innan alla kirurgiska procedure, se till att mössen helt har förlorat medvetandet genom att stimulera bukhuden eller bogserar med ett par splitter pincett. Applicera ögonsalva att förhindra torrhet. - När anestesi har trätt i kraft, torka baksidan av möss med etanolinnehållande hud antiseptisk. Administrera buprenorfin (0,05 mg / kg kroppsvikt) före kirurgi för att säkerställa postoperativ smärtlindring.
- Lyft tillbaka huden med pincett, gör en 0,7-1,0 cm långa snitt med sterila mikro sax och sedan rakt på sak förbereda en liten subkutan ficka, i vilken en del av patient härledd cancer i bukspottskörteln vävnad införas (~ 8 mm 3).
- Stänga såret med användning av 1 - 2 hudklamrar. Ta bort dem efter 7 dagar. Återgå mössen till sina burar och hålla dem på en värmedyna eller under en värmelampa tills de är helt aktiv igen.
- Efter tumörimplantation, övervaka mössen åtminstone två gånger i veckan med avseende på tumörtillväxt och allmänna tecken på uppkommer morbiditet såsom ruggig päls, hunched hållning, och orörlighet.
- När tumörer har nått en medelstorlek av 200 mm 3 möss randomiseras till respektive behandlingar. Administrera fordon eller metformin dagligen via ip injektioner (150 mg / kg kroppsvikt) eller via dricksvattnet (150 mg / kg kroppsvikt) med jämförbara behandlingseffekter.
- Övervaka tumörbörda med hjälp av en passare och beräkna tumörvolymen en gång i veckan (mätning av tumörvolym = 1/2 längd x andetag × bredd).
- Offra mössen när tumörerna har nått 1 cm i diameter eller möss börjar visa några tecken på svår smärta eller sjukdom som anges ovan.
Representative Results
Metformin Mål Selektivt Pankreas CSCs
Vi undersökte först de funktionella effekterna av metformin behandling på in vitro självförnyelse kapacitet CSCs. För detta ändamål genomförde vi sphere bildningsanalyser med användning av primära humana pankreatiska cancerceller isolerade från PDAC vävnader resekterade under operation. Vi observerade att metformin minskade kraftigt storleken av bildade sfärer (Figur 1A). Detta var troligen genom att hämma utbyggnaden av avkommor av CSC, som fortfarande utgör huvuddelen av celler som finns i områden som de är bara berikat för CSCs. I själva verket, de längre sfärer odlas utan passage mer omfattande utbyggnaden av mer differentierade avkommor kommer att bli. Därför fann vi metformin att avsevärt minska antalet sfärer faktiskt bildade oavsett storlek, som förekommer i en dosberoende sätt vilket tyder på en stark hämning av självförnyelse kapacitet CSC (data ej visade). Vi fann att metformin vid 3 mM minskade signifikant antalet sfärer bildas (Figur 1B). För att strängare studera de långsiktiga effekterna av metformin på självförnyelse kapacitet CSCs därefter passe vi bildade primära sfärer i sekundära och tertiära områden. Även om endast primära sfärer behandlades med metformin, var den laguppställning sfärer i den andra och tredje passagerna drastiskt och allt mindre, blandar metforminbehandling hade verkligen irreversibelt eliminerat merparten av CSCs (Figur 1C). Således, våra data visade signifikanta behandlingseffekter för metformin på självförnyelse kapacitet primära pankreas CSCs och därmed uppmuntrade oss att utföra ytterligare mekanistiska samt in vivo-studier.
Metformin Hämmar Mitochondrial syreförbrukning och Orsakar ROS produktion
Eftersom metformin visades för att fungera som en mitokondriell gift genom att delvis hämma komplex I-aktivitet, nästa undersökte vi de akuta effekterna av metformin på cellulär syreförbrukning i sfär-härledda celler. För detta ändamål har vi valt celler från två representativa primära PDAC tumörer och mätte syreförbrukningen över tiden efter sekventiell injektion av 3 mM metformin (tre injektioner) och 1 | iM rotenon (en injektion). Såsom visas i fig 2A, metformin injektion inducerade en snabb och dosberoende minskning i syreförbrukning, som varierade avsevärt mellan de olika tumörer. Vi beräknade restmitokondrie aktivitet vid metforminbehandling genom insprutning rotenon, en potent komplex I-inhibitor, som har förmåga att helt inhibera mitokondriell syreförbrukning. Känslighet för metformin i termer av mitokondrie syreförbrukning korrelerad med dess förmåga att inducera ROS produktion definieras som en förskjutning av medelvärdet av befolkning efter metforminbehandling (Figur 2B, till vänster), som lätt kan kvantifieras (Figur 2B, högra panelen). Som förväntat, de primära cellerna som var mest känsliga för inhibering av syrekonsumtion visade också den starkaste ökningen av ROS-produktionen vid metforminbehandling. Således är dessa metaboliska in vitro-experiment visar att metformin riktar CSCs genom att hämma deras beroende av mitokondriell funktion, vilket resulterar i en senare ökning av mitokondrie ROS-produktionen och eventuellt induktion av apoptos.
Metformin Parkett PDAC Progression in vivo
Vi studerade slutligen effekterna av metformin in vivo med hjälp av vävnads xenotransplantat härledda från olika patienter med PDAC. Vi observerade en signifikant minskning av tumörprogression för metformin-behandlade möss jämfört med kontrollgruppen, men tumörerna aldrig helt disappeared (Figur 3). Därefter under långtidsuppföljnings alla tumörer så småningom återfall tyder metformin motstånd av celler som överlever den tidiga fasen av behandlingen. Ändå metforminbehandling, även när de appliceras som monoterapi, signifikant förlängd överlevnad i alla möss.
Figur 1. Metformin selektivt inriktar sig på CSCs. (A) Metformin minskade storleken av sfärer. Representativa bilder av sfärer som erhölls efter behandlingen med de angivna doserna av metformin i 7 dagar (höger panel). Kvantifiering av sfär storlek (n≥6) (till vänster), de angivna siffrorna i abskissan axeln representerar individuell tumör. (B) Sphere bildande kapacitet i närvaro eller frånvaro av metformin i 7 dagar (n≥6), de angivna siffrorna i abskissanaxeln representerar enskild tumör. (C) representant diagram över CSC självförnyelse kapacitet i sekundära och tertiära områden primära pankreascancerceller. Sfärerna endast behandlas under första generationen sfär formation för totalt 7 dagar (n = 6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Metformin hämmar syreförbrukning och inducerar ROS produktion. (A) Metformin Dessutom hämmar syreförbrukning (OCR) av sfär härledda celler. Två olika PDAC sekundära sfärer behandlades med metformin och OCR förändringar mättes genom extracellulärt flödesanalys. Rotenon injektion användes som en kontroll för total mitokondriell OCR konsumtion.X-axeln representerar syreförbrukningshastigheten i pmol syre / timme normaliserad med proteininnehållet i varje brunn. (B) PDAC sfärer som används i A behandlades under 8 h med metformin och ROS-produktionen bestämdes genom flödescytometri med användning av karboxi-DCFDA. Vänster, representativ flödescytometri tomter. Höger, sammanställning av data från tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Metformin Parkett PDAC Progression in vivo. Två olika PDAC xenograft vävnader implanterades i nedsatt immunförsvar möss och behandling tilldelades efter initial tumör ta kontrollerades. Möss behandlades med metformin (Met) sattes till dricksvattnet (150 mg / kg kroppsvikt weiGHT; baserat på 5 ml vattenförbrukning per dag). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Med framväxten och efterföljande validering av CSC koncept för många tumörer, har området läkemedelsutveckling fått ny fart, med potential för att utveckla mer effektiva cancerbehandlingar och därefter minska risken för återfall. Dock är CSC fältet fortfarande i ett tidigt skede och mer måste uppnås när det gäller förståelsen CSC ursprung och utbredning, och deras roll i att forma tumör arkitektur och främja metastaser.
I detta sammanhang bör användningen av reproducerbara och meningsfulla CSC analyser samt informerade tolkning av erhållna data representerar en viktig komponent för att öka kunskaperna om CSC biologi. Från många biologiska perspektiv har sfär bildning vuxit fram som en mycket värdefull analys; ändå användare bör vara medveten om sina begränsningar för att korrekt tolka sina experimentella resultat. En viktig aspekt att beakta även innan utvärderingen av sfären formationsuppgifter är ursprunget till den undersökta provet, eftersom de resultat som erhållits från färska patientgenererade prover kan vara betydligt annorlunda än de som erhålls från etablerade cancercellinjer.
Klassiska sphere bildnings analyser innefattar ympning celler vid klonal densitet i ultralåg-fastsättningsplattor och utvärdera sfär bildning i närvaro av epidermal tillväxtfaktor (EGF) och / eller basisk fibroblasttillväxtfaktor (b-FGF) anrikad, men serumfritt medium 21, 34. Odlingsmediet sammansättning är också en viktig fråga att överväga. Enligt vår erfarenhet visade det sig att den DMEM / F12 kompletterat med B27, bFGF och glutamin i frånvaro av serum var ett optimalt medium för att växa, utvidga och bibehålla CSC i odifferentierade tillstånd. Vi fann att i denna kultur skick (medium och hjulupphängningen) cellerna uttrycker höga halter av cancerstamcellsmarkörer (inklusive CD133 +, CD44 + och CD24 +) och inte uttrycker differentieringsassocierade proteiner (CK-20 Och CK-19).
En av de grundläggande antaganden för dessa analyser är att varje sfär är klonal, dvs resultatet en sfär från utbyggnaden av en enda stamcell. Emellertid sfärer är inneboende dynamiska strukturer som är benägna att smälta även vid låg såddtäthet 35. Bordläggningen celler är ett kritiskt steg i protokollet och densiteten av en cell / brunn kan säkert kringgå aggregering frågan. Men även för prospektivt sorterade progenitorer regelbundet resulterar detta i mycket låga sfär bildning på grund av låg inre sfär bildning aktivitet och kan också tillskrivas begränsad autokrin stimulering på grund av utspädningseffekter. Enligt vår erfarenhet observerade vi att endast 30% av celler pläterade kan bilda sfärer. Vi rekommenderar att du använder åtminstone 100 celler / brunn för att få konsekventa och reproducerbara resultat.
Andra odlingsmetoder för tillväxt CSC är baserade på fasta eller halvfasta 3D kulturer (t.ex., baserat på matrigel, kollagen eller metylcellulosa). Dessa metoder har använts för att begränsa cellrörlighet och efterföljande cellaggregation 36. Var och en av dessa matriser bär sina egna begränsningar. Till exempel är matrigel en löslig basalmembran isoleras från Engelbreth-Holm-Swan (EHS) tumör och även om extrakt liknar den komplexa extracellulära tumörmiljön som finns i många vävnader, gör den innehålla flera mer eller mindre specifika tillväxtfaktorer som ofta gör mekanistisk studier för specifika regulatoriska element mycket svårt. En annan plats av övervägande är att sfärbildande förmåga och stamcells funktioner är inte utbytbara termer 34. Medan vissa stam- och stamfaderceller har visats uppvisa sfär bildande förmåga 37, fel att generera sfärer in vitro utesluter inte in vivo-stam / stamfaderfunktion. Exempelvis kan inaktiva stamceller helt enkelt inte svarar på de extracellulära signaler som tillhandahålls avvald in vitro odlingsbetingelser. Således långsiktig in vitro och in vivo självförnyelse kapacitet renade cellpopulationer, företrädesvis under seriepassage, skall bedömas för att bevisa eller motbevisa stamcellsfunktion. I detta sammanhang är förmågan att prospektivt och samtidigt propagera olika populationer av stam- och progenitorceller en viktig aspekt av sfären bildande analysen och gör denna analys mycket värdefull för CSC fältet; så länge som dess begränsningar hålls i åtanke för tolkning av de erhållna data.
Sphere bildande analyser har använts i stor utsträckning för att i efterhand identifiera stamceller baserat på deras förmåga att självförnyelse och differentiering på enskild cellnivå in vitro. Upptäckten av markörer som gör den blivande isolering av stamceller och deras avkomma från sin in vivo nisch kan de funktionella egenskaperna hos renade populationer som skall fastställas. Combination av sfär bildningsanalys och FACS är en framgångsrik strategi för att isolera celler från fast vävnad eller berika specifika subpopulationer av PDAC i kultur. Till exempel definierar samtidigt uttryck av EpCAM, CD24 och CD44 en subpopulation av CSCs kunna: självförnyelse, differentiera och initiera en tumör, vilket återspeglar heterogenitet den ursprungliga tumören. Hermann et al., visade att CD133 + celler hade förstärkt fortplantningsförmågan och CSC har 15. Andra markörer har också använts för karakterisering av CSCs: ALDH- 1 (aldehyddehydrogenas-1) uttryck associeras med mycket tumorigena celler i pankreascancer 38; celler som kan utesluta DNA färgämnet Hoechst 33342, som heter sido befolkning (SP) celler, har bevisade förmåga att initiera tumörer 39. Nyligen visade att en subcellulär autofluorescens fack kännetecknar en distinkt population av humana celler med exklusiva CSC egenskaper på olika tumörtyper40. Även om ingen av dessa markörer verkar selektivt karakterisera en ren population av CSCs, mer och mer komplexa kombinationer av markörer måste användas till FACS rena mer förfinade populationer av celler.
Många frågor kvarstår om den exakta roll CSCs i ursprung, progression och läkemedelsresistens av tumörer. Till exempel, ett sätt att ta itu med frågan om klonal evolution att definiera om och hur en enda CSC initierar en tumör, skulle kunna vara att analysera patientprover i olika skeden av sjukdomen, och särskilt följa antalet CSCs under och efter behandlingen. Genom att svara på dessa frågor, kan vi göra meningsfulla framsteg i vår kunskap om CSCs i solida tumörer och utveckla läkemedelsbehandlingar för att slutligen förebygga tumörprogression och återfall.
Disclosures
Författarna har ingen konkurrerande intresse att lämna ut.
Acknowledgments
Den nuvarande forskning stöds av en ERC Advanced Investigator Grant (Pa-CSC 233.460), Europeiska gemenskapens sjunde ramprogram (FP7 / 2007-2013) enligt bidragsavtal nr 256.974 (EPC-TM-NET) och nr 602.783 (CAM-PAC ), varvid Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación, Fondo de Investigación Sanitaria (PS09 / 02129 & PI12 / 02643), och Prog Nacional de Internacionalización de la I + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien). E. Lonardo stöddes av Roche Fellowship. M. Cioffi stöddes av La Caixa Predoctoral Fellowship Programme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Counting Chamber/Hemocytometer | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| CASY Cell Counter and Analyzer for proliferation and viability measurement | Roche Innovatis | AG CASY Model TTC 45,60,150 μm | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyi Co | 130-093-235 | |
| GentleMACS C Tubes | Miltenyi Co | 130-093-237 | |
| 24-well Ultra-low Attachment Plates | Corning | 3474 | |
| 100-mm tissue culture dishes | BD Falcon | 353803 | |
| Cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| 15-ml polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 50-ml polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
| 1.5 ml sterile tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| Sterile petri dishes, 10 cm dishes | Corning | 353003 | |
| 26 G needles | BD Falcon | 300600 | |
| 100 ul Hamilton Syringe | Hamilton Syringe Co | 81075 | |
| Collagenase type IV | Stem Cell Technologies | 7909 | |
| RPMI Medium 1640 | Life technologies | 11875-085 | |
| Penicillin/Streptomycin solution, 100X | Life technologies | SV30010 | |
| Metformin | Sigma | D150959-5G | |
| L-glutamine, 200 mM, 100X | Life technologies | 25030-081 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| 100mM Sodium Pyruvate solution | Life technologies | 11360-070 | |
| Seahorse Assay medium | Seahorse Bioscience | 100965-000 | |
| BD Cell-TAK Cell and Tissue adhesive | BD Biosciences | 354240 | |
| Trypsin solution, 0.05% | Life technologies | 25300054 | |
| B27 Supplement 50x | Life technologies | 17504-044 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Sigma | F0291 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9576 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12 | Sigma | D8437 | |
| Sterile 1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Trypan Blue | Life technologies | 15250-061 | |
| Carboxy-DCFDA(5-(and-6)-Carboxy-2',7'-DichlorofluoresceinDiacetate) | Life technologies | C-369 | |
| Rotenone | Sigma | R8875 | |
| Ethanol 70% (vol/vol) | Sigma | 459844 | |
| Isofluorane | IsoVet, Braun | 571105.8 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 35620 | |
| Sterile Cotton tipped applicator | Puritan medical | ||
| XF96e FluxPak with cell plates, calibrant and cartridges | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
| XF96e Extracellular Flux analyzer | Seahorse Bioscience | ||
| Incubator with CO2 input | |||
| Micro scissors | |||
| Curved forceps | |||
| Splinter forceps | |||
| Caliper |
References
- Whipple, C. A., Young, A. L., Korc, M. A KrasG12D-driven genetic mouse model of pancreatic cancer requires glypican-1 for efficient proliferation and angiogenesis. Oncogene. 31 (20), 2535-2544 (2012).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4 (11), 1649-1652 (2009).
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Res. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 62 (1), 10-29 (2012).
- Burris, H. A. 3rd, et al. Improvements in survival and clinical benefit with gemcitabine as first-line therapy for patients with advanced pancreas cancer: a randomized trial. J Clin Oncol. 15 (6), 2403-2413 (1997).
- Moore, M. J., et al. Erlotinib plus gemcitabine compared with gemcitabine alone in patients with advanced pancreatic cancer: a phase III trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group. J Clin Oncol. 25 (15), 1960-1966 (2007).
- Cunningham, D., et al. Phase III randomized comparison of gemcitabine versus gemcitabine plus capecitabine in patients with advanced pancreatic cancer. J Clin Oncol. 27 (33), 5513-5518 (2009).
- Von Hoff, D. D., et al. Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine. N Engl J Med. 369 (18), 1691-1703 (2013).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer. N Engl J Med. 364 (19), 1817-1825 (2011).
- Gourgou-Bourgade, S., et al. Impact of FOLFIRINOX compared with gemcitabine on quality of life in patients with metastatic pancreatic cancer: results from the PRODIGE 4/ACCORD 11 randomized trial. J Clin Oncol. 31 (1), 23-29 (2013).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Garcia-Silva, S., Frias-Aldeguer, J., Heeschen, C. Stem cells & pancreatic cancer. Pancreatology. 13 (2), 110-113 (2013).
- Hermann, P. C., Mueller, M. T., Heeschen, C. Pancreatic cancer stem cells--insights and perspectives. Expert Opin Biol Ther. 9 (10), 1271-1278 (2009).
- Hermann, P. C., Huber, S. L., Heeschen, C. Metastatic cancer stem cells: a new target for anti-cancer therapy. Cell Cycle. 7 (2), 188-193 (2008).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Li, C., et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Res. 67 (3), 1030-1037 (2007).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).
- Gallmeier, E., et al. Inhibition of ataxia telangiectasia- and Rad3-related function abrogates the in vitro and in vivo tumorigenicity of human colon cancer cells through depletion of the CD133(+) tumor-initiating cell fraction. Stem Cells. 29 (3), 418-429 (2011).
- Hermann, P. C., Bhaskar, S., Cioffi, M., Heeschen, C. Cancer stem cells in solid tumors. Semin Cancer Biol. 20 (2), 77-84 (2010).
- Mueller, M. T., et al. Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer. Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).
- Lonardo, E., et al. Nodal/Activin signaling drives self-renewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy. Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).
- Li, C., et al. c-Met is a marker of pancreatic cancer stem cells and therapeutic target. Gastroenterology. 141 (6), 2218-2227 (2011).
- Chen, J., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
- Schepers, A. G., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337 (6095), 730-735 (2012).
- Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. Defining the mode of tumour growth by clonal analysis. Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).
- Shaw, R. J., et al. The kinase LKB1 mediates glucose homeostasis in liver and therapeutic effects of metformin. Science. 310 (5754), 1642-1646 (2005).
- Martin-Castillo, B., Vazquez-Martin, A., Oliveras-Ferraros, C., Menendez, J. A. Metformin and cancer: doses, mechanisms and the dandelion and hormetic phenomena. Cell Cycle. 9 (6), 1057-1064 (2010).
- Honjo, S., et al. Metformin sensitizes chemotherapy by targeting cancer stem cells and the mTOR pathway in esophageal cancer. Int J Oncol. 45 (2), 567-574 (2014).
- Wurth, R., et al. Metformin selectively affects human glioblastoma tumor-initiating cell viability: A role for metformin-induced inhibition of Akt. Cell Cycle. 12 (1), 145-156 (2013).
- Cufi, S., et al. Metformin-induced preferential killing of breast cancer initiating CD44+CD24-/low cells is sufficient to overcome primary resistance to trastuzumab in HER2+ human breast cancer xenografts. Oncotarget. 3 (4), 395-398 (2012).
- Lonardo, E., et al. Metformin targets the metabolic achilles heel of human pancreatic cancer stem cells. PLoS One. 8 (10), e76518 (2013).
- Gu, Y., et al. The effect of B27 supplement on promoting in vitro propagation of Her2/neu-transformed mammary tumorspheres. J Biotech Res. 3, 7-11 (2011).
- Ishizawa, K., et al. Tumor-initiating cells are rare in many human tumors. Cell Stem Cell. 7 (3), 279-282 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3 (10), 801-806 (2006).
- Lawson, D. A., Xin, L., Lukacs, R. U., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation and functional characterization of murine prostate stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (1), 181-186 (2007).
- Seaberg, R. M., van der Kooy, D. Adult rodent neurogenic regions: the ventricular subependyma contains neural stem cells, but the dentate gyrus contains restricted progenitors. J Neurosci. 22 (5), 1784-1793 (2002).
- Jimeno, A., et al. A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development. Mol Cancer Ther. 8 (2), 310-314 (2009).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct 'side population' of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Miranda-Lorenzo, I., et al. Intracellular autofluorescence: a biomarker for epithelial cancer stem cells. Nat Methods. 11 (11), 1161-1169 (2014).
