Introduction
توليد ذاكرة مناعية في غياب المرض هو الأساس الفسيولوجي للتطعيم فعال 1. في الآونة الأخيرة، كشفت أنظمة النهج القائم على الأحياء أن اللقاحات الناجحة مثل لقاح الحمى الصفراء، لحث على تحريض قوي من الاستجابات المناعية الفطرية وتفعيل عدة مجموعات فرعية من الخلايا الجذعية (DCS)، والذي بدوره يؤدي إلى multilineage تفعيل antigen- خلايا T معينة 2،3. منذ البلدان النامية هي السكان الخلايا المناعية الوحيد مع القدرة على تنشيط خلايا T ساذجة مستضد معين 4، ودراسة وظيفتها خلال التطعيم أمر بالغ الأهمية لفهم الاستجابات المناعية للقاحات وتصميم الاستراتيجيات المستقبلية ضد مسببات الأمراض الصعبة.
ومن شأن نظام يسمح بتعقب مجموعات فرعية البلدان النامية مختلفة خلال الاستجابات المناعية للقاحات يكون مرغوبا فيه من أجل إنشاء حركية دقيقة من العاصمة الهجرة إلى الأنسجة اللمفاوية، وبالتالي توفيرنظرة ثاقبة الآليات الفسيولوجية المسؤولة عن بدء محدد اللقاح مناعة التكيفية. علم الوراثة العكسية القائم على النهج توفر إمكانية لتوليد المعدلة واللقاحات الحية الموهنة التي يمكن استخدامها تجريبيا مع هذا الغرض. منذ تنفيذه على البحث الإنفلونزا، واستخدمت على نطاق واسع الوراثة العكسية القائم على البلازميد لتوليد سلالات الأنفلونزا المؤتلف بما في ذلك LAIVs. بروتوكولات موحدة لانقاذ فيروسات الأنفلونزا المؤتلف تتطلب متعددة ترنسفكأيشن خطوط transfectable غاية الخلية مع البلازميدات ambisense (المنتجة على حد سواء الإيجابية والسلبية RNA معنى) التي تحتوي على شرائح الفيروسية ثمانية الأنفلونزا وكذلك التضخيم في نظام متساهل مثل مدين، داربي الكلى الكلاب ( MDCK) الخلايا و / أو الدجاج المحتوي البيض 5. ومع ذلك، فإن تطبيق علم الوراثة العكسية لتوليد الأدوات الجزيئية لدراسة الآليات المناعية للقاح لا تزال غير مستكشفة.
الجيلمن نماذج الماوس جديدة تسمح نضوب معين من مجموعات فرعية الخلايا المناعية، بما في ذلك البلدان النامية، وفتحت آفاقا جديدة لفهم الآليات المناعية الأساسية الكامنة وراء حماية أثار اللقاح. وكشفت المقارنة بين وظائف فرعية DC لدى الفئران والبشر ذلك، إلى حد كبير، والماوس والبلدان النامية الإنسان وظيفيا مثلي 6،7، هذه النتائج، بقوة توحي بأن تطوير نماذج الماوس تسمح نضوب معين من البلدان النامية في حالة مستقرة وخلال حالات الالتهابات، قد تساعد على فهم علم وظائف الأعضاء من ردود DC في البشر. في السنوات الأخيرة تم إنشاء عدد من نماذج الماوس تحمل الجينات المحورة التعبير عن القردي ذيفان الخناق (DT) مستقبلات (DTR) تحت سيطرة منطقة المروج من الجينات في المصالح 8،9. منذ الأنسجة الماوس لا تعبر بطبيعة الحال DTR، وهذه النماذج تسمح استنزاف المشروط لمجموعات فرعية الخلايا التي تحمل الجينات المستهدفة من الفائدة على التلقيح الفأر مع DT. وبالتالي، عبيلي لديناتي واي لاستنزاف البلدان النامية المحددة والكريات البيض الأخرى في الجسم الحي أثناء العمليات الفسيولوجية، قد تعززت بشكل كبير من خلال تطوير ريال عماني على أساس DTR. ومع ذلك، في حين تم استخدام هذه نماذج الماوس المعدلة وراثيا على نطاق واسع لفهم تطور الجنين من الجهاز المناعي، وتطبيقها على تطوير لقاح تم اختبار نادرا. هنا، من خلال الجمع بين الانفلونزا الوراثة العكسية وتنافسية الوهم نخاع العظام أساس DTR، نقترح طريقة لدراسة حركية مناعة لقاح فضلا عن وظيفة الجينات الفردية خلال الاستجابات المناعية للقاحات في الجسم الحي. تطبيق هذه التقنية لتقييم ما قبل السريرية لقاحات جديدة ضد الأمراض المعدية الصعبة يمكن أن تساعد في ترشيد تصميم لقاح واختبار لقاحات مرشحة في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت التجارب على الحيوانات وفقا لبروتوكولات المعتمدة وفقا للمبادئ التوجيهية للقانون الألماني لحماية الحيوان. جميع الموظفين الذين ينفذون التجارب على الحيوانات مرت برامج التدريب وفقا للفئة B أو C للاتحاد الأوروبي مختبر الحيوان جمعيات العلوم.
1. توليد المؤتلف لايف الموهن لقاحات الأنفلونزا من خلال علم الوراثة العكسية
ملاحظة: بروتوكول مفصلة لتوليد المؤتلف فيروسات الأنفلونزا التي كتبها الوراثة العكسية وقد وصفت من قبل دراسات سابقة 5 وخارج نطاق هذا التقرير. لفترة وجيزة، ويتم انقاذ لقاحات الأنفلونزا الباردة تكييفها (الخيالة) في السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية مجلس الوزراء تحت مستوى السلامة الحيوية 2 (BSL2) الاحتواء، ويتضمن الخطوات المفصلة أدناه. بروتوكول ترنسفكأيشن والعدوى يترتب على ذلك من مارتينيز Sobrido وآخرون. 5.
- توليد انفلونزا الباردة تكييفها متفارزاللقاح باستخدام كخلفية للالباردة تكييفها سلالة A / آن آربور / 6/60 (H2N2)، وكذلك هيماغلوتينين (HA) والنورامينيداز المعدلة (NA) من A / PR / 8/34 (H1N1) سلالة ( الشكل 1A). تعديل في الجينات NA يتكون من بديل PCR القائم من سلسلة المحفوظة في ساق البروتين (بقايا 65-72) من خلال تسلسل [كدنا قصيرة ترميز ألبومين البيض الدجاج (OVA) الببتيد -derived SIINFEKL (الشكل 1B). الببتيد SIINFEKL هو الببتيد سائد مناعيا للغاية في سياق H-2B الدرجة MHC I المقيدة رد C57BL / 6 الفئران 12.
- لوحة 10 6 293T الخلايا لكل بئر في 6 لوحات جيدة باستخدام DMEM 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) تستكمل مع 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (P / E).
- إعداد البلازميد خليط ترنسفكأيشن: إضافة 1 ميكروغرام من كل واحد من البلازميدات ترميز cDNAs لPB2، PB1، PA، NP، M، NS من الأنفلونزا A / آن آربور / 6/60 سلالة و1 ميكروغرام من البلازميدات ترميز لNA -SIINFEKL وHA من إنفلونزا A / PR / 8/34. إضافة قبل تحسنت OptiMEM (15 ميكرولتر عن الحجم النهائي من 100 ميكرولتر / جيد).
- احتضان مزيج ترنسفكأيشن لمدة 30 دقيقة في RT.
- إضافة 100 ميكرولتر من مزيج ترنسفكأيشن / جيد واحتضان لمدة 16 ساعة على 37 درجة مئوية و CO 2 5٪.
- تغيير وسائل الاعلام الخلية DMEM 0.3٪ BSA 1٪ P / E عند 33 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 5 ساعة.
- إضافة 10 6 أنفلونزا خلايا MDCK متساهلة في DMSO التي تحتوي على 1 ميكروغرام / مل من التربسين من البنكرياس البقري تعامل مع L-1-Tosylamide-2-الفنيل كيتون كلورو (TPCK-التربسين). الحفاظ على 293T-MDCK المشترك الثقافات ل2-3 أيام في 33 ° C وCO 2 5٪.
- جمع supernatants من MDCK-293T خلية المشترك الثقافات واضحة عن طريق الطرد المركزي في 260 x ج لمدة 5 دقائق.
- تطعيم 9 - الدجاج القديم اليوم 10 البيض المحتوي في ظروف معقمة. للقيام بذلك، وجعل ثقب في الجزء العلوي من قشر البيض كما أشار مارتينيز Sobrido وآخرون. 5.
- تغطية خفة دم قشر البيضح ذاب الشمع باستخدام قطعة من القطن واحتضان بيض الدجاج تلقيح لمدة 3 أيام في 33 ° C.
- حصاد السوائل السقاء من البيض المحتوي المصابة: غسل قشر البيض مع الايثانول 70٪. فتح البيض مع الكراك بلطف شديد في الجزء العلوي وإزالة غشاء السقاء باستخدام ملقط معقم. استخدام ماصة 10 مل لجمع أكبر قدر من السائل ممكن (عادة 6-10 مل). أجهزة الطرد المركزي في 260 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية، ونقل السائل مسح سقائية إلى أنابيب جديدة.
الحصانة 2. تتبع لقاح محددة
- البحث عن المفقودين من الخلايا الجذعية التي تحمل الببتيد (DCS)
- للتطعيم الماوس، تخدير الفئران مع 5٪ الأيزوفلورين في الأكسجين باستخدام المرذاذ الدقة. استخدام ماصة 200 ميكرولتر لإدارة 50 ميكرولتر من PBS تحتوي على 10 3 وحدات لتشكيل لوحة (PFU) من لقاح التعبير عن الببتيد SIINFEKL عبر قطرات مباشرة إلى الخياشيم الماوس.
- ثلاثة أيام بعد التطعيم، euthanizالبريد الفئران عن طريق التخدير الأيزوفلورين تليها خلع عنق الرحم.
- رفع الجلد الماوس في خط الوسط أسفل القفص الصدري مع ملقط وقطع شق صغير من خلال الجلد مع مقص. من وجهة شق، وجعل 3-5 سم قطع طويلة من خلال الجلد تجاه كل من الرأس والذيل، ثم اثنين 2 شقوق سم من خط الوسط أفقيا من كل طرف. قم بتقشير الجلد للكشف عن تجاويف البريتوني والصدر. قطع بعناية من خلال الأغشية المحيطة البريتوني لفضح القفص الصدري.
- للوصول إلى المنصف قطع diafragma والجزء السفلي من القفص الصدري. العثور على وإزالة العقد اللمفاوية المنصفية 2 (mLNs)، الظهرية قليلا والمتاخمة أفقيا إلى الغدة الصعترية، المتاخمة إعلامي إلى الشريان العضدي الرأسي، بالقرب من الجانب البطني من القصبة الهوائية.
- لحصاد mLNs استخدام ملقط منحنية. وضع ملقط تحت الغدد الليمفاوية، وسحب عليها بلطف. وضع الغدد الليمفاوية في لوحة 6 جيدا تحتوي على 1 مل من DMEM وإزالة أي connectiهاء أو الأنسجة الدهنية المحيطة العقدة.
- ندف كل عينة بدقة مع اثنين من الإبر 26 G تعلق على 1 مل الحقن. لندف العقدة الليمفاوية، لأنه عقد لأسفل مع إبرة واحدة بينما كسر فتح العقدة الليمفاوية مع الإبرة الأخرى. عندما يتم ذلك بشكل صحيح، وخلايا تتركز انفجار من العقدة الليمفاوية يتم ملاحظتها بسهولة في وسائل الإعلام. تمر جميع المواد الأنسجة من خلال مرشح النايلون 70 ميكرون للحصول على تعليق خلية واحدة.
- الطرد المركزي تعليق خلية واحدة لمدة 10 دقيقة في 260 x ج في أجهزة الطرد المركزي المبردة. resuspend الكرية خلية في 2 مل من خلايا الدم الحمراء الناشر (RBCL) العازلة للليز خلايا الدم الحمراء. تسمح تحلل المضي قدما لمدة 3 دقائق على RT.
- تحييد العازلة RBCL عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا في 2 مل من PBS الجليد الباردة.
- لوحة الخلايا في U على شكل لوحات 96-جيدا بتركيز 10 7 خلية / مل في الحجم النهائي من 100 ميكرولتر.
- لتحليل التدفق الخلوي، الخلية كتلة FC-مستقبلات باستخدام1 ميكروغرام من الأجسام المضادة CD16 / CD32-الماوس المضادة في 10 6 خلايا لمدة 15 دقيقة على الجليد.
- لوحات أجهزة الطرد المركزي وتجاهل supernatants بواسطة لوحة عبها. احتضان الآبار الفردية مع مزيج الأجسام المضادة السطحية في الاختيار. عادة للكشف عن الخلايا الجذعية في الغدد الليمفاوية، ينبغي للكوكتيل الأجسام المضادة تشمل: 0.25 ميكروغرام من مكافحة CD11c و، 0.25 ميكروغرام من CD11b، و 0.5 ميكروغرام من الدرجة MHC II، 0.25 ميكروغرام من CD103 و 0.15 ميكروغرام من CD8α في الحجم النهائي من 100 ميكرولتر.
- لالنابضة السلبي، إضافة 0،25 ميكروغرام من مكافحة CD3، CD19، NK1.1 أو النسب كوكتيل (الشكل 2A). استراتيجيات النابضة البديلة وكذلك بروتوكولات للحصول على تعويض مناسب من الأصباغ الفلورية متعددة ويمكن الاطلاع على الموقع الإلكتروني لمشروع الجينوم المناعية. بالإضافة إلى علامات سطح الاختيار، إضافة 1 ميكروغرام من الأجسام المضادة ضد H-2K ب بد أن SIINFEKL إلى كوكتيل. وهذه الأجسام المضادة متاح تجاريا يسمح التصور من البلدان النامية طن الذي لا بد الببتيد SIINFEKL على السطح الطبقة MHC I.
- احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة السطحية لمدة 30 دقيقة على الجليد. حماية لوحة من الضوء. لوحات أجهزة الطرد المركزي في 260 x ج لمدة 5 دقائق ويغسل مع 2 مل من برنامج تلفزيوني مرتين. نقل الخلايا إلى التدفق الخلوي أنابيب للتحليل.
- تقييم لقاح محددة انتشار الخلايا التائية
- الحصول على خلايا T المانحة من المتاحة تجاريا الفئران TCR المعدلة وراثيا (الفئران OT-I) (C57BL / 6-TG (TCR aTcrb) 1100Mjb / J) فيه جميع الخلايا CD8 T ولدت هي محددة لالببتيد SIINFEKL. الموت ببطء الفئران عن طريق التخدير الأيزوفلورين تليها خلع عنق الرحم. حصاد الطحال عن طريق إجراء شق في تجويف البطن. وضع الطحال / ثانية في 2 مل من DMEM / الطحال وإزالة النسيج الضام والدهون.
- توليد تعليق خلية واحدة من الطحال بعد الإجراء الموضح في 2.1.2 و2.1.3.
- لمزيد من إثراء تعليق خلية واحدة على خلايا T، وتطبيق بروتوكولات فصل حبة المغناطيسيباستخدام الإجراءات الإيجابية أو السلبية اختيار 12. التفريق المانحة من خلايا المتلقي، استخدم الفئران مسانج بحيث على سبيل المثال الفئران المتلقي تعبر عن CD45.1 الكريات البيض علامة في حين أن الخلايا T المانحة تعبر عن CD45.2 12.
- لتسمية الخلايا T، احتضان لهم في 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 5 ميكرومتر من carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) في كثافة الخلية المثلى لل5 × 10 6 خلية / مل. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة عند 37 ° C محميا من التعرض للضوء. بعد الحضانة، والخلايا الطرد المركزي في 260 x ج لمدة 5 دقائق، طاف نبذ، والخلايا resuspend في 3 مل مصل بقري جنيني (FBS) لتحييد CFSE.
- خلايا الطرد المركزي في 260 x ج لمدة 10 دقيقة و resuspend في حجم كاف من PBS بحيث 100 ميكرولتر من محلول يحتوي على 2 × 10 6 خلايا. يبث المتلقي الفئران مسانج مع 2 × 10 6 خلية / الماوس عبر الرجعية المدارية الجيوب الأنفية حقن 13.
- الموت ببطء الفئران المتلقي في أيام 3 و 4 و 5 لما بعدالتطعيم باستخدام التخدير الأيزوفلورين تليها خلع عنق الرحم. حصاد العقد اللمفاوية المنصفية وإعداد تعليق خلية واحدة لالتدفق الخلوي كما هو مبين في 2.1.2-2.1.5.
- تحديد الخلايا المانحة التي تلطيخ تعليق خلية واحدة في 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة التي تحتوي على: 0.25 ميكروغرام من مكافحة فأر CD3، CD4 و CD8 الأجسام المضادة. 0.5 ميكروغرام من مكافحة فأر CD45.1 أو الأجسام المضادة CD45.2 (اعتمادا على النمط الظاهري من الخلايا المانحة). ترك القناة FL-1 من قياس التدفق الخلوي مفتوح (FITC) لتحديد الملف الشخصى تخفيف CFSE 12 (الشكل 2B).
3. الفئران خيالية لتشريح الردود قاح الجينات المحددة
ملاحظة: جيل من تنافسية الوهم نخاع العظام باستخدام نماذج الماوس على أساس DTR-يسمح للتمييز من وظائف خلايا معينة خلال الاستجابة المناعية للقاحات. نحن هنا تظهر استراتيجية إضافية التي مزيج من DTR، معربا عن المانحة جملتعلمي اللغة اإلنكليزية مع الخلايا من الفئران تصاريح خروج المغلوب لدراسة وظائف محددة الجينات خلال الحصانة في أماكن معينة من الخلايا. في المثال نحن توليد الفئران مع حذف المحدد لمثل عدد مستقبلات 3 (TLR3) في Langerin + CD103 + البلدان النامية.
- إعداد الخلايا المانحة نخاع العظم
- العمل في إطار مجلس الوزراء مستوى السلامة الحيوية II. تجنب التلوث من خلال استخدام الأدوات تعقيمها بشكل حصري.
- لتوليد نخاع العظام الفئران خيالية، استخدم CD45.1 مسانج + C57BL / 6 إناث الفئران كمتلقين، واستخدام TLR3 - / -، Langerin-DTR / EGFP، أو الفئران WT يعبرون عن CD45.2 + الجهات المانحة. باستخدام مسانج الفئران المانحة والمتلقية يسمح للتمايز الخلايا المانحة والمتلقية عن طريق التدفق الخلوي وهذا يسمح engraftment التي يتم تقييمها.
- للحصول على خلايا نخاع العظام المانحة، الموت ببطء الفئران المانحة مع تخدير الأيزوفلورين تليها خلع عنق الرحم. مع مقص حاد تؤدي الشقوق حول الكاحل بحيث ميتعرض الجهاز العضلي [أوس].
- باستخدام الملقط حادة سحب الجلد الماوس والفراء بلطف من الكاحل نحو الوركين بحيث عضلات الساق واضحة.
- مع مقص حاد قطع الساقين الماوس في ذروة الوركين وفوق رأس عظم الفخذ.
- وضع الساقين على طبق بتري وعلى الجليد. العمل بسرعة وإزالة جميع العضلات لفضح العظام.
- عظام الفخذ منفصلة والظنبوب. وضع العظام في محلول من الايثانول 70٪ لمدة 5 دقائق لإزالة البكتيريا الممكنة ووضعها مباشرة على طبق بتري أخرى تحتوي على 5 مل من مصل خالية DMEM. قطع العظام ينتهي باستخدام مقص حاد وتدفق نخاع العظام في DMEM. للقيام بذلك، دافق 1 مل من DMEM في العظام عن طريق إدخال إبرة 26 G تعلق على حقنة 5 مل. تأكد من أن تبدو عظام بيضاء (فارغ) بعد التنظيف.
- جمع كل خلايا نخاع العظام من الفئران المانحة في 10 مل من DMEM. توليد تعليق خلية واحدة من خلايا نخاع العظام عن طريق تمرير الحصاد من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر.
- CLالأذن وحيدة الخلية تعليق من خلايا نخاع العظام بواسطة الطرد المركزي في 260 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المبردة. بيليه الخلية resuspend في 10 مل من برنامج تلفزيوني. تستنفد خلايا الدم الحمراء باستخدام محلول RBCL كما هو موضح في 2.1.3 و2.1.4.
- عد خلايا نخاع العظام باستخدام عدادة الكريات أو عداد خلية الآلي. تقييم بقاء الخلية التي كتبها تحديد الخلايا الميتة عن طريق التريبان تلطيخ الأزرق 13. على النحو الأمثل، واحد غلة الحيوان واحدة حوالي 3 × 10 7 خلايا الدم البيضاء / الماوس مع بقاء 80٪ على الأقل.
- في حالة من إجمالي الوهم نخاع العظام، وإعداد TLR-3 - الخلايا أو بالوزن المانحة - /. تركيز الخلية الأمثل هو 2 × 10 7 خلية / مل منذ 2 × 10 6 خلايا في 100 ميكرولتر من PBS سيتم استخدامها للزرع. إذا لم يتم استخدامها على الفور، والحفاظ على الخلايا المانحة في -80 ° C باستخدام تقنيات التجميد البطيء وFBS مع 10٪ DMSO. لنموذج خيالية مختلطة، مزيج خلايا Langerin-DTR-المانحة وTLR3 - / -
- الماوس التشعيع وزرع
- أشرق إناث الفئران بين 6-8 أسابيع من العمر في مصدر irradiator السيزيوم 137. إعطاء الفئران جرعتين من 550 راد 4 ساعة على حدة. تشعيع تقسيم يقلل السمية الكبدية الحادة، وبالتالي يقلل من الماوس الفتك بسبب بروتوكول التشعيع.
- بعد التشعيع، والحفاظ على الفئران تحت العلاج بالمضادات الحيوية لمدة أسبوعين. إعطاء المضادات الحيوية مع مياه الشرب في 2،5-5 ملغ من Baytril / كغ.
- 2-4 ساعة بعد التشعيع الثاني، الفئران زرع خلايا نخاع العظام مع الجهات المانحة عن طريق الوريد. إجراء حقن الخلايا المانحة عبر الرجعية المدارية الجيوب الأنفية حقن 13 وتحت التخدير الأيزوفلورين باستخدام أقصى حجم 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 2 × 10 6 خلايا.
- بعد أربعة أسابيع لزراعة الأعضاء، تقييم engraftment في عينة من 100ميكرولتر من الدم المحيطي عبر التدفق الخلوي باستخدام آلة قادرة على قراءة اثنين على الاقل من الألوان. للتمييز بين المتبرع والمتلقي خلايا مقاومة للراديو، استخدم متاحة تجاريا CD45.1 fluorescently المسمى وCD45.2 الأجسام المضادة لمكافحة فأر باستخدام التخفيفات بين 1/100 و 1/200. وينبغي أن يكون engraftment الأمثل للخلايا المانحة لا يقل عن 80٪ من مجموع الخلايا المكونة للدم في الدم المحيطي.
- استنزاف التطعيم وتستهدف
- تلقيح الفئران مع لقاح الأنفلونزا الحية الموهنة المؤتلف عن طريق الأنف. للتطعيم الماوس، تخدير الفئران مع 5٪ الأيزوفلورين في الأكسجين باستخدام المرذاذ الدقة. استخدام ماصة 200 ميكرولتر لإدارة 50 ميكرولتر من PBS تحتوي على 10 3 وحدات لتشكيل لوحة (PFU) من اللقاح.
- لتوليد نموذج الفأر النهائي، علاج الفئران مع 50 نانوغرام من DT مخففة في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الأنف. إدارة قطرة قطرة DT مباشرة إلى الأنف من الفئران تخدير كما هو موضح في 3.3.1. ميل علاجم مع جرعات يومية بدء العلاج في يوم -2 قبل التطعيم حتى يوم 2 بعد التطعيم (الشكل 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لا يمكن أن يتحقق جيل لقاحات الأنفلونزا الحية الموهنة المؤتلف من قبل ترنسفكأيشن من البلازميدات ترميز ثمانية قطاعات من فيروس الانفلونزا تحت سيطرة المروجين ثنائي الاتجاه 5. وهناك لقاح الأنفلونزا الباردة تكييفها عادة ما تحتوي على ستة قطاعات من سلالة الباردة تكييفها وكذلك HA و NA من سلالة الانفلونزا الاختيار (على سبيل المثال، H1N1) (الشكل 1A). ويستند مبدأ-التكيف البارد على النسخ المتماثل المقيدة الفيروس عند 33 درجة مئوية، ودرجة حرارة الجهاز التنفسي العلوي (جمهورية تنزانيا المتحدة) في الفئران والبشر 14. لذلك، لا يمكن للقاح إجراء النسخ المتماثل إلى حد ما في جمهورية تنزانيا المتحدة ولكن لا يمكن أن يسبب الالتهاب الرئوي التنفسي السفلي المسالك. باستخدام الانصهار تكنولوجيا PCR، وهي منطقة المحفوظة في تنبع من النورامينيداز الفيروسي (NA) تم استبداله لارجاعها الببتيد OVA المشتقة (SIINFEKL) (الشكل 1B).
لتتبع استجابات محددة لقاح في حركية الدراسات لدينا استغل الببتيدات يمكن عزوها مشتق من تركيبة اللقاح وكذلك نماذج الماوس خيالية. بين يوم 3 و 6 في مرحلة ما بعد التطعيم، SIINFEKL الحاملة يمكن الكشف عن CD103 + DC في الغدد الليمفاوية استنزاف الرئة 12 (الشكل 2A). Multiparametric التدفق الخلوي يسمح الكمي لالمشتق من اللقاح تقديم المستضد في الوقت الحقيقي. بالإضافة إلى ذلك، ضخ خلايا T SIINFEKL محددة يسمح الكمي لCD8 T الردود خلية معينة لقاح (الشكل 2B).
لتقييم وظائف الجينات المحددة خلال التطعيم عمدنا إلى ابتكار نموذج الفأر الجمع بين التكنولوجيا DTR وتنافسية الوهم نخاع العظام (الشكل 3A). وبذلك، تم استهداف فقدان وظيفة الجين إلى حجرات خلية معينة على مدى الاستجابات المناعية للقاح (الشكل 3B، C).
52803 / 52803fig1.jpg "/>
و transfected الشكل 1. الهندسة LAIVs ارجاعها. (A) شرائح الأنفلونزا المستنسخة في البلازميدات ambisense (العمود الفقري PDZ كما وصفها مارتينيز Sobrido وآخرون. 5) إلى خلايا 293T باستخدام Lipofectamine 2000. 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، supernatants تم الحصول عليها من خلايا 293T استخدمت لمعطف الأنفلونزا متساهل مادين-داربي الكلاب الكلى (MDCK) الخلايا في وجود من 1٪ من TPCK التربسين. تم تنفيذ جميع البروتوكول في 33 ° C. ثم تم تلقيح supernatants الفيروسية من الخلايا MDCK في العمر 9 ايام بيض الدجاج المحتوي لمدة ثلاثة أيام في 33 ° C. وأكد الإنقاذ الفيروسية التي تتخذ من PCR التضخيم الجينوم الفيروسي والتسلسل. (B) لإدراج المستمدة OVA SIINFEKL الببتيد في نورامينيداز الإنفلونزا (NA)، وهي منطقة الحفاظ (بقايا 65-72) من الجين NA من A / بورتو تم استبدال ريكو / 8/34 (H1N1) فيروس ل[كدنا قصيرة ترميز الببتيد SIINFEKL عبر الانصهارPCR. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم بوابات الشكل 2. لقاح تقنيات البحث عن المفقودين. (A) المهاجرة DC في الغدد الليمفاوية المنصفية (mLNs) كما CD11c وميد الدرجة MHC II خلايا مرحبا. في المثال، تم تحديد CD103 المهاجرة + DCS-تحمل المستضد كما CD103 + H-2 ب -SIINFEKL + الخلايا عن طريق التدفق الخلوي. وقد غرست (B) خلايا T OT-I-محددة لالفئران في نفس اليوم من التطعيم. بعد أربعة أيام، تم جمع الخلايا من الغدد الليمفاوية من الفئران الملقحة وتقييمها لملف التعريف انتشارها. واستخدمت CFSE التخفيف على قناة FL-1 كمؤشر لانقسام الخلايا. CAV: لقاح الباردة تكييفها. CAV SIINFEKL : لقاح الباردة تكييفها معربا عن OVA المستمدة من SIINFEKL الببتيد الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. دراسات وظائف الجينات. (A) رسم تخطيطي للالوهم نخاع العظم (BMC) واستراتيجيات التطعيم. (-2 و+2 الرجوع إلى إدارة DT قبل يومين أو بعد التطعيم). (ب) إضافة DT في الفئران خيالية معربا عن Langerin-DTR يسمح نضوب معين من المهاجرة Langerin + البلدان النامية coexpressing CD103 في الرئة. (C) المقارن تحليل خلايا T معينة لقاح في الفئران خيالية. وقد تم الكشف عن NP 366-374 -specific CD8 الخلايا التائية عبر dextramer تلطيخ التجاري.803fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة وصفنا كيف علم الوراثة ونماذج الماوس خيالية العكس يمكن استخدامها لتوضيح الآليات الفسيولوجية والجزيئية للحصانة التي يسببها اللقاح. تم تأسيس علم الوراثة عكس الإنفلونزا في العديد من المختبرات ولعبت دورا كبير في فهم المرضية الإنفلونزا، والنسخ، ونقل 17. وهناك نقطة رئيسية في بروتوكول لدينا هي إنقاذ لقاحات الأنفلونزا الباردة تكييفها معربا عن الحواتم الأجنبية. في حين وصفت استراتيجية لإدخال cDNAs قصيرة في ساق من النورامينيداز من قبل العديد من المجموعات، يحتاج المحقق لضمان أن يتم تقديم أية طفرات إضافية خلال إنتاج اللقاح في البيض وأن اللقاح قادر على تكرار في الجهاز التنفسي دون التسبب الالتهاب الرئوي 5،12. لأن كلا ساق من النورامينيداز الفيروسية وكذلك مناطق أخرى من الجينوم الأنفلونزا مثل الجين NS والجزء PB1 تسمح بتخصيص تسلسل الأجنبية 19،20، إدخال تعديلات على بروتوكول لدينا يمكن استخدامها لإضافة الببتيدات أجنبية إضافية، على سبيل المثال، فهم التسلسل الهرمي للاستجابة خلايا T المناعية ضد فيروس الانفلونزا، وهذه نقطة أساسية لتصميم لقاح عقلانية.
من خلال الجمع بين اللقاحات التي يمكن تتبعها واستنزاف أساس DTR من مجموعات فرعية DC كنا قادرين على استهداف فقدان وظيفة الجين إلى مجموعات فرعية معينة من الخلايا. وقد تم تطبيق هذه التكنولوجيا من قبل لتوضيح الاستجابة المناعية لمسببات الأمراض 21، ولكن ليس لتشريح مسارات المسؤولة عن حماية اللقاح. نظرا لتوافر النماذج القائمة DTR ومرونة هذه التقنية لتوليد الفئران خيالية، هذه التقنية يمكن زيادة التوسع إلى السكان الكريات البيض إضافي والجينات مع وظائف جهاز المناعة. من المهم أن نلاحظ أن العلاج DT قد يؤدي أيضا إلى استنزاف فرعية DC إضافية معربا عن langerin مثل CD8α + DC في الأنسجة اللمفاوية. لذلك ينصح بشدة المؤسسة العامة لrform دراسة الجرعة والاستجابة لتقييم آثار العلاج DT. والتحذير المحتمل لنموذجنا هو أن زرع نخاع العظام الصنعية وقد تبين أن ينخفض المضادة للفيروسات العام CD8 T خلية الحصانة 15. وبالتالي، الحذر لابد من ممارسته عند مقارنة البيانات بين الفئران المزروعة وغير المزروعة.
عدة مسببات الأمراض البشرية الرئيسية التي هناك حاجة ماسة لقاحات يمكن دراستها في نماذج الفئران باستخدام البرية من نوع مسببات الأمراض أو بدائل الماوس. وتشمل هذه فيروس الانفلونزا، المتصورة، وفيروس الايبولا. التقنيات المقترحة في هذه الدراسة قد تساعد على فهم آلية أساسية لقاحات تجريبية ضد هذه الجراثيم، وبالتالي، لترشيد تصميم لقاح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1x) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| OptiMEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10x | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
References
- Bevan, M. J. Understand memory, design better vaccines. Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).
- Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
- Querec, T. D. Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans. Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. 3, (2010).
- Haniffa, M. Human Tissues Contain CD141hi Cross-Presenting Dendritic Cells with Functional Homology to Mouse CD103+ Nonlymphoid Dendritic Cells. Immunity. 37, 60-73 (2012).
- Haniffa, M., Collin, M., Ginhoux, F. Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and mouse. Adv. Immunol. 120, 1-49 (2013).
- Jung, S. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17, 211-220 (2011).
- Lahl, K., Sparwasser, T. In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model. Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).
- Duffield, J. S. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J. Clin. Invest. 115, 56-65 (2005).
- Meredith, M. M. Expression of the zinc finger transcription factor zDC. J. Exp. Med. 209, 1153-1165 (2012).
- Girón, J. V. Mucosal Polyinosinic-Polycytidylic Acid Improves Protection Elicited by Replicating Influenza Vaccines via Enhanced Dendritic Cell Function and T Cell Immunity. J. Immunol. 193, 1324-1332 (2014).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. bib.usb.ve. , (1983).
- Cox, R. J., Brokstad, K. A., Ogra, P. Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines. Scand. J. Immunol. 59, 1-15 (2004).
- Gowdy, K. M. Impaired CD8(+) T cell immunity after allogeneic bone marrow transplantation leads to persistent and severe respiratory viral infection. Transpl. Immunol. 32, 51-60 (2015).
