Introduction
Поколение иммунологической памяти в отсутствии заболевания физиологическая основа эффективного вакцинации 1. Недавно системной биологии подходы показали, что успешные вакцины, такие как вакцины против желтой лихорадки, индуцируют сильную индукцию врожденных иммунных реакций и активации нескольких подмножеств дендритных клеток (ДК), который, в свою очередь, приводит к активации мультилинейной антиген специфическими Т-клетками 2,3. Так ДК являются только иммунная клетка населения с возможностью активировать антиген-специфичные наивные Т-клетки 4, изучение их функции во время вакцинации важно понять иммунные ответы на вакцины и разрабатывать будущие стратегии в отношении сложных патогенов.
Система позволяет трассировку различных подмножеств ДК во время иммунных реакций на вакцины хочется, чтобы установить точные кинетики миграции DC в лимфоидных тканях, и, следовательно, для обеспеченияпонимание физиологических механизмов, ответственных за инициацию вакцины конкретных адаптивного иммунитета. Обратной генетики подходы предлагают возможность генерировать изменены, живые ослабленные вакцины-которые могут быть использованы экспериментально с этой целью. С момента своего внедрения на исследования гриппа, плазмиды на основе обратной генетики была широко используется для создания рекомбинантных штаммов гриппа, включая LAIVs. Стандартные протоколы, чтобы спасти рекомбинантные вирусы гриппа требуют мульти-трансфекции высоко transfectable клеточных линий ambisense плазмид (производящих как положительный и отрицательный смысл РНК), содержащих восемь вируса гриппа сегменты, а также усиления в разрешительной системе, таких как Madin-Darby почки собаки ( MDCK клетки) и / или куриные яйца куриного эмбриона 5. Тем не менее, применение обратной генетики для получения молекулярных инструментов для изучения иммунных механизмов вакцинации остается неисследованной.
Поколениеновых моделей, позволяющих мыши определенный истощение иммунной подмножеств клеток, в том числе ДК, открыла новые возможности для понимания основных иммунных механизмов, лежащих защиту вакциной вызвало. Сравнение функций постоянного тока подмножества у мышей и человека показали, что, в значительной степени, мышь и человека ДК функционально гомологичны 6,7, эти данные, убедительно свидетельствуют, что разработка моделей мыши позволяет конкретный истощение домена в стационарном состоянии и при воспалительных условиях, может служить, чтобы понять физиологию ответов постоянного тока в организме человека. В последние годы ряд моделей мыши были получены проведения трансгены, выражающие обезьян дифтерийный токсин (ДТ) рецептор (DTR) под контролем промоторной области гена процентной 8,9. Так тканей мыши, естественно, не выразить DTR, эти модели позволяют условный истощение клеток подмножеств несущих целевой ген интереса при мыши прививки с DT. Таким образом, наша Abiliти истощать конкретные контроллеры домена и другие лейкоциты в естественных условиях в течение физиологических процессов, была значительно улучшена по развитию DTR-ро основе. Однако, хотя эти трансгенные мышиные модели широко используются для понимания онтогенеза иммунной системы, их применение в разработке вакцин была едва испытания. Здесь, сочетая гриппа обратной генетики и конкурентные химеры костного мозга DTR-основанные, мы предлагаем метод изучения кинетики иммунитета вакцин, а также отдельной функции гена во иммунных реакций на вакцины в естественных условиях. Применение этой технологии для доклинических оценки новых вакцин против инфекционных заболеваний сложных могло бы способствовать рационализации дизайн вакцин и проверить кандидатов вакцины в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с утвержденными протоколами и в соответствии с инструкциями закона защиты животных Германии. Все сотрудники, осуществляющие эксперименты на животных прошли учебные программы в соответствии с категории B или C Федерации европейских лабораторных животных науки ассоциаций.
1. Генерация рекомбинантного живых ослабленных вакцин гриппа с помощью обратной генетики
Примечание: Подробный протокол для генерации рекомбинантных вирусов гриппа по обратной генетики был описан в предыдущих исследованиях 5 и выходит за рамки настоящего отчета. Вкратце, спасение вакцин холодоадаптированных гриппа (CAV) делается в области биобезопасности класс II шкафу под уровнем биологической безопасности 2 (BSL2) сдерживания, и включает в себя шаги, описанные ниже. Протокол трансфекции и инфекции следует, что из Мартинес-Sobrido др. 5.
- Создание реассортивных холодоадаптированных гриппаВакцина с использованием в качестве фона холодной деформации адаптированы A / Ann Arbor / 6/60 (H2N2), а также гемагглютинина (HA) и модифицированный нейраминидазы (NA) из A / PR / 8/34 (H1N1) штамма ( 1А). Модификации в гене NA состоит из ПЦР-замены консервативной последовательности в белковой стебля (остатки от 65 до 72) по короткой последовательности кДНК, кодирующей куриный овальбумин (OVA) -derived пептид SIINFEKL (Фигура 1В). SIINFEKL пептид является высокоэффективным иммунодоминантным пептида в контексте Н-2b МНС класса I-ограниченной реакцию мышей C57BL / 6 12.
- Пластина 10 6 293T клеток на лунку в 6-луночных планшетах с использованием DMEM 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) с добавкой 1% пенициллина / стрептомицина (P / E).
- Подготовка плазмиды трансфекции смесь: Добавить 1 мкг каждого из плазмид, кодирующих кДНК для РВ2, PB1, PA, NP, M, NS от гриппа A / Энн Арбор / 6/60 штамма и 1 мкг плазмиды, кодирующие НС -SIINFEKL иHA от гриппа A / PR / 8/34. Добавить предварительно нагревают OptiMEM (15 мкл до конечного объема 100 мкл / лунку).
- Инкубируйте трансфекции смесь в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Добавить 100 мкл трансфекции смеси / лунку и инкубировать в течение 16 часов при 37 ° С и 5% СО 2.
- Изменить клеток средств массовой информации путем DMEM 0,3% БСА 1% P / E на 33 ° С и 5% CO 2 в течение 5 часов.
- Добавить 10 6 гриппа разрешающие MDCK клетки в ДМСО, содержащего 1 мкг / мл трипсина из поджелудочной железы быка, обработанной L-1-Tosylamide-2-фенилэтил хлорметил кетона (ТРСК-трипсином). Поддержание 293Т-MDCK совместное культивирование в течение 2 - 3 дней при температуре 33 ° С и 5% СО 2.
- Собирают супернатанты MDCK-293T клеток совместных культурах и понятно центрифугированием при 260 х г в течение 5 мин.
- Привить 9 - 10-дневные куриные яйца с эмбрионами в стерильных условиях. Чтобы сделать это, сделать отверстие в верхней части скорлупы, как указано Мартинес-Sobrido др. 5.
- Накройте скорлупы остроумиеч расплавленный воск с помощью ватного тампона и инкубировать привитых куриных яиц в течение 3 дней при 33 ° С.
- Урожай аллантоисной жидкость из инфицированных яиц с эмбрионами: Вымойте яичной скорлупы с 70% этанола. Откройте яйцо с очень мягко взломать в верхней части и удалить мембрану аллантоисной помощью стерильного пинцета. Использование 10 мл пипетки, чтобы собрать как можно больше жидкости, насколько это возможно (как правило, 6 - 10 мл). Центрифуга при 260 х г в течение 10 мин при 4 ° С и передачи очищенную аллантоисной жидкости в новые пробирки.
2. Отслеживание вакцин специфический иммунитет
- Трассировка пептидных несущих дендритных клеток (ДК)
- Для вакцинации мыши, обезболить мышей с 5% изофлуран в кислороде, используя точность испаритель. Использование 200 мкл пипетки для введения 50 мкл PBS, содержащие 10 3 бляшкообразующих единиц (БОЕ) вакцины экспрессии пептида SIINFEKL воздушно-капельным путем непосредственно в ноздри мыши.
- Три дня после вакцинации, euthanizе мышей через изофлуран анестезии с последующим смещением шейных позвонков.
- Подтяжка кожи мыши на средней линии чуть ниже грудной клетки с щипцами и вырезать небольшой разрез через кожу с помощью ножниц. С точки разреза, сделать 3 - 5 см в длину прорезать кожу к обоим головы и хвоста, а затем два 2 см надрезы от средней линии в поперечном направлении от каждого конца. Отогните кожи, чтобы выявить перитонеальные и грудной полостей. Аккуратно вырежьте через мембраны, окружающие брюшины подвергать грудную клетку.
- Чтобы получить доступ к средостения сократить diafragma и дно клетки ребра. Найти и удалить 2 лимфоузлов средостения (mLNs), слегка спинной и сбоку рядом с тимуса, медиально, прилегающих к брахиоцефальных артерий, недалеко от брюшной стороне трахеи.
- Для сбора mLNs использовать изогнутые щипцы. Поместите щипцы под лимфатических узлов и тянуть их нежно. Поместите лимфатические узлы в 6-луночный планшет, содержащий 1 мл DMEM и удалить любые connectiве или жировой ткани окружающие узел.
- Дразнить каждый образец тщательно с двумя иглами 26 G, прикрепленных к 1 мл шприцев. Для дразнить лимфатический узел, удерживайте ее с одной иглой, а разламывают лимфатического узла с другой иглой. Когда это будет сделано правильно, концентрированные клетки разрывные из лимфатического узла легко наблюдаются в средствах массовой информации. Пройти все ткани материала через нейлоновый фильтр 70 мкм для получения суспензии отдельных клеток.
- Центрифуга суспензии отдельных клеток в течение 10 мин при 260 х г в охлаждаемой центрифуге. Ресуспендируют осадок клеток в 2 мл эритроцитов лизирующего (RbCl) буфера для лизиса красных кровяных клеток. Разрешить лизиса проводили в течение 3 мин при комнатной температуре.
- Нейтрализовать RbCl буфер с помощью центрифугирования и ресуспендирования клеток в 2 мл ледяной PBS.
- Пластина клеток в U-образный 96-луночные планшеты при концентрации 10 7 клеток / мл в конечном объеме 100 мкл.
- Для проточной цитометрии анализа, блок клеток Fc-рецепторов с помощью1 мкг анти-CD16 мыши / CD32 антител на 10 6 клеток в течение 15 мин на льду.
- Центрифуга пластины и выбросить супернатантами от пластины стряхивая. Выдержите отдельных скважин с поверхности комбинации антител выбора. Обычно для обнаружения дендритных клеток в лимфатических узлах, смесь антител должна включать: 0,25 мкг анти-CD11c, 0,25 мкг CD11b, 0,5 мкг МНС класса II, 0,25 мкг CD103 и 0,15 мкг CD8α в конечном объеме 100 мкл.
- При отрицательных стробирования, добавить 0,25 мкг анти-CD3, CD19, NK1.1 или линия коктейль (фиг.2А). Альтернативные стратегии стробирования, а также протоколы для надлежащей компенсации нескольких люминесцентных красителей можно найти на веб-сайте проекта генома иммунологии. В дополнение к поверхностных маркеров выбора, добавления 1 мкг антитела против H-2K б связанного с SIINFEKL в коктейль. Это коммерчески доступны антитела позволит визуализировать домена яп, пептид SIINFEKL связан с поверхности МНС класса I.
- Инкубируйте клетки с поверхности антител в течение 30 мин на льду. Защита пластины от света. Центрифуга пластины при 260 мкг в течение 5 мин и мыть с 2 мл PBS, в два раза. Передача клеток методом проточной цитометрии трубки для анализа.
- Оценка вакцины конкретной пролиферацию Т-клеток
- Получение Т-клеток донора из коммерчески доступного TCR-трансгенных мышей (мышей ОТ-I) (C57BL / 6-TG (TCR aTcrb) 1100Mjb / J), в котором все генерируемые CD8 Т-клетки являются специфическими для пептида SIINFEKL. Эвтаназии мышей с изофлуран анестезии с последующим смещением шейных позвонков. Урожай селезенки, выполняя разрез в брюшной полости. Поместите селезенки / с в 2 мл DMEM / селезенки и удалить соединительную и жировую ткань.
- Создание одноклеточных суспензий из селезенки по методике, описанной в 2.1.2 и 2.1.3.
- Для дальнейшего обогащения суспензии отдельных клеток на Т-клеток, применяются протоколы магнитного бисера разделенияиспользуя положительные или отрицательные процедуры отбора 12. Чтобы дифференцировать донора от клеток-реципиентов, используйте конгенных мышей так, что, например мышей получателей выразить лейкоцитов маркера CD45.1 а донор Т-клетки выразить CD45.2 12.
- Для обозначения Т-клеток, инкубируют их в 1 мл PBS, содержащим 5 мкМ карбоксифлуоресцеина сукцинимидил эфира (CFSE) в оптимальной плотности клеток 5 × 10 6 клеток / мл. Инкубируйте клетки в течение 20 мин при 37 ° С в защищенном от света воздействия. После инкубации, центрифуги клетки при 260 мкг в течение 5 мин, отбросить супернатант, и ресуспендируют клеток в 3 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), чтобы нейтрализовать CFSE.
- Центрифуга клетки при 260 мкг в течение 10 мин и ресуспендируют в адекватном объеме PBS так, чтобы 100 мкл раствора содержит 2 × 10 6 клеток. Настаивать получателей конгенных мышей с 2 х 10 6 клеток / мышь через ретро-орбитальное синусового инъекции 13.
- Эвтаназии мышей-реципиентов в дни 3, 4 и 5 пост-вакцинации с использованием изофлуран анестезии с последующим смещением шейных позвонков. Заготавливают лимфоузлов средостения и подготовить отдельные клеточные суспензии для проточной цитометрии, как указано в 2.1.2-2.1.5.
- Определить донорских клеток путем окрашивания одноклеточных суспензий в 100 мкл коктейля антител, содержащей: 0,25 мкг против мышиного CD3, CD4 и CD8 антител; 0,5 мкг антитела против мышиного CD45.1 или CD45.2 антител (в зависимости от фенотипа клеток донора). Оставьте FL-1 канал цитометра открытой (FITC) для определения профиля разбавления CFSE 12 (рис 2B).
3. химерных мышей, чтобы рассекать ответов генной вакциной конкретных
ПРИМЕЧАНИЕ: поколение конкурентоспособных химер костного мозга с использованием мышиных моделей DTR-основанные позволяет дискриминацию клеточных функций конкретных во иммунного ответа на вакцины. Здесь мы показываем дополнительную стратегию, с помощью которых сочетание DTR-выражающее доноров Cлоктей с клетками из плей-разрешений мышей для изучения генов специфические функции во время иммунитета в конкретных клеточных отсеках. В примере мы создаем мышей с определенной удаление Толл-подобные рецепторы 3 (TLR3) в лангерин + CD103 + DC.
- Приготовление донорских клеток костного мозга
- Работа в шкафу II уровня биобезопасности. Избегайте загрязнения с помощью исключительно автоклавного инструментов.
- Для создания костного мозга мышей химерные, используйте конгенных CD45.1 + C57BL / 6 самок мышей в качестве получателей, и использовать TLR3 - / -, лангерин-DTR / EGFP или мышей дикого выражающее CD45.2 + как доноров. Использование конгенных донора и реципиента мышей позволяет дифференцировать доноров и реципиентов клеток через проточной цитометрии, и это позволяет приживления быть оценены.
- Для получения донорских клеток костного мозга, эвтаназии мышей-доноров с изофлуран анестезии с последующим смещением шейных позвонков. С острыми ножницами выполнить разрезы вокруг лодыжек, так что мУз мускулатура подвергается.
- Использование тупые щипцы тянуть кожу мыши и меха мягко от лодыжки к бедрам, так что мышцы ног видны.
- С острыми ножницами вырезать ноги мыши на высоте бедер и выше головки бедренной кости.
- Поместите ноги на чашку Петри и на льду. Делайте это быстро, и удалить все мышцы, чтобы разоблачить кости.
- Отдельные бедра и голени. Поместите кости в растворе 70% этанола в течение 5 мин, чтобы удалить возможные бактерии и поместить их сразу же на другом чашку Петри, содержащую 5 мл бессывороточной DMEM. Вырезать кости заканчивается с помощью острых ножниц и промойте костного мозга в DMEM. Чтобы сделать это, флеш 1 мл DMEM в кости, вставив 26 G иглой 5 мл шприц. Убедитесь, что кости выглядит белым (пусто) после промывки.
- Соберите все клетки костного мозга мышей, доноров в 10 мл DMEM. Генерация одноклеточных суспензий из клеток костного мозга при прохождении урожай через сито 70 мкм клетки.
- Clуха одноклеточных суспензий клеток костного мозга путем центрифугирования при 260 мкг в течение 10 мин при 4 ° С в центрифуге с охлаждением. Ресуспендируют осадок клеток в 10 мл PBS. Разрушающим красные кровяные клетки, используя решение RbCl, как описано в 2.1.3 и 2.1.4.
- Количество клеток костного мозга с использованием либо гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток. Оценка жизнеспособности клеток путем определения мертвых клеток с помощью окрашивания трипановым синим 13. Оптимально, одна урожайность животных около 3 х 10 7 лейкоциты / мышь с жизнеспособности, по меньшей мере 80%.
- В случае общего химер костного мозга, подготовить TLR-3 - / - или донорских клеток мас. Оптимальная концентрация клеток в 2 х 10 7 клеток / мл, так как 2 × 10 6 клеток в 100 мкл PBS будет использоваться для трансплантации. Если не используют сразу, сохранить донорских клеток при -80 ° С, используя медленные методы замораживания и FBS с 10% ДМСО. Для смешанной модели химерного, смешать лангерин-DTR-доноров клеток и TLR3 - / -
- Облучение мыши и трансплантации
- Облучают самок мышей между 6 - 8 недель возраста в Цезий-137 источника облучателя. Дайте мышам две дозы 550 рад 4 ч друг от друга. Разделение облучение сводит к минимуму острой печеночной токсичности и, следовательно, уменьшает мыши летальность вследствие протокола облучения.
- После облучения, держать мышей в лечении антибиотиками в течение двух недель. Дайте антибиотики с питьевой водой на 2,5 - 5 мг / кг Baytril.
- 2 - 4 ч после второго облучения, пересадка клеток мышей с донором костного мозга внутривенно. Выполнение инъекции донорских клеток с помощью ретро-орбитального синуса инъекции 13 и под наркозом изофлуран использованием максимального объема 100 мкл PBS, содержащим 2 × 10 6 клеток.
- Через четыре недели после трансплантации, оценивать приживление в образце 100мкл периферической крови с помощью проточной цитометрии с использованием машины умеют читать по крайней мере, два цвета. Чтобы отличить между донором и радио-устойчивых клеток-реципиентов, использовать имеющиеся в продаже флуоресцентно меченного CD45.1 и CD45.2 антитела анти-мыши, используя разведения между 1/100 и 1/200. Оптимальное приживление донорских клеток должна быть не менее 80% от общего количества кроветворных клеток в периферической крови.
- Истощение Вакцинация и целевых
- Вакцинацию мышей с рекомбинантной вакцины живых ослабленных гриппа с помощью интраназального. Для вакцинации мыши, обезболить мышей с 5% изофлуран в кислороде, используя точность испаритель. Использование 200 мкл пипетки для введения 50 мкл PBS, содержащие 10 3 бляшкообразующих единиц (БОЕ) вакцины.
- Для создания окончательной модели мыши, лечения мышей с 50 нг DT разбавленного в 50 мкл PBS интраназально. Администрирование DT по капле непосредственно к ноздри наркозом мышей, как описано в 3.3.1. Лечить мильсе с ежедневными дозами не начиная лечение в день -2 до вакцинации до 2 день после вакцинации (рис 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Генерация рекомбинантных живых ослабленных вакцин может быть достигнуто путем трансфекции плазмидами, кодирующими восемь сегментов вируса гриппа под контролем промоторов двунаправленных 5. Вакцина адаптированных к холоду гриппа обычно содержит шесть сегменты холодоадаптированных деформации, а также ГА и НС штамма гриппа выбора (например, H1N1) (рис 1А). Принцип холодной адаптации на основе вируса с ограниченным репликации при 33 ° C, температура верхнего респираторного тракта (УРТ) у мышей и человека 14. Таким образом, вакцина может повторить в какой-то степени в УРТ, но не может вызвать пневмонию нижних дыхательных путей. Использование технологии сварки ПЦР, консервативную область в стволе вирусной нейраминидазы (NA) был заменен на отслеживаемой OVA-пептид (SIINFEKL) (Фигура 1В).
Чтобы отслеживать ответы вакцины конкретных исследований в области кинетики мы имеем приняты преимущество отслеживаемых пептидов, полученных из композиции вакцины, а также химерных мышах. Между 3-й день и 6 после вакцинации, SIINFEKL несущих CD103 + ДК могут быть обнаружены в легких слива лимфатических узлов 12 (фиг.2А). Многопараметрическая цитометрии потока позволяет количественно вакцинного происхождения презентации антигена в режиме реального времени. Кроме того, настой SIINFEKL-специфических Т-клеток позволяет количественно определить вакцин-специфических CD8 Т-клеточные ответы (фиг.2В).
Для оценки функции геноспецифических при вакцинации мы разработали модель мыши, сочетающий технологии DTR и конкурентные химеры костного мозга (рис 3а). Поступая таким образом, утрата функции гена, была предназначена для конкретных клеточных компартментах в течение иммунных реакций на вакцинацию (фиг.3В, С).
52803 / 52803fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Проектирование отслеживаемых LAIVs. () Сегменты гриппа клонированные в ambisense плазмид (PDz основой, как описано Мартинес-Sobrido др. 5) трансфицировали в клетки 293Т, используя Lipofectamine 2000 24 ч после трансфекции супернатанты, полученные из клеток 293Т были использованы для покрытия гриппа разрешающие Madin-Darby почки собаки (MDCK) клетках в присутствии 1% ТРСК трипсином. Все протокол проводили при 33 ° С. Вирусные супернатанты из MDCK клетки затем высевали в 9-дневных оплодотворенных куриных яиц в течение трех дней при температуре 33 ° С. Вирусный спасение было подтверждено с помощью ПЦР-амплификации на основе вирусного генома и последовательности. (B) Чтобы вставить OVA-пептид получена SIINFEKL в нейраминидазы гриппа (NA), консервативная область (остатки от 65 до 72) гена Н. А / Пуэрто Rico / 8/34 (H1N1) был заменен на короткое кДНК, кодирующей пептид SIINFEKL через слиянияПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Вакцина отслеживания методов. () Миграционная ДК воротами в лимфатические узлы средостения (mLNs) как CD11c мед МНС класса II привет клеток. В примере, антиген-несущих миграционную CD103 + DC, были определены как Н-2 B -SIINFEKL + клеток CD103 + с помощью проточной цитометрии. (B) ОТ-I-специфические Т-клетки вводили мышам в тот же день вакцинации. Четыре дня спустя клетки были собраны из лимфатических узлов мышей, вакцинированных и оценивали их профиль распространения. Разбавление CFSE на FL-1 канала была использована в качестве индикатора клеточного деления. CAV: холодоадаптированных вакцина; CAV SIINFEKL :. Выразив ОВА-производный SIINFEKL пептид холодоадаптированных вакцина Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. функция Джин исследования. () Схематическое химер костного мозга (BMC) и стратегий вакцинации. (-2 До +2 см с введением DT два дня до или после вакцинации). (Б) Добавление DT в химерных мышей, экспрессирующих лангерин-DTR позволяет конкретный истощение миграционная лангерин + ДК совместной экспрессии CD103 в легких. (С) Сравнительный Анализ вакцины Т-клеток в химерных мышей. Обнаружение НП 366-374 Определённые CD8 Т-клеток было сделано с помощью окрашивания коммерческой dextramer.803fig3large.jpg "цель =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы рассмотрим, как генетика и химерные мышиные модели могут быть использованы для выяснения физиологических и молекулярных механизмов иммунитета, вызванного вакциной. Грипп обратной генетики устанавливается во многих лабораториях и сыграл главную роль в понимании патогенеза гриппа, репликацию и передачу 17. Ключевым моментом в нашем протоколе является спасение вакцин холодоадаптированных гриппа, выражающих иностранных эпитопы. В то время как стратегия внедрения короткие кДНК в стебле нейраминидазы был описан многими группами, следователь должен убедиться, что никаких дополнительных мутаций не будут введены во время производства вакцины в яйцах и вакцина способна к репликации в дыхательных путях, не вызывая пневмония 5,12. Так как стебель вирусной нейраминидазы, а также других областей генома гриппа, таких, как сегмент гена NS и PB1 сегменте позволяет назначать иностранных последовательностей 19,20, модификации нашего протокола могут быть использованы для добавления дополнительных чужеродных пептидов, например, понимать иерархию иммунного ответа Т-клеток против вируса гриппа, ключевой момент для рационального дизайна вакцины.
Объединив отслеживаемые вакцин и DTR основе истощение подмножеств DC мы смогли целевой потерю функции гена в конкретных клеточных подмножеств. Эта технология была применена до того, чтобы выяснить иммунный ответ на патогены 21, но не рассекать пути, ответственные за защиту вакцины. Из-за наличия моделей, основанных на DTR и гибкости техники для получения химерных мышей, эта техника может быть расширена с дополнительными популяции лейкоцитов и генов с иммунных функций. Важно отметить, что лечение DT может также привести к истощению дополнительных подмножеств DC, экспрессирующих лангерин таких как CD8α + ДК в лимфоидных тканей. Поэтому настоятельно рекомендуется реrform исследование доза-реакция для оценки эффектов лечения DT. Потенциал предостережение нашей модели является то, что трансплантация аллогенного костного мозга было показано, чтобы уменьшить общий противовирусный CD8 Т-клеток иммунитета 15. Таким образом, предостережение должно быть осуществлено при сравнении данных между пересаженных и не пересаженных мышей.
Несколько ключевых патогены человека, вакцины срочно нужен могут быть изучены в моделях мыши с помощью патогенов дикого типа или суррогаты мыши. Они включают в себя вирус гриппа, Plasmodium, и вирус Эбола. Методы, предложенные в данном исследовании, может помочь понять основной механизм экспериментальных вакцин против этих патогенов и, следовательно, для рационализации дизайн вакцины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1x) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| OptiMEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10x | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
References
- Bevan, M. J. Understand memory, design better vaccines. Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).
- Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
- Querec, T. D. Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans. Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. 3, (2010).
- Haniffa, M. Human Tissues Contain CD141hi Cross-Presenting Dendritic Cells with Functional Homology to Mouse CD103+ Nonlymphoid Dendritic Cells. Immunity. 37, 60-73 (2012).
- Haniffa, M., Collin, M., Ginhoux, F. Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and mouse. Adv. Immunol. 120, 1-49 (2013).
- Jung, S. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17, 211-220 (2011).
- Lahl, K., Sparwasser, T. In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model. Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).
- Duffield, J. S. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J. Clin. Invest. 115, 56-65 (2005).
- Meredith, M. M. Expression of the zinc finger transcription factor zDC. J. Exp. Med. 209, 1153-1165 (2012).
- Girón, J. V. Mucosal Polyinosinic-Polycytidylic Acid Improves Protection Elicited by Replicating Influenza Vaccines via Enhanced Dendritic Cell Function and T Cell Immunity. J. Immunol. 193, 1324-1332 (2014).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. bib.usb.ve. , (1983).
- Cox, R. J., Brokstad, K. A., Ogra, P. Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines. Scand. J. Immunol. 59, 1-15 (2004).
- Gowdy, K. M. Impaired CD8(+) T cell immunity after allogeneic bone marrow transplantation leads to persistent and severe respiratory viral infection. Transpl. Immunol. 32, 51-60 (2015).
