Introduction
免疫记忆在没有疾病的产生是有效的疫苗接种1的生理基础。最近，系统生物学为基础的方法已经表明，成功的疫苗，如黄热病疫苗，诱导强的诱导先天免疫反应和活化的树突细胞（DC），几种亚群这反过来，导致多向活化的抗原特异性T细胞2,3。由于区议会是唯一的免疫细胞群，激活抗原特异性幼稚T细胞4的能力，其功能的疫苗接种过程中的研究是至关重要的理解免疫反应的疫苗，并设计未来战略打击有挑战性的病原体。
一种系统，允许在免疫应答的疫苗不同的DC子集的跟踪是需要的，以便建立直流偏移的精确动力学到淋巴组织，并因此提供洞察负责疫苗的特异性适应性免疫启动的生理机制。反向遗传学为基础的方法提供以产生修改的可能性，减毒活疫苗，可通过实验用于此目的。因为它的实现对流感的研究，基于质粒的反向遗传学已被广泛采用，以产生重组流感病毒株包括LAIVs。标准协议来拯救重组流感病毒所需要的多转染的含有八个流感病毒节段，以及扩增在一个宽松的系统，如的Madin-Darby犬肾高度转染的细胞系的双义质粒（产生正的和负义RNA）（ MDCK）细胞和/或鸡胚5。然而，反向遗传学中的应用，以产生为了研究疫苗的免疫机制的分子工具仍然未开发。
发电新的小鼠模型允许免疫细胞亚群，包括DCS具体枯竭，开辟了新的可能性，以了解潜在的疫苗引发保护的基本免疫机制。在小鼠和人类DC亚群功能之间的比较表明，在很大的程度上，小鼠和人DCs是功能性同源6,7-，这些发现，有力地表明，小鼠模型的发展允许DC的在稳定状态下的特定耗尽并且在炎性病症，可能有助于理解直流反应在人体中的生理。近年来已经产生了许多小鼠模型携带转基因的表达猿猴白喉毒素（DT）的受体（DTR）的兴趣8,9的基因的启动子区的控制之下。由于小鼠组织中不自然地表达DTR，这些模型允许携带鼠标时接种DT感兴趣的靶基因细胞亚群的条件枯竭。因此，我们的abiliTY过程中的生理过程耗尽特定DC和白细胞等在体内 ，已经大大的DTR-RO为主的发展增强。然而，虽然这些转基因小鼠模型已被广泛使用，以了解免疫系统的个体发育，其应用到疫苗开发已几乎没有测试。这里，通过结合流感反向遗传学和DTR基于竞争的骨髓嵌合体中，我们提出在疫苗的免疫应答的体内研究疫苗免疫以及个别基因功能的动力学的方法。这种技术的对具有挑战性的传染病新型疫苗临床前评价中的应用可以帮助理顺疫苗设计和体内测试候选疫苗。
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Protocol
动物实验按照批准的方案和下列德国动物保护法的准则进行的。所有开展动物实验的工作人员根据B类或欧洲实验动物科学协会联合会了C通过培训计划。
1.重组产生流感减毒活疫苗通过反向遗传学
注：对于重组流感病毒通过反向遗传学产生的具体协议已经由先前的研究5和超出本报告的范围。简单地说，冷适应流感疫苗（CAV）的救助是在生物安全II类下柜生物安全水平进行2（BSL2）围堵，并涉及以下详细步骤。转染和感染协议得出的 马丁内斯Sobrido 等 5。
- 产生重配冷适应流感使用作为背景的冷适应毒株A /安阿伯/ 6/60（H2N2），以及血细胞凝集素（HA）和经修饰的神经氨酸酶（NA）的A / PR / 8/34（H1N1）病毒株的（疫苗图1A）。在NA基因的修改包括在蛋白质茎（残基65至72）基于PCR的置换的保守序列的一个短cDNA序列编码的鸡卵白蛋白（OVA）衍生的肽SIINFEKL（ 图1B）的。在SIINFEKL肽是在H-2b的MHC I类限制的C57BL / 6小鼠12的响应的情况下的高免疫肽。
- 板10 6 293T每孔细胞中使用的DMEM 10％胎牛血清（FBS），补充有1％青霉素/链霉素（P / E）的6孔平板上。
- 制备质粒转染混合物：添加1微克编码和的cDNA PB2，PB1，PA，NP，M NS从流感A /安阿伯/六十○分之六菌株的1μg质粒为NA编码的质粒中的每一个的-SIINFEKL和HA流感A / PR / 8/34。添加预热的OptiMEM（15微升100微升终体积/孔）。
- 孵育转染混合物30分钟，在室温。
- 添加100μl的转染混合物/孔孵育16小时，在37℃和5％的CO 2。
- 由DMEM 0.3％BSA的1％的P / E在33℃下进行5小时改变细胞培养基和5％的CO 2。
- 添加10 6流感容许MDCK细胞在含有从用L-1-Tosylamide -2-苯乙基氯甲基酮（TPCK胰蛋白酶）处理牛胰腺胰蛋白酶的1μg/ ml的DMSO中。保持293T-MDCK共培养2 - 1天在33℃和5％的CO 2。
- 在260×g离心5分钟收集的MDCK-293T细胞共培养物的上清液并明确通过离心。
- 接种9 - 10天，老鸡鸡胚在无菌条件下。要做到这一点，做一个洞蛋壳顶部由马丁内斯，Sobrido 等指示。5。
- 覆盖蛋壳机智用棉签，孵育接种鸡蛋3天在33°] C H融化的蜡。
- 收获来自感染胚卵的尿囊液：用70％的乙醇的蛋壳。具有非常平缓裂纹在上部和使用无菌镊子去除尿囊膜打开鸡蛋。用10毫升吸管收集尽可能多的流体尽可能（一般为6 - 10ml）中。离心机在260×g离心10分钟，在4℃，将清除尿囊液转移到新的管中。
2.跟踪疫苗特异性免疫
- 跟踪肽轴承树突细胞（DC）的
- 对于小鼠免疫接种，麻醉使用精密汽化器小鼠用5％异氟烷在氧气中。使用200μl的移液管施用50微升PBS中含有10 3噬斑形成单位直接表达通过液滴的SIINFEKL肽与小鼠鼻孔疫苗（PFU）。
- 三天后接种，euthaniz通过异氟烷麻醉小鼠ê其次是颈椎脱位。
- 提起小鼠皮肤略低于钳胸腔中线，并通过用剪刀剪皮肤小切口。从切口的点，使3 - 5厘米长的通过朝头部和尾部的皮肤切开，则需要两个2厘米切口从中线横向从各端。剥离背部皮肤，露出腹腔和胸腔。通过围绕腹膜以暴露胸腔膜小心切开。
- 访问纵隔切diafragma和笼肋的底部。找到并移除2纵隔淋巴结（MLNS），稍背和横向相邻胸腺，内侧相邻的头臂动脉，气管的腹侧近。
- 为了收获MLNS使用弯钳。将镊子淋巴结下方，轻轻一拉起来。放置淋巴结在一个6孔板含有1ml DMEM中，并除去任何connecti已经或脂肪组织周围的节点。
- 附加至1ml注射器2台26摹针透逗每个样品。梳理淋巴结，按住一个针头，而砸开淋巴结与其他针。若这是正确完成，浓缩细胞从淋巴结爆破在媒体容易观察。通过所有的组织材料通过70微米的尼龙过滤器，以获得单细胞悬浮液。
- 离心机单细胞悬浮液在260×g离心在冷冻离心机10分钟。重悬在2ml的红细胞溶胞（RBCL）缓冲液将细胞沉淀以裂解红血细胞。允许裂解进行3分钟在室温下。
- 通过离心分离与细胞再悬浮于2ml冰冷的PBS中和RBCL缓冲器。
- 板的细胞在100微升最终体积的U形96孔培养板以10 7个细胞/ ml的浓度。
- 流式细胞仪分析，阻断细胞的Fc受体使用1，每10 6细胞抗鼠CD16 / CD32抗体在冰上15分钟的微克。
- 离心机板和丢弃上清液板轻弹。孵育单井与选择的表面抗体结合。典型地，对于检测的树突状细胞在淋巴结中，抗体鸡尾酒应包括：0.25微克抗CD11c的，0.25微克的CD11b，0.5微克的MHC II类，0.25微克CD103的和在100的终体积0.15微克CD8α的微升。
- 为负门控，添加0.25微克的抗CD3，CD19，NK1.1或谱系混合物（ 图2A）的。备选策略门，以及对多个荧光染料适当的补偿协议，可以在免疫基因组计划的网站上找到。除了 所选择的表面标记，针对H-2K b势必SIINFEKL到鸡尾酒抗体添加1微克。这市售抗体将允许DCS I可视化ñ其中SIINFEKL肽结合表面的MHC I类
- 孵育细胞表面的抗体，在冰上30分钟。避光板。离心机板在260×g离心5分钟，并洗涤用2ml的PBS两次。转移细胞到流式细胞仪管用于分析。
- 疫苗特异性T细胞增殖评估
- 从市售的TCR转基因小鼠（OT-I小鼠）得到供体T细胞（C57BL / 6-Tg的（TCR aTcrb）1100Mjb / J），其中所有生成CD8 T细胞是特异于SIINFEKL肽。通过异氟烷麻醉颈椎脱位安乐死的小鼠。收获脾通过在腹腔进行切口。将脾/秒2毫升的DMEM /脾脏和消除结缔组织和脂肪组织。
- 产生从脾脏以下在2.1.2和2.1.3中所述的方法单细胞悬浮液。
- 进一步丰富对T细胞的单细胞悬浮液，适用于磁珠分离协议采用或正或负的甄选程序12。区分受体细胞供体，使用同类系小鼠使得例如受体小鼠表达白细胞标记CD45.1而供体的T细胞表达CD45.2 12。
- 标记的T细胞，培养他们在1ml的PBS中含有5μM的羧基琥珀酰亚胺酯（CFSE）中的5×10 6个细胞/ ml的最佳细胞密度。孵育细胞20分钟，在37℃下从曝光保护。培养后，离心细胞，在260×g离心5分钟，弃去上清，重悬细胞在3ml胎牛血清（FBS）的中和的CFSE。
- 在10分钟，重悬在PBS中的适当体积离心机细胞在260×g离心使100微升的溶液含有2×10 6个细胞。注入接受者同类系小鼠用2×10 6个细胞/经由眶后窦注射13鼠标。
- 安乐死受体小鼠在天3，4和5后疫苗接种使用异氟烷麻醉颈椎脱位。收获纵隔淋巴结和制备单细胞悬浮液用于流式细胞术如2.1.2-2.1.5指示。
- 确定供体细胞通过染色在100μl的抗体混合物含有的单细胞悬浮液：0.25微克抗小鼠CD3，CD4和CD8的抗体; 0.5抗小鼠CD45.1或CD45.2抗体（取决于供体细胞的表型）的微克。离开了FL-1通道血细胞计数打开（FITC）的流量，以确定CFSE 12（ 图2B）的稀释曲线。
3.嵌合体小鼠解剖基因特异性疫苗反应
注意：使用DTR基于小鼠模型的竞争骨髓嵌合体的产生允许的小区特定功能在疫苗的免疫反应的判别。在这里，我们显示，通过该组合DTR表达供体，c额外策略ELLS与来自敲除小鼠许可证细胞免疫在特定的细胞区室中来研究基因的特定功能。在这个例子中，我们生成小鼠特异性缺失在Langerin + CD103 +树突toll样受体3（TLR3）的。
- 骨髓供体细胞的制备
- 下II生物安全柜级别工作。通过使用专门的仪器高压灭菌，避免污染。
- 为了产生骨髓嵌合体小鼠，使用同类CD45.1 + C57BL / 6雌性小鼠为受体，并利用TLR3 - / - ，Langerin-DTR / EGFP，或重量小鼠表达CD45.2 +捐助者。使用同类系供体和受体小鼠允许供体和受体细胞通过流式细胞仪的分化，这使植入进行评估。
- 以得到供体骨髓细胞，安乐死供体小鼠用异氟烷麻醉颈椎脱位。用锋利的剪刀进行绕脚踝切口，使得并购乌斯肌肉暴露。
- 使用钝钳拔鼠皮和毛皮轻轻向臀部脚踝，使小腿的肌肉是可见的。
- 用锋利的剪刀剪腿鼠标在臀部的高度和股骨的头部上方。
- 放置腿培养皿并置于冰上。工作速度快，并删除所有的肌肉，露出骨头。
- 独立的股骨胫骨和。放置骨头在70％乙醇中的溶液5分钟，以除去可能的细菌，并立即将它们放置在含有5ml无血清DMEM的另一个培养皿。切骨端用锋利的剪刀和冲洗骨髓成DMEM。通过插入连接于5ml的注射器＆G针为此，冲洗1毫升DMEM中成骨。确保骨骼冲洗后呈现白色（空）。
- 收集在10毫升的DMEM从供体小鼠所有的骨髓细胞。通过使收获通过一个70微米的细胞过滤生成从骨髓细胞的单细胞悬浮液。
- CL骨髓细胞离心，在260×g离心10分钟，在4℃的冷冻离心机耳单细胞悬浮液。重悬细胞沉淀在10ml PBS中。耗尽使用RBCL溶液如在2.1.3和2.1.4中所述的红血细胞。
- 使用一个血球或自动细胞计数器计数骨髓细胞。通过台盼蓝染色评估13细胞活力通过测定死细胞。最佳地，一个单一的动物产量约3×10 7个白血细胞/小鼠具有至少80％的生存力。
- 在总的骨髓嵌合体的情况下，准备TLR-3 - / -或重量的供体细胞。最优细胞浓度为2×10 7个细胞/ ml，因为2×10 6个细胞在100μl的PBS将用于移植。如果不立即使用，使用慢速冷冻技术和FBS，用10％DMSO中保留的供体细胞在-80℃下。对于混合嵌合模型，混合Langerin-DTR-供体细胞和TLR3 - / -
- 小鼠照射和移植
- 照射6之间雌性小鼠 - 8周龄的铯-137源照射。给小鼠两种剂量的550弧度4小时分开。分割照射最小化急性肝毒性，因此减少小鼠致死由于照射协议。
- 照射后，养老鼠在用抗生素治疗两周。给予抗生素的饮用水在2.5 - 的拜有利/千克5毫克。
- 2 - 第二照射后4小时，移植小鼠供体骨髓细胞静脉注射。经由眶后窦注射13和异氟烷麻醉下使用的含2×10 6个细胞加入100μl的PBS最大容积进行注射的供体细胞。
- 移植后4周，评价移植的100的样品中微升外周血通过流式细胞术使用机器能够读取至少两种颜色。捐助者和广播性受体细胞之间的区别，用市售的荧光标记的CD45.1和使用1/100 1/200和稀释之间CD45.2抗鼠抗体。供体细胞的最佳植入应至少80％的总的造血细胞在外周血中。
- 疫苗接种和有针对性的枯竭
- 通过鼻内接种小鼠重组减毒活流感疫苗。对于小鼠免疫接种，麻醉使用精密汽化器小鼠用5％异氟烷在氧气中。使用200μl的移液管施用50微升PBS中含有10 3噬斑形成单位疫苗（PFU）。
- 为了产生最终的小鼠模型中，治疗的小鼠用50ng DT的稀释在50μlPBS中的鼻内给药。管理DT一滴一滴直接向麻醉小鼠的鼻孔中3.3.1说明。治疗心肌梗塞CE每日剂量开始治疗在-2天接种前一天，直到2接种后（ 图3B）。
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Representative Results
重组减毒活流感疫苗的产生可通过质粒双向启动子5的控制下编码流感病毒的八个段的转染来实现。冷适应流感疫苗通常含有冷适应株以及HA和NA选择的流感病毒株（ 如 H1N1）（ 图1A）的六个部分。冷适应的原则在33℃，在小鼠和人类14上层呼吸道（URT）的温度是基于病毒限制复制。因此，疫苗可以复制到在URT某种程度上但不能引起下呼吸道肺炎。在病毒神经氨酸苷酶（NA）的杆使用融合PCR技术，保守区被替代为一个可跟踪的OVA衍生肽（SIINFEKL）（ 图1B）。
追踪动力学研究疫苗特异性反应，我们有从疫苗制剂以及嵌合体小鼠模型得出溯源肽冤大头。之间3天和第6天的接种后，SIINFEKL承载CD103 +的DC可以在肺引流淋巴结被检测到的节点12（ 图2A）。多参数流式细胞仪允许疫苗衍生的抗原呈递的实时定量。此外，输液SIINFEKL特异性T细胞的允许疫苗特异性CD8 T细胞应答（ 图2B）定量。
疫苗接种期间评估基因的特定功能，我们设计了一个小鼠模型相结合的DTR技术和有竞争力的骨髓嵌合体（ 图3A）。通过这样做，基因功能的丧失被靶向特定细胞区室以上的免疫应答的过程中，以疫苗接种（ 图3B，C）。
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可追踪LAIVs图1.工程。（A）的克隆在双义质粒流感段（如通过Martinez的-Sobrido 等 5 PDZ骨架）被使用Lipofectamine 2000 24小时转染后转染293T细胞，从293T细胞获得的上清液被用于涂覆流感容许的Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞中的TPCK胰蛋白酶的1％的存在。在33℃进行所有的协议。从MDCK细胞的病毒上清液然后在33℃下接种到9日龄鸡胚三天。病毒救援用基于PCR的病毒基因组的扩增和测序确认。（B）的要插入的OVA衍生SIINFEKL肽进入流感神经氨酸酶（NA）的保守区（残基65至72）的A /波多黎各的NA基因的波多黎各/ 8/34（H1N1）病毒代替一个短编码cDNA通过融合的SIINFEKL肽PCR。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.疫苗追踪技术。（A）区议会栖分别在门纵隔淋巴结（MLNS）为CD11c的配有 MHC II类喜细胞。在该示例中，携带抗原的洄游CD103 +的DC被鉴定为CD103 + H-2 B -SIINFEKL +细胞通过流式细胞术。（B）中的OT-I特异性T细胞被注入到小鼠接种的同一天。四天后，将细胞从接种小鼠的淋巴结收集并评估其增殖曲线。在FL-1通道的CFSE稀释液用作细胞分裂的指示器。 CAV：冷适应疫苗; CAV SIINFEKL ：冷适应疫苗表达OVA衍生肽SIINFEKL 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.基因功能的研究。骨髓嵌合体（BMC）和疫苗接种策略（一）示意图。在表达Langerin-DTR的嵌合小鼠（-2和+2参阅DT给药前两天或疫苗接种后）。（B）的加成DT允许的洄游Langerin +树突共表达CD103在肺中特异性枯竭。（C）为比较分析疫苗特异性T细胞在嵌合体小鼠。检测NP 366-374特异性CD8 T细胞的经商业dextramer染色完成。803fig3large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在这项研究中，我们描述了如何反向遗传学和嵌合小鼠模型可用于阐明疫苗诱导的免疫的生理和分子机制。流感反向遗传学是建立在许多实验室，并发挥在了解发病的流感，复制和传输17主要作用。在我们的协议的一个关键点是表达外源抗原决定冷适应流感疫苗抢救。同时引入短的cDNA进神经氨酸苷酶的茎的策略已经由许多组，研究者需要确保没有另外的突变过程中的疫苗生产蛋和该疫苗能够复制在呼吸道而不诱导被引入肺炎5,12。由于病毒神经氨酸苷酶的两个茎以及流感基因组的其它区域，如NS基因片段和PB1段允许外来序列1的分配9,20，我们的协议的修改可用于添加其它外来肽，例如，了解针对流感病毒，一个关键点为合理的疫苗设计的T细胞免疫应答的层次结构。
通过组合可追踪疫苗和DC亚群的DTR-基于消耗我们已经能够对目标基因功能的丧失，以特定的细胞亚群。这一技术已被应用之前阐明对病原体21的免疫反应，但不解剖负责疫苗保护通路。由于DTR为基础的模型的可用性和技术产生嵌合小鼠的灵活性，该技术可以进一步扩大到附加白细胞群和基因以免疫功能。要注意的是DT治疗也可导致额外的DC亚群表达langerin如CD8α+树突在淋巴组织耗尽是很重要的。因此，强烈建议PErform剂量 - 反应研究，以评估DT治疗的效果。我们的模型的一个潜在的条件是，同种异体骨髓移植已显示减少整体抗病毒的CD8 T细胞免疫15。因此，谨慎有比较移植和非移植小鼠之间传送数据时要行使。
几个关键的人类病原体为其疫苗迫切需要可以用野生型病原体或鼠标替代物进行研究的小鼠模型。这些包括流感病毒， 疟原虫 ，和埃博拉病毒。在这项研究中提出的技术可以帮助了解实验疫苗对这些病原体，因此基本机制，理顺疫苗设计。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1x) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| OptiMEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10x | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
References
- Bevan, M. J. Understand memory, design better vaccines. Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).
- Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
- Querec, T. D. Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans. Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. 3, (2010).
- Haniffa, M. Human Tissues Contain CD141hi Cross-Presenting Dendritic Cells with Functional Homology to Mouse CD103+ Nonlymphoid Dendritic Cells. Immunity. 37, 60-73 (2012).
- Haniffa, M., Collin, M., Ginhoux, F. Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and mouse. Adv. Immunol. 120, 1-49 (2013).
- Jung, S. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17, 211-220 (2011).
- Lahl, K., Sparwasser, T. In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model. Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).
- Duffield, J. S. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J. Clin. Invest. 115, 56-65 (2005).
- Meredith, M. M. Expression of the zinc finger transcription factor zDC. J. Exp. Med. 209, 1153-1165 (2012).
- Girón, J. V. Mucosal Polyinosinic-Polycytidylic Acid Improves Protection Elicited by Replicating Influenza Vaccines via Enhanced Dendritic Cell Function and T Cell Immunity. J. Immunol. 193, 1324-1332 (2014).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. bib.usb.ve. , (1983).
- Cox, R. J., Brokstad, K. A., Ogra, P. Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines. Scand. J. Immunol. 59, 1-15 (2004).
- Gowdy, K. M. Impaired CD8(+) T cell immunity after allogeneic bone marrow transplantation leads to persistent and severe respiratory viral infection. Transpl. Immunol. 32, 51-60 (2015).
