Introduction
疾患の非存在下での免疫記憶の発生を効率的にワクチン接種1の生理学的基礎です。近年、システム生物学に基づくアプローチは、順番に、リードが抗原の活性化を多系列ためにどのような黄熱病ワクチンとして成功したワクチンは、強力な自然免疫応答の誘導および樹状細胞（DC）のいくつかのサブセットの活性化を誘導することを明らかにしました特異的T細胞の2,3。 DCは、抗原特異的ナイーブT細胞4を活性化する能力を持つ唯一の免疫細胞集団であるため、ワクチン接種時にその機能の研究は、ワクチンに対する免疫応答を理解し、挑戦的な病原体に対する今後の戦略を設計することが重要です。
ワクチンに対する免疫応答の間に別のDCのサブセットのトレースはリンパ組織へのDCの遊走の正確な速度を確立するために望ましいであろうため、提供することを可能にするシステムワクチン特異的適応免疫の開始を担う生理学的メカニズムへの洞察。逆遺伝学ベースのアプローチは、この目的に実験的に使用することができる修飾された、生弱毒化ワクチンを生成するための可能性を提供します。インフルエンザ研究に実装するので、プラスミドベースの逆遺伝学は広くLAIVs含む組換えインフルエンザ株を生成するために使用されてきました。組換えインフルエンザウイルスを救出するための標準的なプロトコルは、（マディンダービーイヌ腎臓として許容システムでは8個のインフルエンザウイルスのセグメントと同様に増幅を含む（正と負の両方のセンスRNAを産生する）アンビセンスプラスミドを有する高度のトランスフェクト細胞株の多トランスフェクションを必要としますMDCK）細胞および/ またはニワトリ孵化卵5。しかし、ワクチン接種の免疫機構を研究するための分子ツールを生成するための逆遺伝学の適用が未開拓のままです。
世代DCを含む免疫細胞サブセットの特定の枯渇を可能にする新しいマウスモデルの、ワクチン誘発保護の根底にある基本的な免疫機構を理解するための新たな可能性を開きました。マウスおよびヒトにおけるDCサブセット機能との比較、大幅に、マウスおよびヒトDCは機能的に相同6,7であることがこれらの調査結果を明らかにした、強力にマウスモデルの開発は、定常状態でのDCの特定の枯渇を可能にすることを示唆していますおよび炎症状態の間、ヒトにおけるDC応答の生理を理解するために役立つことができます。近年、マウスモデルの数は、目的8,9の遺伝子のプロモーター領域の制御下にサルジフテリア毒素（DT）受容体（DTR）を発現する導入遺伝子を保有する生成されています。マウス組織が自然にDTRを発現しないので、これらのモデルはDTでマウスの接種時に対象となる標的遺伝子を有する細胞サブセットの条件枯渇を可能にします。したがって、我々のabili生理学的プロセスの間に、生体内で特定のDCおよび他の白血球を枯渇させるTYは、大幅にDTRベースのROの開発によって強化されました。これらのトランスジェニックマウスモデルは、免疫系の個体発生を理解するために広く使用されているがしかし、ワクチン開発への応用はほとんどテストされていません。ここでは、インフルエンザの逆遺伝学とDTRベースの競争骨髄キメラを組み合わせることによって、我々は、in vivoでのワクチンに対する免疫応答の間にワクチン免疫の動態ならびに個々の遺伝子機能を研究するための方法を提案します。挑戦的な感染症に対する新たなワクチンの前臨床評価のためのこの技術の適用は、ワクチン設計を合理化し、in vivoでのワクチン候補をテストするために助けることができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
動物実験は承認されたプロトコルに従って、およびドイツの動物保護法のガイドラインに従って行いました。動物実験を実施するすべてのスタッフは、カテゴリB又は欧州実験動物学連盟のCに応じた研修プログラムに合格しました。
逆遺伝学による組換え弱毒インフルエンザワクチンの1世代
注：逆遺伝学による組換えインフルエンザウイルスを生成するための詳細なプロトコールは、以前の研究5によって説明され、本報告書の範囲外であるされています。簡単に言えば、低温適合性インフルエンザワクチンの救出（CAV）はバイオセーフティーレベル2（BSL2）の封じ込め下バイオセーフティクラスIIキャビネットで行われ、以下に詳述する手順が含まれています。トランスフェクションおよび感染プロトコルは、それを次の マルティネス-Sobrido ら 5。
- 再集合体低温適応性インフルエンザの生成背景として低温適合株A / PR / 8/34（H1N1）株のA /アナーバー/ 60分の6（H2N2）、ならびに赤血球凝集素（HA）および変性ノイラミニダーゼ（NA）を（使用して、ワクチン図1A）。 NA遺伝子における修飾は、ニワトリオボアルブミン（OVA）由来のペプチドSIINFEKL（ 図1B）をコードする短いcDNA配列によるタンパク質の茎（残基65から72）で保存された配列のPCRベースの交換で構成されています。 SIINFEKLペプチドは、C57BL / 6マウス12の応答をI制限H-2B MHCクラスの文脈において非常に免疫優性ペプチドです。
- プレート1％ペニシリン/ストレプトマイシン（P / E）を補充したDMEM、10％ウシ胎児血清（FBS）を使用して、6ウェルプレート中のウェルあたり10 6個の 293T細胞。
- プラスミドトランスフェクション混合物を準備します。追加NAをコードするPB2、PB1、PA、NP、M、NSインフルエンザからのA /アナーバー/ 60分の6株についてのcDNAおよびプラスミド1μgのをコードするプラスミドのそれぞれ1μgの-SIINFEKLとインフルエンザA / PR / 8/34からのHA。追加予め温めておいたOptiMEM（100μl/ウェルの最終容量15μL）。
- RTで30分間トランスフェクション混合物をインキュベートします。
- ウェル/トランスフェクションミックスの100μLを加え、37℃で16時間、5％CO 2インキュベートします。
- 5時間、CO 2を 33℃で、DMEM、0.3％BSA、1％のP / Eで細胞培地を変更し、5％。
- L-1-トシルアミド-2-フェニルエチルクロロメチルケトン（TPCKトリプシン）で処理されたウシ膵臓からのトリプシンを1μg/ mlを含むDMSO中に10 6インフルエンザ許容MDCK細胞を追加します。 33℃で3日間、5％CO 2 - 2のための293T-MDCK共培養を維持します。
- MDCK-293T細胞の共培養物の上清を収集し、5分間、260×gで遠心分離することによって明らかにされます。
- 無菌状態で10日齢の鶏孵化卵 - 9を接種します。マルティネス-Sobrido らによって示されるようにこれを行うには、卵殻の上部に穴を作る。5。
- 卵殻ウィットをカバーhは綿棒を使用して、ワックスを溶融し、33℃で3日間接種鶏の卵をインキュベートします。
- 感染した孵化卵から尿膜液を収穫：70％エタノールで卵の殻を洗ってください。非常に穏やか上部に亀裂や滅菌ピンセットを使用して尿膜を除去して、卵を開きます。 （ - 10ミリリットル、通常、6）できるだけ多くの流体を収集するために10ミリリットルのピペットを使用してください。 4℃で10分間、260×gで遠心分離し、新しいチューブにクリア尿膜液を移します。
2.トラッキングワクチン特異的免疫
- ペプチド担持樹状細胞（DC）のトレース
- マウスのワクチン接種のために、精密な気化器を使用して、酸素中5％イソフルランでマウスを麻酔。マウスの鼻の穴に直接液滴を介して、SIINFEKLペプチドを発現するワクチンの10 3プラーク形成単位（PFU）を含む50μlのPBSを投与するために200μlのピペットを使用してください。
- 三日後、ワクチン接種、euthanizイソフルラン麻酔を経由して電子マウスは頸椎脱臼が続きます。
- 鉗子でちょうど胸郭の下に正中線にマウスの皮膚を持ち上げ、ハサミで皮膚を通して小さな切開をカット。長さ5cm、各端部から横方向に正中線から、次に、先頭と末尾の両方に向かって皮膚を介して2つの2cmの切開をカット - 切開の観点から、3が作ります。ピールバックスキンは、腹膜および胸腔を明らかにしました。慎重に胸部を露出させるために腹膜を囲む膜を切断。
- 縦隔にアクセスするにはdiafragmaとケージリブの底を切りました。気管の腹側の近くに、腕頭動脈に内側に隣接して、わずかに背側と横方向に胸腺に隣接し、2縦隔リンパ節（mLNs）を検索し、削除します。
- mLNsを採取するためには、湾曲した鉗子を使用しています。リンパ節の下に鉗子を置き、静かにそれらをプルアップします。 1mlのDMEMを含む6ウェルプレート中のリンパ節を配置し、任意のconnectiを削除VEのか、ノードの周囲の脂肪組織。
- 1ミリリットル注射器に取り付けられた2つの26 G針で十分に各サンプルをいじめます。他の針でリンパ節を開いて壊しながらリンパ節をいじめるために、一方の針でそれを押したままにします。これが正しく行われた場合、リンパ節から濃縮された細胞の破裂を容易培地において観察されます。単一細胞懸濁液を得るために、70μmのナイロンフィルターを通してすべての組織材料を渡します。
- 冷却遠心機で260×gで10分間遠心操作し、単一細胞懸濁液。赤血球を溶解するために赤血球細胞溶解（RBCL）緩衝液2ml中の細胞ペレットを再懸濁します。溶解は室温で3分間進行させます。
- 氷冷PBSの2ミリリットルで遠心分離し、細胞の再懸濁を介しRBCLバッファを中和します。
- 100μlの最終容量で10 7細胞/ mlの濃度のU字型96ウェルプレート中のプレートの細胞。
- フローサイトメトリー分析のために、使用して細胞のFc受容体をブロックします氷上で15分間、10 6個の細胞あたり抗マウスCD16 / CD32抗体1μgの。
- 遠心プレートとプレートフリックにより上清を捨てます。選択の表面抗体の組み合わせで個々のウェルをインキュベートします。典型的には、リンパ節における樹状細胞の検出のために、抗体カクテルが含まれている必要があります0.25抗CD11cのμgの、CD11bの0.25μgの、MHCクラスII0.5μgの、CD1030.25μgのと100の最終容量でCD8αの0.15μgのをμlの。
- 負のゲーティングのために、抗CD3、CD19、NK1.1または系統カクテル（ 図2A）の0.25μgのを追加します。代替ゲーティング戦略だけでなく、複数の蛍光色素の適切な補償のためのプロトコルは、免疫学的ゲノム·プロジェクトのウェブサイトで見つけることができます。選択の表面マーカーに加えて、カクテルにSIINFEKLに結合したH-2K b のに対する抗体の1μgのを追加します。この市販の抗体は、DC私の可視化を可能にしますSIINFEKLペプチドは、MHCクラスIを表面に結合するN
- 氷上で30分間、表面抗体で細胞をインキュベートします。光からプレートを保護します。 5分間260×gで遠心分離板及び2mlのPBSで2回洗浄します。分析のためのフローサイトメトリー管を流れるように細胞を転送します。
- ワクチン特異的T細胞の増殖の評価
- 生成されたすべてのCD8 T細胞は、SIINFEKLペプチドに特異的である、市販のTCRトランスジェニックマウス（OT-Iマウス）（C57BL / 6-Tgは（TCR aTcrb）1100Mjb / J）からドナーT細胞を得ます。頸椎脱臼が続くイソフルラン麻酔によりマウスを安楽死させます。腹腔の切開を行うことによって収穫脾臓。 DMEM /脾臓の2mlに脾臓/秒を置き、結合して脂肪組織を除去。
- 2.1.2および2.1.3に記載の手順に従って、脾臓から単一細胞懸濁液を生成します。
- さらに、T細胞上の単一細胞懸濁液を富化するために、磁気ビーズ分離プロトコルを適用します正または負の選択手順12を使用して。ドナーT細胞は、CD45.2 12を表現しながら、例のレシピエントマウスは、白血球マーカーCD45.1を発現するためのように、レシピエント細胞からドナーを区別するために、コンジェニックマウスを使用します。
- T細胞を標識するために、5×10 6細胞/ mlの最適な細胞密度にカルボキシスクシンイミジルエステル（CFSE）の5μMを含む1mlのPBSでそれらをインキュベートします。露光から保護し、37℃で20分間細胞をインキュベートします。インキュベートした後、5分間260×gで遠心細胞、上清を廃棄し、細胞を再懸濁する3ml中のウシ胎児血清（FBS）CFSEを中和します。
- PBSの十分な容量で10分間再懸濁中260×gで遠心細胞溶液100μlを2×10 6個の細胞を含むように。眼窩洞注入13を介して2×10 6細胞/マウスと受信者のコンジェニックマウスを注入。
- 日3,4,5後にレシピエントマウスを安楽死させます頸椎脱臼が続くイソフルラン麻酔を使用して、ワクチン接種。縦隔リンパ節を採取し、2.1.2-2.1.5に示されるように、フローサイトメトリーのための単一細胞懸濁液を調製します。
- を含む抗体カクテル100μl中の単一細胞懸濁液の染色によってドナー細胞を特定します。抗マウスCD3、CD4とCD8抗体0.25μgのを。抗マウスCD45.1またはCD45.2抗体（ドナー細胞の表現型に依存する）の0.5μgの。 CFSE 12（ 図2B）の希釈プロファイルを決定するためにオープン（FITC）フローサイトメーターのFL-1チャネルのままにしておきます。
遺伝子特異的ワクチンの応答を分析する3。キメラマウス
注記：DTRベースのマウスモデルを使用して、競争力のある骨髄キメラの生成は、ワクチンに対する免疫応答の間の細胞特異的な機能の識別を可能にします。ここでは、DTRを発現するドナーCの追加の戦略によって組み合わせを表示します特定の細胞区画における免疫間の遺伝子の特定の機能を研究するためのノックアウトマウスが許すから細胞とells。例では、ランゲリン+ CD103 + DCにおけるToll様受容体3（TLR3）の特定の欠失を有するマウスを作製します。
- 骨髄ドナー細胞の調製
- バイオセーフティーレベルIIキャビネットの下で働きます。排他的にオートクレーブ処理機器を使用して、汚染を避けます。
- 、骨髄キメラマウスを作製するレシピエントとしてコンジェニックCD45.1 + C57BL / 6雌マウスを使用して、TLR3使用するには- / - 、ランゲリンDTR / EGFP、またはwtマウスは、ドナーとしてCD45.2 +を発現します。コンジェニックドナーとレシピエントマウスを使用したフローサイトメトリーを介して、ドナーとレシピエント細胞の分化を可能にし、これは、移植を評価することを可能にします。
- ドナー骨髄細胞を得るために、頸椎脱臼が続くイソフルラン麻酔でドナーマウスを安楽死させます。鋭いハサミは足首の周りの切開を行うとMとなるようウーズの筋肉組織が露出しています。
- 脚の筋肉が表示されるように鈍鉗子を使用すると、腰に向かって足首から静かにマウスの皮膚や被毛を引っ張ります。
- 鋭いハサミで腰の高さにし、大腿骨の頭の上にマウスの足を切りました。
- ペトリ皿の上に、氷上に足を置きます。高速に動作し、骨を露出させるために、すべての筋肉を削除します。
- 個別の大腿骨と脛骨。可能な細菌を除去し、無血清DMEM 5 mlを含む別のペトリ皿の上にすぐにそれらを配置するために5分間の70％エタノール溶液中に骨を置きます。骨は鋭いハサミを使用して終了カットし、DMEMに骨髄をフラッシュします。 5ミリリットルの注射器に取り付けられた26 Gの針を挿入することにより、骨に、そのDMEMのフラッシュ1ミリリットルをすることができません。骨がフラッシングした後、（空の）白に見えていることを確認します。
- DMEM 10ml中のドナーマウスからすべての骨髄細胞を収集します。 70μmのセルストレーナーを通して収穫を通過させることにより骨髄細胞の単一細胞懸濁液を生成します。
- CL冷却遠心機で4℃で10分間、260×gで遠心分離することにより骨髄細胞の耳単一細胞懸濁液。 10mlのPBSで再懸濁細胞ペレット。 2.1.3及び2.1.4に記載したようにRBCL溶液を用いて赤血球細胞を枯渇させます。
- 血球計数器または自動セルカウンターのいずれかを使用して骨髄細胞をカウントします。トリパンブルー染色13を介して死細胞の決意によって、細胞生存率を評価します。最適には、少なくとも80％の生存率を持つ単一の動物利回り約3×10 7白血球細胞/マウス。
- - / -または重量ドナー細胞の総骨髄キメラの場合には、TLR-3を準備します。 100μlのPBS中の2×10 6細胞を移植のために使用されるので、最適な細胞濃度が2×10 7細胞/ mlです。すぐに使用しない場合は、10％DMSOで緩慢凍結法とFBSを用いて、-80℃でドナー細胞を保存します。混合キメラモデルでは、ランゲリンDTR-ドナー細胞とを混合TLR3 - / -
- マウスの照射および移植
- セシウム137のソース照射で生後8週 - 6との間の雌マウスに照射されます。マウスを4時間離れて550ラドの2つの用量を与えます。分割照射は、急性肝毒性を最小限に抑えるため、照射プロトコルによるマウスの致死率を減少させます。
- 照射後、2週間の抗生物質で治療を受けたマウスを保持します。バイトリル/ kgを5 mgの - 2.5で飲料水に抗生物質を与えます。
- 2 - 第2の照射後4時間、静脈内にドナーの骨髄細胞を用いた移植マウス。 2×10 6個の細胞を含む100μlのPBSの最大容量を使用して、眼窩洞注入13を介して、およびイソフルラン麻酔下でドナー細胞の注入を行います。
- 四週間の移植後、100のサンプルで生着を評価します少なくとも2つの色を読み取ることができる装置を用いて、フローサイトメトリーを介して、末梢血のマイクロリットル。ドナーと放射線耐性レシピエント細胞を区別するために、100分の1と1/200の間で希釈液を用いて、市販の蛍光標識CD45.1およびCD45.2抗マウス抗体を使用しています。ドナー細胞の最適な移植は、末梢血中の全造血細胞の少なくとも80％であるべきです。
- ワクチン接種および標的に枯渇
- 鼻腔を介して組換え生弱毒化インフルエンザワクチンをマウスにワクチン接種します。マウスのワクチン接種のために、精密な気化器を使用して、酸素中5％イソフルランでマウスを麻酔。ワクチンの10 3プラーク形成単位（PFU）を含む50μlのPBSを投与するために200μlのピペットを使用してください。
- 最終的なマウスモデルを生成するには、鼻腔内に50μlのPBS中に希釈したDT 50ngのでマウスを治療します。 3.3.1で説明したように麻酔したマウスの鼻孔に直接ドロップすることによりDT降下を管理します。マイルを扱います2日目ワクチン接種後（ 図3B）までワクチン接種前日-2で治療を開始する日用量でCE。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
組換え生弱毒化インフルエンザワクチンの生成は、双方向性プロモーター5の制御下でインフルエンザウイルスの8つのセグメントをコードするプラスミドをトランスフェクトすることによって達成することができます。低温適応インフルエンザワクチンは通常、低温適応株と同様に、任意のインフルエンザ株のHAとNA（ 例えば 、H1N1）（ 図1A）の6つのセグメントが含まれています。冷適応の原理は、33°C、マウスとヒト14における上部気道（URT）の温度で、ウイルス制限の複製に基づいています。したがって、ワクチンは、URTである程度複製することができますが、下気道の肺炎を引き起こすことはできません。融合PCR技術を使用して、ウイルスのノイラミニダーゼ（NA）のステムで保存された領域を追跡可能OVA由来ペプチド（SIINFEKL）（ 図1B）に置換しました。
動態研究におけるワクチン特異的応答を追跡するために我々が持っていますワクチン製剤に由来しトレーサブルペプチドならびにキメラマウスモデルを活用して。 3日目及び6ワクチン接種後の間に、SIINFEKL担持CD103 + DCは、肺流入領域リンパ節12（ 図2A）で検出することができます。マルチパラメトリックフローサイトメトリーは、リアルタイムで、ワクチン由来の抗原提示の定量化を可能にします。また、SIINFEKL特異的T細胞の注入は、ワクチン特異的CD8 T細胞応答（ 図2B）の定量化を可能にします。
ワクチン接種時に遺伝子特異的機能を評価するために、我々は、DTR技術と競争力のある骨髄キメラ（ 図3A）を組み合わせたマウスモデルを考案しました。そうすることにより、遺伝子機能の喪失は、ワクチン接種に対する免疫応答の経過（ 図3B、C）上の特定の細胞区画に標的化しました。
52803 / 52803fig1.jpg "/>
トレーサブルLAIVs図1エンジニアリング。アンビセンスプラスミドにクローニングされた（A）インフルエンザのセグメント（マルティネス- Sobrido らによって記載されているように、PDZ骨格は5）を 、トランスフェクション後に293T細胞から得た上清を、リポフェクタミン2000、24時間を使用して293T細胞にトランスフェクトしました。 TPCKトリプシンの1％の存在下で被覆インフルエンザ許容Madin-Darbyイヌ腎臓（MDCK）細胞を用いました。すべてのプロトコルは、33℃で行いました。 MDCK細胞からのウイルス上清は、その後、33℃で3日間、9日齢の発育鶏卵に接種しました。ウイルス救済は、インフルエンザノイラミニダーゼ（NA）にOVA誘導SIINFEKLペプチドを挿入する（B）。PCRベースのウイルスゲノムの増幅および配列決定によって確認、保存された領域（残基65から72）A /ドミニカのNA遺伝子のましたプエルトリコ/ 8/34（H1N1）ウイルスは、融合を介しSIINFEKLペプチドをコードするcDNAの短い置換しましたPCR。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2.ワクチン技術を追跡する。（A）渡りDCはCD11cのmedが 、MHCクラスII hi細胞などの縦隔リンパ節（mLNs）でゲートしました。例では、抗原担持遊走CD103 + DCを、フローサイトメトリーによりCD103 + H-2 B -SIINFEKL +細胞として同定された。（B）OT-I特異的T細胞は、ワクチン接種と同じ日に、マウスに注入しました。 4日後、細胞をワクチン接種したマウスのリンパ節から採取し、それらの増殖特性を評価しました。 FL-1チャネル上のCFSE希釈は、細胞分裂の指標として使用しました。 CAV：低温適応ワクチン; CAV SIINFEKL ：OVA由来SIINFEKLペプチドを発現する低温適応ワクチン。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3.遺伝子機能研究。骨髄キメラ（BMC）とワクチン接種戦略の（A）概略図。ランゲリンDTRを発現するキメラマウスではDTの（-2と+2は二日前またはワクチン接種後DTの管理を参照してください）。（B）添加は渡り鳥ランゲリン+ DCは、肺にCD103を共発現の特定の枯渇を可能にします。（C）比較キメラマウスにおけるワクチン特異的T細胞の分析。 NP 366-374特異的CD8 T細胞の検出は、商業dextramer染色を介して行われました。803fig3large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本研究では、ワクチン誘導免疫の生理学的および分子メカニズムを解明するために利用することができますどのように逆遺伝学およびキメラマウスモデルについて説明します。インフルエンザ逆遺伝学は、多くの研究室で確立され、インフルエンザ発病、複製、および伝送17を理解する上で主な役割を果たしてきました。我々のプロトコルで重要な点は、外来エピトープを発現する寒冷適応インフルエンザワクチンの救助です。ノイラミニダーゼの茎に短いcDNAを導入する戦略は、多くのグループによって説明してきたが、研究者は、追加の突然変異が卵にワクチン製造中に導入されていないことを確認する必要があり、ワクチンが誘導することなく、気道で複製することが可能であること肺炎5,12。ウイルスノイラミニダーゼの茎ならびにNS遺伝子セグメントとPB1セグメントとしてインフルエンザゲノムの他の領域の両方は、外来配列の割り当てを可能にするので、19,20、我々のプロトコルの改変は、例えば、インフルエンザウイルスに対するT細胞免疫応答、合理的なワクチン設計のための重要なポイントの階層を理解するために追加の外来ペプチドを追加するために利用することができます。
追跡可能なワクチンおよびDCサブセットのDTRベース枯渇を組み合わせることにより、我々は、特定の細胞サブセットの遺伝子機能の喪失を標的とすることができました。この技術は、病原体21に対する免疫応答を解明する前に適用されているが、ワクチンの保護を担う経路を分析するものではありません。によりDTRベースのモデルの利用可能性およびキメラマウスを作製するための技術の柔軟性のために、この技術は、さらに、免疫機能を有する付加的な白血球集団および遺伝子に拡張することができます。これは、DTの治療はまた、リンパ組織で、このようなCD8α+ DCのようなランゲリンを発現している追加のDCサブセットの枯渇につながる可能性があることに留意することが重要です。従ってそれは非常にPEにお勧めしますDT治療の効果を評価するための用量応答試験をrform。我々のモデルの潜在的な注意点は、同種骨髄移植は、全体的な抗ウイルスCD8 T細胞免疫15を減少させることが示されていることです。移植と非移植マウスの間でデータを比較する際にこのように、注意が払われなければなりません。
ワクチンが緊急に必要とされるいくつかの重要なヒト病原体は、野生型の病原体またはマウス代用物を用いてマウスモデルで研究することができます。これらは、インフルエンザウイルス、 マラリア原虫 、およびエボラウイルスを含みます。本研究で提案された技術は、ワクチン設計を合理化するために、したがって、これらの病原体とに対する実験的ワクチンの基本的なメカニズムを理解するのを助けることができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1x) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| OptiMEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10x | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
References
- Bevan, M. J. Understand memory, design better vaccines. Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).
- Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
- Querec, T. D. Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans. Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. 3, (2010).
- Haniffa, M. Human Tissues Contain CD141hi Cross-Presenting Dendritic Cells with Functional Homology to Mouse CD103+ Nonlymphoid Dendritic Cells. Immunity. 37, 60-73 (2012).
- Haniffa, M., Collin, M., Ginhoux, F. Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and mouse. Adv. Immunol. 120, 1-49 (2013).
- Jung, S. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17, 211-220 (2011).
- Lahl, K., Sparwasser, T. In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model. Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).
- Duffield, J. S. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J. Clin. Invest. 115, 56-65 (2005).
- Meredith, M. M. Expression of the zinc finger transcription factor zDC. J. Exp. Med. 209, 1153-1165 (2012).
- Girón, J. V. Mucosal Polyinosinic-Polycytidylic Acid Improves Protection Elicited by Replicating Influenza Vaccines via Enhanced Dendritic Cell Function and T Cell Immunity. J. Immunol. 193, 1324-1332 (2014).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. bib.usb.ve. , (1983).
- Cox, R. J., Brokstad, K. A., Ogra, P. Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines. Scand. J. Immunol. 59, 1-15 (2004).
- Gowdy, K. M. Impaired CD8(+) T cell immunity after allogeneic bone marrow transplantation leads to persistent and severe respiratory viral infection. Transpl. Immunol. 32, 51-60 (2015).
