Introduction
Die Erzeugung von immunologischen Gedächtnisses in Abwesenheit der Krankheit ist die physiologische Grundlage für die effektive Impfung 1. In jüngster Zeit Systeme biologischer Ansätze haben gezeigt, dass eine erfolgreiche Impfstoffe wie die Gelbfiebervakzin, induzieren eine starke Induktion der angeborenen Immunantwort und Aktivierung verschiedener Untergruppen von dendritischen Zellen (DCs), die wiederum führen zur Aktivierung der antigen multilineärer spezifische T-Zellen 2,3. Da DCs sind die einzigen Immunzellpopulation mit der Fähigkeit, Antigen-spezifische T-Zellen naive 4 zu aktivieren, ist die Untersuchung von deren Funktion bei der Impfung kritisch für die Immunantwort auf Impfstoffe zu verstehen und zukünftige Strategien gegen herausfordernde Pathogene zu entwickeln.
Ein System, Rückverfolgung von verschiedenen DCs Teilmengen während der Immunantwort auf Impfstoffe wären wünschenswert, um eine genaue Kinetik der DC Migration auf lymphatischen Gewebe zu schaffen, und es daher,Einblick in die physiologischen Mechanismen für die Einleitung der Impfstoff-spezifischen adaptiven Immunität verantwortlich. Reverse Genetik basierte Ansätze bieten die Möglichkeit, modifizierte erzeugen attenuierten Impfstoffen, die experimentell mit diesem Zweck verwendet werden können. Seit ihrer Umsetzung am Influenza-Forschung hat Plasmid-basierte reversen Genetik weit verbreitet eingesetzt worden, um rekombinante Influenza-Stämme einschließlich LAIVs generieren. Standardprotokolle zur Rettung rekombinanten Influenza-Viren erfordern Mehr Transfektion von hoch transfektierbare Zelllinien mit AmbiSense Plasmide (Herstellung von positiven und negativen Sinn RNA), welche die acht Influenzavirus-Segmente sowie Verstärkung in eine permissive System wie Madin-Darby canine kidney ( MDCK-Zellen) und / oder Huhn embryonierten Eiern 5. Die Anwendung der reversen Genetik, molekulare Werkzeuge, um die Immunmechanismen der Impfung zu untersuchen erzeugen bleibt unerforscht.
Die Erzeugungneuer Mausmodelle ermöglicht spezifische Depletion von Immunzellpopulationen, einschließlich DCs hat neue Möglichkeiten eröffnet, um die grundlegenden Immunmechanismen durch Impfung hervorgerufen Schutz zugrunde zu verstehen. Der Vergleich zwischen DC Teilfunktionen in Mäusen und Menschen haben gezeigt, dass, in einem großen Ausmaß, Maus und Mensch DCs sind funktionell homolog 6,7 diese Ergebnisse stark darauf hin, dass die Entwicklung eines Maus-Modelle erlauben spezifische Depletion der DC in dem stationären Zustand und bei entzündlichen Erkrankungen, kann dazu dienen, die Physiologie der DC Reaktionen in Menschen zu verstehen. In den letzten Jahren eine Reihe von Mausmodelle erzeugt worden Durchführung Transgene Simian Diphtherietoxin (DT) Rezeptor (DTR) unter der Kontrolle der Promotorregion eines Gens von Interesse exprimieren 8,9. Seit Mausgeweben nicht natürlich auszudrücken DTR, diese Modelle zu ermöglichen bedingte Erschöpfung der Zell-Untergruppen trägt die gezielte Gen von Interesse auf der Maus Inokulation mit DT. Damit unsere ability, spezifische DCs und anderen Leukozyten in vivo bei physiologischen Prozessen führen, wurde stark von der Entwicklung der DTR-basierten ro verbessert. Während jedoch diese transgenen Mausmodelle sind sehr häufig benutzt worden, um die Ontogenese des Immunsystems zu verstehen, deren Anwendung auf die Entwicklung von Impfstoffen wurde kaum getestet. Hier wird durch die Kombination von Influenza reversen Genetik und DTR-basierten Wettbewerbsknochenmarkchimären, schlagen wir eine Methode, um die Kinetik der Impfstoff die Immunität als auch einzelne Gen-Funktion während der Immunantwort auf Impfstoffe in vivo zu untersuchen. Die Anwendung dieser Technologie für die präklinische Evaluierung neuer Impfstoffe gegen Infektionskrankheiten anspruchs könnte helfen, Impfstoffentwicklung zu rationalisieren und Impfstoffkandidaten in vivo zu testen.
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Protocol
Tierversuche wurden nach anerkannten Protokollen und nach den Richtlinien des Deutschen Tierschutzgesetz durchgeführt. Alle Mitarbeiter Durchführung von Tierversuchen geführt Trainingsprogramme nach Kategorie B oder C der Federation of European Laboratory Animal Science Associations.
1. Erzeugung rekombinanter lebenden attenuierten Influenza-Impfstoffe durch reverse Genetik
HINWEIS: Die ausführliche Protokoll für die Erzeugung von rekombinanten Grippeviren durch reverse Genetik wurde von früheren Studien 5 beschrieben worden ist und aus dem Rahmen dieses Berichts. Kurz gesagt, Rettung der kälteangepassten Influenza-Impfstoffe (CAV) in einem biologischen Sicherheitsschrank der Klasse II unter Biosicherheitsstufe 2 (BSL2) Containment durchgeführt und beinhaltet Schritte unten detailliert beschrieben. Die Transfektion und Infektion Protokoll folgt, daß der Martinez-Sobrido et al. 5.
- Generieren Sie eine Reassortante kälteangepassten InfluenzaImpfstoff mit als Hintergrund die kälteangepassten Stamm A / Ann Arbor / 6/60 (H2N2), sowie die Hämagglutinin (HA) und ein modifiziertes Neuraminidase (NA) des A / PR / 8/34 (H1N1) Stamms ( 1A). Die Abwandlung in der NA-Gen besteht aus einem PCR-basierten Austausch einer konservierten Sequenz im Protein Stiel (Reste 65 bis 72) durch einen kurzen cDNA-Sequenz, die Hühner-Ovalbumin (OVA) abgeleitetes Peptid SIINFEKL (1B) kodiert. Das SIINFEKL-Peptid ist ein hochimmundominanten Peptids in Zusammenhang mit der H-2b-MHC-Klasse-I-restringierte Antwort von C57BL / 6-Mäusen 12.
- Platte 10 6 293T-Zellen pro Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen mit DMEM 10% fötalem Rinderserum (FBS) mit 1% Penicillin / Streptomycin (P / E) ergänzt.
- Vorbereitung Plasmid Transfektionsgemisch: 1 & mgr; g von jedem der Plasmide cDNAs für PB2, PB1, PA, NP, M, NS vom Influenza A / Ann Arbor / 6/60-Stamm, und 1 ug der Plasmide für die NA kodieren -SIINFEKL undHA von Influenza-A / PR / 8/34. Add vorgewärmtem OptiMEM (15 & mgr; l für ein Endvolumen von 100 ul / Vertiefung).
- Inkubieren Transfektionsmischung für 30 min bei RT.
- 100 l Transfektionsmischung / Vertiefung und Inkubation für 16 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Ändern Zellmedium durch DMEM 0,3% BSA 1% P / E bei 33 ° C und 5% CO 2 für 5 Stunden.
- Werden 10 6 Influenza permissive MDCK-Zellen in DMSO, enthaltend 1 ug / ml Trypsin aus Rinderpankreas mit L-1-Tosylamid-2-phenylethyl-chlormethylketon (TPCK-Trypsin) behandelt. Die 293T-MDCK Co-Kulturen für 2 zu halten - 3 Tage bei 33 ° C und 5% CO 2.
- Sammeln Ständen von MDCK-293T Zell Kokulturen und klar durch Zentrifugation bei 260 × g für 5 min.
- Impfen 9 - 10 Tage alten Hühner befruchteten Eiern in sterilen Bedingungen. Um dies zu tun, machen Sie ein Loch an der Spitze der Eierschale, wie Martinez-Sobrido et al. 5 angedeutet.
- Decken Sie die Eierschale with geschmolzenes Wachs mit einem Wattestäbchen und bebrüten die geimpft Hühnereiern für 3 Tage bei 33 ° C.
- Ernten Sie die Allantoisflüssigkeit aus infizierten bebrüteten Eiern: Waschen Sie die Eierschalen mit 70% Ethanol. Öffnen Sie das Ei mit einem sehr sachte knacken im oberen Teil und nehmen Sie die Allantois-Membran unter Verwendung einer sterilen Pinzette. Verwenden Sie eine 10 ml-Pipette, um so viel Flüssigkeit wie möglich zu sammeln (in der Regel 6 bis 10 ml). Zentrifuge bei 260 × g für 10 min bei 4 ° C geklärt Allantoisflüssigkeit übertragen in neue Röhrchen.
2. Tracking-Impfstoff-spezifische Immunität
- Tracing von Peptid-tragenden dendritischen Zellen (DCs)
- Für Maus-Impfung, betäuben Mäuse mit 5% Isofluran in Sauerstoff unter Verwendung eines Präzisions-Verdampfer. Verwenden eine 200 ul-Pipette 50 ul PBS, enthaltend 10 3 Plaque-bildende Einheiten (pfu) der Impfstoff das SIINFEKL-Peptid über Tröpfchen direkt exprimieren den Maus Nase zu verabreichen.
- Drei Tage nach der Impfung, euthanize Mäusen über Isoflurananästhesie durch Genickbruch folgte.
- Heben Sie die Haut von Mäusen an der Mittellinie direkt unter dem Brustkorb mit einer Pinzette und schneiden Sie einen kleinen Schnitt durch die Haut mit einer Schere. Unter dem Aspekt der Einschnitt, machen Sie eine 3-5 cm lange durch die Haut in Richtung sowohl Kopf und Schwanz von jedem Ende geschnitten, dann zwei 2 cm Einschnitte von der Mittellinie seitlich. Ziehen Sie die Haut um die Peritonealdialyse und Brusthöhle zu offenbaren. Vorsichtig durch die Membranen rund um das Bauchfell, um den Brustkorb freizulegen geschnitten.
- Für den Zugriff auf das Mediastinum schneiden die diafragma und den Boden des Käfigs Rippe. Finden und zu entfernen 2 mediastinalen Lymphknoten (MLNS), leicht dorsal und lateral neben dem Thymus, medial neben dem Truncus brachiocephalicus, in der Nähe der Bauchseite der Trachea.
- Zu ernten die MLNs verwenden gebogenen Pinzette. Zeigen Zange unterhalb der Lymphknoten und ziehen Sie sie vorsichtig ab. Platzieren Lymphknoten in einer 6-Well-Platte mit 1 ml DMEM und keine connecti entfernenve oder Fettgewebe rund um den Knoten.
- Necken jeder Probe gründlich mit zwei 26 G Nadeln auf 1 ml Spritzen befestigt. Um die Lymphknoten zu necken, halten Sie sie gedrückt, während mit einer Nadel Aufbrechen der Lymphknoten mit der anderen Nadel. Wenn dies richtig gemacht wird, sind konzentrierte Zellen platzen aus dem Lymphknoten leicht in den Medien beobachtet. Geben Sie das Gewebematerial durch einen 70 & mgr; m Nylon-Filter, um Einzelzellsuspensionen zu erhalten.
- Zentrifuge Einzelzellsuspensionen für 10 Minuten bei 260 × g in einer gekühlten Zentrifuge. Zellpellet in 2 ml Rotes Blutkörperchen lysierende (RbCl) Puffer, um rote Blutkörperchen zu lysieren. Ermöglichen Lyse für 3 min bei RT ablaufen.
- Neutralisieren RbCl Puffer durch Zentrifugation und Zell Resuspension in 2 ml eiskaltem PBS.
- Platten Zellen in U-förmigen 96-Well-Platten bei einer Konzentration von 10 7 Zellen / ml in einem Endvolumen von 100 ul.
- Für die Durchflusszytometrie-Analyse, Blockzelle Fc-Rezeptoren mit Hilfe1 ug anti-Maus-CD16 / CD32-Antikörper pro 10 6 Zellen für 15 Minuten auf Eis.
- Zentrifugenplatten und entsorgen Überständen durch flicking Platte. Inkubieren einzelnen Wells mit der Oberfläche Antikörper Kombination der Wahl. Typischerweise für die Detektion von dendritischen Zellen in Lymphknoten, sollte die Antikörpermischung sind: 0,25 & mgr; g anti-CD11c, 0,25 ug CD11b, 0,5 ug von MHC-Klasse II, 0,25 ug CD103 und 0,15 ug CD8a in einem Endvolumen von 100 ul.
- Bei negativen Gating, fügen 0,25 ug anti-CD3, CD19, NK1.1 oder einer Linie Cocktail (2A). Alternative Gating-Strategien sowie Protokolle für die angemessene Entschädigung von mehreren Fluoreszenzfarbstoffen können auf der Website des immunologischen Genome Project gefunden werden. Zusätzlich zu den Oberflächenmarker der Wahl wird mit 1 ug eines Antikörpers gegen H-2K b verpflichtet, dem Cocktail SIINFEKL. Das im Handel erhältliche Antikörper Visualisierung von DCs i ermöglichenn, die der SIINFEKL Peptid gebunden ist, an die Oberfläche MHC Klasse I.
- Zellen, die mit Oberflächen Antikörper inkubieren für 30 Minuten auf Eis. Schützen Platte aus Licht. Zentrifuge Platten bei 260 × g für 5 min und wäscht mit 2 ml PBS zweimal. Übertragen Zellen Zytometrie zur Analyse Strömungsrohre.
- Beurteilung der Impfstoff-spezifischen T-Zellproliferation
- Erhalten Spender-T-Zellen aus kommerziell erhältlichen TCR-transgene Mäuse (OT-I-Mäusen) (C57BL / 6-Tg (Tcr ATCRB) 1100Mjb / J), bei dem alle erzeugten CD8 T-Zellen spezifisch für das SIINFEKL-Peptid. Euthanize Mäusen durch Isofluran-Narkose durch Genickbruch folgte. Ernte Milz durch Ausführen eines Schnittes in der Bauchhöhle. Zeigen Milz / s in 2 ml DMEM / Milz und entfernen Binde- und Fettgewebe.
- Generieren Einzelzellsuspensionen aus Milz nach der in 2.1.2 und 2.1.3 beschriebenen Verfahren.
- Weiter bereichern die Einzelzellsuspension auf T-Zellen, gelten Magnetic Bead Separation Protokolleentweder mit positiven oder negativen Selektionsverfahren 12. Um Spender von Empfängerzellen zu unterscheiden, verwenden kongenen Mäusen, so dass beispielsweise Empfängermäuse drücken die Leukozytenmarker CD45.1 während Spender-T-Zellen exprimieren CD45.2 12.
- T-Zellen zu markieren, inkubieren in 1 ml PBS, das 5 & mgr; M Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE) in einer optimalen Zelldichte von 5 x 10 6 Zellen / ml. Inkubieren Zellen für 20 min bei 37 ° C von Belichtung geschützt. Nach der Inkubation Zentrifuge Zellen bei 260 g für 5 min, Überstand verwerfen und Resuspension Zellen in 3 ml fötales Rinderserum (FBS) zu CFSE neutralisieren.
- Zentrifuge Zellen bei 260 · g während 10 min und resuspendieren in der adäquaten Volumen PBS, so dass 100 & mgr; l-Lösung enthält 2 x 10 6 Zellen. Infundieren Empfänger kongenen Mäusen mit 2 x 10 6 Zellen / Maus über retro-orbitalen Sinus Einspritzung 13.
- Euthanize Empfängermäuse an den Tagen 3, 4 und 5 post-Impfung mit Isofluran-Narkose durch Genickbruch folgte. Ernten Lymphknoten und bereiten Einzelzellsuspensionen für die Durchflusszytometrie als in 2.1.2-2.1.5 angezeigt.
- Identifizieren Spenderzellen durch Färben der Einzelzellsuspensionen in 100 ul einer Antikörper-Cocktail, enthaltend: 0,25 ug anti-Maus-CD3, CD4 und CD8-Antikörper; 0,5 ug anti-Maus CD45.1 oder CD45.2-Antikörpers (abhängig von dem Phänotyp der Spenderzellen). Verlassen Sie die FL-1-Kanal des Durchflusszytometers offen (FITC), um die Verdünnung Profil CFSE 12 (2B) zu bestimmen.
3. chimären Mäusen auf Gene-spezifischen Impfstoff Antworten Dissect
HINWEIS: Die Erzeugung von Wettbewerbsknochenmarkchimären mit DTR-basierte Mausmodelle ermöglicht die Unterscheidung von zellspezifischen Funktionen während der Immunantwort auf Impfstoffe. Hier zeigen wir eine weitere Strategie, mit der Kombination von DTR-exprimierenden Spender cEllen mit Zellen von Knockout-Mäusen erlaubt die Gen-spezifischen Funktionen bei der Immunität in spezifische Zellkompartimente zu studieren. Im Beispiel erzeugen wir Mäuse mit spezifischen Deletion von Toll-like Rezeptor 3 (TLR3) in Langerin + CD103 + DCs.
- Herstellung von Knochenmarkspenderzellen
- Die Arbeiten im Rahmen einer Sicherheitsstufe II Schrank. Vermeiden Sie Verschmutzung durch die Verwendung ausschließlich im Autoklaven Instrumente.
- Um Knochenmark chimären Mäuse zu generieren, verwenden kongenen CD45.1 + C57BL / 6 weiblichen Mäusen als Empfänger, und verwenden Sie TLR3 - / -, Langerin-DTR / EGFP oder Gew Mäusen, CD45.2 + als Spender. Verwendung kongenen Spender- und Empfänger-Mäusen erlaubt die Differenzierung von Spender- und Empfängerzellen mittels Durchflusszytometrie und dies ermöglicht engraftment bewertet werden.
- Spenderknochenmarkszellen zu erhalten, einschläfern Spendermäusen mit Isofluran-Narkose durch Genickbruch folgte. Mit einer scharfen Schere durchführen Einschnitte um die Knöchel, so dass die mouse Muskulatur freiliegt.
- Verwendung stumpfen Pinzette ziehen Maus Haut und Fell sanft vom Knöchel zur Hüfte hin, so dass die Beinmuskulatur zu sehen sind.
- Mit einer scharfen Schere geschnitten Maus Beinen auf der Höhe der Hüfte und über dem Kopf des Oberschenkelknochens.
- Platzieren Beine auf einer Petrischale und auf Eis. Arbeiten Sie schnell und entfernen Sie alle Muskeln, die Knochen freizulegen.
- Separate Oberschenkelknochen und Schienbeinen. Platzieren Knochen in einer Lösung von 70% Ethanol für 5 Minuten, um mögliche Bakterien entfernen und sie sofort auf eine andere Petrischale mit 5 ml serumfreiem DMEM. Geschnitten Knochenenden mit einer scharfen Schere und spülen Sie das Knochenmark in das DMEM. Um so in den Knochen durch Einsetzen einer 26 G-Nadel in eine 5 ml Spritze befestigt tun, flush 1 ml DMEM. Stellen Sie sicher, die Knochen schauen weiß (leer) Nach dem Spülen.
- Sammle alle Knochenmarkszellen aus Spendermäusen in 10 ml DMEM. Generieren Einzelzellsuspensionen von Knochenmarkzellen, indem man die Ernte durch einen 70 & mgr; m Zellsieb.
- ClOhreinzelzellsuspensionen von Knochenmarkzellen durch Zentrifugation bei 260 × g für 10 min bei 4 ° C in einer Kühlzentrifuge. Resuspendieren Zellpellet in 10 ml PBS. Abbau roter Blutkörperchen mit RbCl Lösung nach 2.1.3 und 2.1.4 beschrieben.
- Graf Knochenmarkzellen unter Verwendung von entweder einer Zählkammer oder eines automatisierten Zellzählers. Beurteilen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen durch Bestimmung der toten Zellen mittels Trypanblau-Färbung 13. Optimalerweise ein einziges Tier Erträge um 3 x 10 7 Leukozyten / Maus mit einer Tragfähigkeit von mindestens 80%.
- Im Falle von Gesamtknochenmarkschimären, bereiten TLR-3 - / - oder Gew Spenderzellen. Die optimale Zellkonzentration 2 x 10 7 Zellen / ml, da 2 x 10 6 Zellen in 100 ul PBS für die Transplantation verwendet werden. Wenn es nicht sofort verwendet wird, zu erhalten Spenderzellen bei -80 ° C unter Verwendung von langsamen Einfrieren Techniken und FBS mit 10% DMSO. Für den gemischten Chimären-Modell, mischen Langerin-DTR-Spenderzellen und TLR3 - / -
- Maus-Bestrahlung und Transplantation
- Bestrahlen weiblichen Mäusen von 6 - 8 Wochen in einem Cäsium-137 Quelle-Strahler. Geben Sie Mäusen zwei Dosen von 550 rad 4 Stunden auseinander. Split Bestrahlung minimiert akuten Lebertoxizität und reduziert somit Maus Letalität aufgrund der Bestrahlung Protokoll.
- Nach der Bestrahlung halten Mäuse unter der Behandlung mit Antibiotika für zwei Wochen. Geben Antibiotika mit dem Trinkwasser in 2,5-5 mg Baytril / kg.
- 2-4 Stunden nach der zweiten Bestrahlung, Transplantations Mäusen mit Spenderknochenmarkzellen intravenös. Führen die Injektion von Spenderzellen durch Retroorbitalsinus Einspritzung 13 und unter Isofluran-Narkose mit Maximalvolumen von 100 ul PBS, das 2 x 10 6 Zellen.
- Vier Wochen nach der Transplantation, zu bewerten engraftment in einer Probe von 100ul peripheren Blut mittels Durchflußzytometrie unter Verwendung einer Maschine in der Lage, mindestens zwei Farben zu lesen. Um zwischen Spender und Empfänger Radio-resistente Zellen zu unterscheiden, verwenden Sie handelsüblichen Fluoreszenz-markierten CD45.1 und CD45.2 Anti-Maus-Antikörper unter Verwendung von Verdünnungen zwischen 1/100 und 1/200. Optimale Einwachsen von Spenderzellen sollte mindestens 80% der gesamten hämatopoetischen Zellen im peripheren Blut.
- Impfung und gezielte Verarmung
- Impfung von Mäusen mit rekombinanten attenuierten Influenza-Impfstoff intranasal über. Für Maus-Impfung, betäuben Mäuse mit 5% Isofluran in Sauerstoff unter Verwendung eines Präzisions-Verdampfer. Verwenden eine 200 ul-Pipette 50 ul PBS, enthaltend 10 3 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) der Vakzine zu verabreichen.
- Um die endgültige Maus-Modell zu generieren, Behandlung von Mäusen mit 50 ng der DT in 50 ul PBS intranasal verdünnt. Verwalten DT tropfen direkt an den Nasenlöchern des narkotisierten Mäusen, wie in 3.3.1 beschrieben. Treat miCE mit Tagesdosen Beginn der Behandlung an Tag -2 vor der Impfung bis zum Tag 2 nach der Impfung (3B).
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Representative Results
Erzeugung rekombinanter abgeschwächter Lebendinfluenzaimpfstoffe können durch Transfektion von Plasmiden, die die acht Segmente der Influenza-Virus unter der Kontrolle des bidirektionalen Promotoren 5 kodierende Gene erreicht werden. Ein kälteangepassten Influenza-Impfstoff enthält üblicherweise sechs Segmenten eines kälteangepassten Stamm sowie die HA und NA von Influenza-Stamm der Wahl (zB H1N1) (1A). Das Prinzip der Kälteadaptierung an virus beschränkt Replikation bei 33 ° C, die Temperatur der oberen Atemwege (URT) bei Mäusen und Menschen 14 basierend. Daher kann der Impfstoff in einem gewissen Ausmaß in der URT vervielfältigen, können Pneumonie unteren Atemwege verursachen. Verwendung Fusions-PCR-Technik, einer konservierten Region in den Stamm der viralen Neuraminidase (NA) wurde für eine nachvollziehbare OVA-Peptid (SIINFEKL) (1B) substituiert ist.
Um Impfstoff-spezifische Reaktionen in kinetische Studien verfolgen wir ausgenutzt nachvollziehbar Peptide aus der Impfstoff-Formulierung als auch chimären Maus-Modellen abgeleitet. Zwischen Tag 3 und 6 nach der Impfung, SIINFEKL tragenden CD103 + DCs können in der Lunge lenz Lymphknoten nachgewiesen werden Knoten 12 (2A). Multiparametrische Durchflusszytometrie ermöglicht die Quantifizierung der Impfstoff stammenden Antigen-Präsentation in Echtzeit. Zusätzlich Infusion von SIINFEKL-spezifischen T-Zellen ermöglicht die Quantifizierung von Impfstoff-spezifischen CD8-T-Zellantworten (2B).
Gen-spezifische Funktionen während der Impfung beurteilen wir entwickelten eine Maus-Modell kombiniert DTR-Technologie und wettbewerbsfähigen Knochenmarkchimären (3A). Durch diese Vorgehensweise wurde Verlust der Genfunktion auf spezifische Zellkompartimente im Verlauf der Immunantwort auf die Impfung (3B, C) ausgerichtet.
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Abbildung 1: Entwicklung der rückführbar LAIVs. (A) Influenza-Segmente in AmbiSense Plasmide kloniert (PDZ-Backbone durch Martinez-Sobrido et al. 5 beschrieben) wurden in 293T-Zellen unter Verwendung von Lipofectamin 2000 24 Stunden nach der Transfektion transfiziert, Überstände von 293T-Zellen erhalten wurden in Gegenwart von 1% TPCK Trypsin zu beschichten Influenza-permissiven Madin-Darby-Hundenierenzellen (MDCK) verwendet. Alle Protokoll wurde bei 33 ° C durchgeführt. Virale Überstände von MDCK-Zellen wurden dann in 9 Tage alten embryonierten Hühnereiern für drei Tage bei 33 ° C beimpft. Virale Rettungs wurde durch PCR-basierende virale Genom-Amplifikation und Sequenzierung bestätigt. (B) Um die OVA stammenden Peptid SIINFEKL in die Influenza-Neuraminidase (NA), einer konservierten Region (Reste 65 bis 72) des NA-Gens von A / Puerto einfügen Rico / 8/34 (H1N1) Virus wurde für kurze cDNA das SIINFEKL-Peptid durch Fusion kodiert substituiertePCR. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Vaccine Verfolgungstechniken. (A) wandernden DCs wurden in den Lymphknoten (MLNs) als CD11c med MHC-Klasse-II hallo Zellen gated. In dem Beispiel wurden die Antigen-tragenden wandernden CD103 + DCs als CD103 + H-2 b -SIINFEKL + Zellen durch Durchflußzytometrie ermittelt. (B) OT-I-spezifischen T-Zellen wurden am Tag der Impfung, um Mäuse infundiert. Vier Tage später wurden die Zellen aus den Lymphknoten von geimpften Mäusen gesammelt und für die Proliferation Profil beurteilt. CFSE Verdünnung auf die FL-1-Kanal wurde als Indikator für die Zellteilung genutzt. CAV: Kalt angepasst Impfstoff; CAV SIINFEKL . Kälte-angepasst Impfstoff OVA stamm SIINFEKL Peptid exprimieren Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Gene-Funktion Studien. (A) Schematische Darstellung der Knochenmarkchimären (BMC) und Impfstrategien. (-2 Und +2 beziehen sich auf die Verabreichung von DT zwei Tage vor oder nach der Impfung). (B) Die Zugabe von DT in chimären Mäusen, Langerin-DTR ermöglicht spezifische Depletion von Migrations Langerin + DCs Koexpression CD103 in der Lunge. (C) Vergleichs Analyse der Impfstoff-spezifischen T-Zellen in chimären Mäusen. Nachweis von NP 366-374 -spezifische CD8 T-Zellen wurde über kommerzielle dextramer Färbung getan.803fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In dieser Studie beschreiben wir, wie reverse Genetik und chimären Maus-Modelle können verwendet werden, um die physiologischen und molekularen Mechanismen der Impfstoff-induzierte Immunität aufzuklären. Influenza reversen Genetik wird in vielen Laboren etabliert und hat eine Hauptrolle im Verständnis Influenza Pathogenese, Replikation und Getriebe 17 gespielt. Ein wichtiger Punkt in unserem Protokoll ist Rettung von kälteangepassten Grippeimpfstoffen Expression fremder Epitope. Während die Strategie der Einführung von Kurz cDNAs in den Stängel der Neuraminidase wurde von vielen Gruppen beschrieben wurde, muss der Prüfer, um sicherzustellen, dass keine zusätzlichen Mutationen bei der Impfstoffproduktion in Eiern und dass der Impfstoff in der Lage, in den Atemwegen, ohne Induzieren replizieren eingeführt Lungenentzündung 5,12. Da sowohl die Stängel der viralen Neuraminidase als auch andere Regionen des Influenza-Genom wie der NS-Gensegment und dem PB1 Segmentzuordnung Fremdsequenzen 1 ermöglichen9,20, können Modifikationen unserer Protokoll genutzt werden, um zusätzliche Fremdpeptide zu beispielsweise zu verstehen, die Hierarchien der T-Zell-Immunantwort gegen Influenza-Virus, ein Schlüsselpunkt für rational Impfstoff-Design hinzuzufügen.
Durch Kombinieren nachvollziehbar Impfstoffe und DTR-basierten Abreicherung DC Untergruppen konnten wir zu einem Verlust der Genfunktion auf bestimmte Zellpopulationen zu zielen. Diese Technik ist, bevor eine Immunantwort gegen Pathogene 21 erläutern, aber nicht Pfade für Impfschutz verantwortlich sezieren. Aufgrund der Verfügbarkeit von DTR-basierten Modellen und der Flexibilität der Technik, um chimäre Mäuse zu erzeugen, könnte diese Technik weiter, um zusätzliche Leukocytenpopulationen und Gene mit Immunfunktionen erweitert werden. Es ist wichtig zu beachten, dass DT Behandlung kann auch in Erschöpfung der zusätzlichen Gleichmengen exprimieren Langerin wie CD8a + DCs in den lymphoiden Geweben führen. Deshalb ist es sehr empfehlenswert, um perform eine Dosis-Wirkungs-Studie die Wirkung von DT-Behandlung zu evaluieren. Eine mögliche Einschränkung unseres Modells ist, dass eine allogene Knochenmarktransplantation wurde gezeigt, dass antivirale Gesamt CD8 T-Zell-Immunität 15 verringern. So hat Vorsicht beim Vergleich von Daten zwischen transplantierten und nicht-transplantierten Mäusen ausgeübt werden.
Mehrere wichtige menschliche Krankheitserreger, für die Impfstoffe werden dringend benötigt, kann in Mausmodellen mit Wildtyp-Erreger oder Maus Surrogate untersucht werden. Dazu gehören Influenza-Virus, Plasmodium, und Ebola-Virus. Die in dieser Studie vorgeschlagenen Techniken können dazu beitragen, den Grundmechanismus der experimentelle Impfstoffe gegen diese Pathogene und daher zu verstehen, um Impfstoff-Design zu rationalisieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1x) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| OptiMEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10x | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
References
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- Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
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