Introduction
Dannelsen af immunologisk hukommelse i fravær af sygdom er den fysiologiske grundlag af en effektiv vaccination 1. For nylig har systemer biologi tilgange afsløret, at vellykkede vacciner såsom gul feber-vaccine inducerer en stærk induktion af medfødte immunrespons og aktivering af flere undergrupper af dendritiske celler (DC'er), som igen, at bly multilineage aktivering af antigen specifikke T-celler 2,3. Da DC'er er de eneste immune cellepopulation med evnen til at aktivere antigenspecifikke naive T-celler 4, undersøgelse af deres funktion under vaccination er vigtigt at forstå immunresponser på vacciner og udforme fremtidige strategier mod udfordrende patogener.
Et system, der giver sporing af forskellige DC'er delmængder under immunreaktioner på vacciner ville være ønskeligt for at etablere en nøjagtig kinetik for DC migration til lymfoide væv, og dermed til at giveindsigt i de fysiologiske mekanismer, der er ansvarlige for at indlede vaccine-specifikke adaptiv immunitet. Reverse genetik tilgange giver mulighed for at generere modificeret, levende svækkede vacciner, der kan bruges eksperimentelt med dette formål. Siden dens gennemførelse på influenza forskning har plasmid-baserede revers genetik været almindeligt anvendt til at generere rekombinante influenzastammer herunder LAIVs. Standardprotokoller at redde rekombinante influenzavirus må flere transfektion af højt transficerbare cellelinjer med ambisense plasmider (der producerer både positiv og negativ sense-RNA) indeholdende otte influenza virale segmenter samt amplifikation i en permissiv system som Madin-Darby hunde nyre ( MDCK) celler og / eller kylling befrugtede æg 5. Men anvendelsen af revers genetik at generere molekylære værktøjer for at studere immun mekanismer vaccination forbliver uudforsket.
Genereringenaf nye musemodeller tillader specifik udtømning af immuncelleundergrupper, herunder udviklingslandene, har åbnet nye muligheder for at forstå de grundlæggende immun mekanismer bag vaccine-fremkaldte beskyttelse. Sammenligningen mellem DC subset funktioner i mus og mennesker har vist, at for en stor del, muse og humane DC'er er funktionelt homologe 6,7, disse resultater tyder på, at udviklingen af musemodeller muliggør specifik udtømning af DC'er i steady state og under inflammatoriske tilstande, kan tjene til at forstå fysiologi DC responser hos mennesker. I de senere år er blevet genereret et antal musemodeller transporterer transgener udtrykker simian difteritoksin (DT) receptor (DTR) under kontrol af promotorregionen af et gen af interesse 8,9. Da musevæv ikke naturligt udtrykker DTR, disse modeller tillader betinget udtømning af celledelmængder bærer den målrettede gen af interesse ved mus podning med DT. Således er vores ability at nedbryder specifikke DC'er og andre leukocytter in vivo under fysiologiske processer, er blevet stærkt forbedret gennem udviklingen af DTR-baserede ro. Men mens disse transgene musemodeller er blevet anvendt i vid udstrækning til at forstå ontogenese af immunsystemet, deres anvendelse til vaccineudvikling er næppe testet. Her, ved at kombinere influenza revers genetik og DTR-baserede konkurrencedygtige knoglemarvsceller kimærer, foreslår vi en metode til at studere kinetikken af vaccinen immunitet samt individuelle genfunktion under immunresponser på vacciner in vivo. Anvendelsen af denne teknologi til præklinisk evaluering af nye vacciner mod udfordrende infektionssygdomme kunne bidrage til at rationalisere vaccine design og teste vaccinekandidater in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøg blev gennemført i henhold til godkendte protokoller og efter retningslinjerne i den tyske dyrebeskyttelse lov. Alle medarbejdere, der udfører dyreforsøg passerede træningsprogrammer i henhold til kategori B eller C for sammenslutningen af europæiske Laboratorium Husdyrvidenskab Foreninger.
1. Fremstilling af rekombinant Levende, svækket influenzavaccine af Reverse Genetics
BEMÆRK: detaljeret protokol til generering af rekombinante influenzavirus ved revers genetik er blevet beskrevet af tidligere undersøgelser 5 og er ude af anvendelsesområdet for denne rapport. Kort fortalt er redning af kolde tilpasset influenzavacciner (CAV) gjort i en biosikkerhed klasse II kabinet under biosikkerhed niveau 2 (BSL2) inddæmning, og involverer skridt nærmere beskrevet nedenfor. Den transfektion og infektion protokol følger af Martinez-Sobrido et al. 5.
- Generer en reassortant koldadapteret influenzavaccine under anvendelse som baggrund den koldadapterede stamme A / Ann Arbor / 6/60 (H2N2), samt hæmagglutinin (HA) og en modificeret neuraminidase (NA) af A / PR / 8/34-(H1N1) stamme ( figur 1A). Modifikationen i NA-genet består af en PCR-baseret erstatning af en konserveret sekvens i proteinet stilk (resterne 65 til 72,) af en kort cDNA-sekvens koder for kyllingeovalbumin (OVA) -afledt peptid SIINFEKL (figur 1B). Den SIINFEKL peptidet er et særdeles immundominerende peptid i forbindelse med H-2b MHC klasse I-begrænsede reaktion af C57BL / 6-mus 12.
- Plade 10 6 293T celler per brønd i plader med 6 brønde under anvendelse DMEM 10% føtalt bovint serum (FBS) tilsat 1% penicillin / streptomycin (P / E).
- Forbered plasmid transfektion blandingen: Tilsæt 1 ug af hver af de plasmider, der koder cDNA'er for PB2, PB1, PA, NP, M, NS fra influenza A / Ann Arbor / 6/60-stammen og 1 ug af de plasmider, der koder for NA -SIINFEKL ogHA fra influenza A / PR / 8/34-. Tilføj forvarmet OptiMEM (15 pi for et endeligt volumen på 100 pl / brønd).
- Inkuber transfektion blanding i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsættes 100 pi af transfektion mix / brønd og inkuberes i 16 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Ændre celle medier ved DMEM 0,3% BSA 1% P / E ved 33 ° C og 5% CO2 i 5 timer.
- Tilsæt 10 6 influenza tolerante MDCK-celler i DMSO indeholdende 1 ug / ml trypsin fra pancreas bovin behandlet med L-1-Tosylamide-2-phenylethyl chlormethylketon (TPCK-trypsin). Vedligehold 293T-MDCK co-kulturer for 2 - 3 dage ved 33 ° C og 5% CO2.
- Saml supernatanter af MDCK-293T-celle co-kulturer og klar ved centrifugering ved 260 x g i 5 min.
- Inokulere 9-10 dage gamle kylling embryonerede æg i sterile betingelser. For at gøre dette, lave et hul på toppen af æggeskallen som angivet af Martinez-Sobrido et al. 5.
- Dæk æggeskallen with smeltede voks med en vatpind og inkuberes de inokulerede hønseæg i 3 dage ved 33 ° C.
- Høste allantoisvæsken fra de inficerede befrugtede æg: Vask æggeskaller med 70% ethanol. Åbne æg med en meget forsigtigt revne i den øvre del og fjern allantois membran under anvendelse af steril pincet. Brug en 10 ml pipette at indsamle så meget væske som muligt (typisk 6: - 10 ml). Centrifuger ved 260 xg i 10 minutter ved 4 ° C og overføre blokerede allantoisvæske til nye rør.
2. Tracking Vaccine-specifik immunitet
- Sporing af peptid-bærende dendritiske celler (DC'er)
- For mus vaccination, bedøver mus med 5% isofluran i oxygen ved hjælp af en præcision fordamper. Brug en 200 pi pipette til at administrere 50 pi PBS indeholdende 10 3 plakdannende enheder (pfu) af vaccinen udtrykker SIINFEKL peptidet via dråber direkte til muse næsebor.
- Tre dage efter vaccination, euthanize-mus via isofluran anæstesi efterfulgt af cervikal dislokation.
- Løft muse huden på midterlinjen lige under brystkassen med pincet og skære et lille snit gennem huden med en saks. Fra et indsnit, lave en 3-5 cm lang skære gennem huden over for både hoved og hale, derefter to 2 cm snit fra midterlinjen sideværts fra hver ende. Peel tilbage huden til at afsløre de peritoneale og thorax hulrum. Skær forsigtigt gennem de membraner, der omgiver peritoneum at blotlægge brystkassen.
- For at få adgang mediastinum sender en diafragma og bunden af buret ribben. Finde og fjerne 2 mediastinale lymfeknuder (MLNs), let dorsal og lateralt ved siden af thymus, medialt støder op til brachiocephale arterie, nær den ventrale side af luftrøret.
- At høste MLNS bruge buede pincet. Placer pincet under lymfeknuder og trække dem op forsigtigt. Placer lymfeknuder i en 6-brønds plade indeholdende 1 ml DMEM og fjern eventuelle connective eller fedtvæv omkring knudepunktet.
- Drille hver prøve grundigt med to 26 g nåle fastgjort til 1 ml sprøjter. At drille den lymfeknude, hold den ned med en kanyle mens bryde åbne lymfeknude med anden nål. Når dette er gjort korrekt, er koncentrerede celler sprænges fra lymfeknude let observeret i medierne. Videregive alle vævsmateriale gennem et 70 um nylonfilter til opnåelse enkeltcelle-suspensioner.
- Centrifuge enkeltcelle-suspensioner i 10 minutter ved 260 xg i en afkølet centrifuge. Resuspender cellepelleten i 2 ml røde blodlegemer Lysing (rbcL) Buffer til at lysere røde blodlegemer. Tillad lysis forløbe i 3 minutter ved stuetemperatur.
- Neutralisere rbcL buffer via centrifugering og celle resuspension i 2 ml iskold PBS.
- Plate celler i U-formede plader med 96 brønde i en koncentration på 10 7 celler / ml i et slutvolumen på 100 pi.
- Til flowcytometri analyse, blok celle Fc-receptorer ved hjælp1 ug anti-muse CD16 / CD32-antistoffer pr 10 6 celler i 15 min på is.
- Centrifuge plader og kassér supernatanter ved plade flicking. Inkubér individuelle brønde med overfladen antistof kombination af valg. Typisk til påvisning af dendritiske celler i lymfeknuder, bør antistoffet cocktail omfatte: 0,25 ug anti-CD11c, 0,25 ug CD11, 0,5 ug af MHC klasse II, 0,25 ug CD103 og 0,15 ug af CD8a i et endeligt volumen på 100 pi.
- For negativ gating, tilsættes 0,25 ug anti-CD3, CD19, NK1.1 eller en slægt cocktail (figur 2A). Alternative gating strategier samt protokoller for korrekt kompensation af flere fluorescerende farvestoffer kan findes på webstedet for Immunologisk Genome Project. Ud over de overflademarkører af valg, tilsættes 1 pg af et antistof mod H-2Kb bundet til SIINFEKL til cocktail. Dette kommercielt tilgængeligt antistof vil tillade visualisering af DC'er in som SIINFEKL peptidet er bundet til overfladen MHC klasse I.
- Inkuber celler med overflade- antistoffer i 30 minutter på is. Beskyt pladen mod lys. Centrifugér plader ved 260 xg i 5 minutter og vask med 2 ml PBS to gange. Overføre cellerne til flowcytometri rør til analyse.
- Vurdering af vaccine-specifik T-celleproliferation
- Opnå donor-T-celler fra kommercielt tilgængelig TCR-transgene mus (OT-I-mus) (C57BL / 6-Tg (TCR aTcrb) 1100Mjb / J), hvor alle de genererede CD8 T-celler er specifikke for SIINFEKL peptidet. Aflive mus ved isofluran anæstesi efterfulgt af cervikal dislokation. Harvest milt ved at udføre et snit i bughulen. Placer milt / s i 2 ml DMEM / milt og fjern binde- og fedtvæv.
- Generere enkeltcelle-suspensioner fra milt følge fremgangsmåden beskrevet i 2.1.2 og 2.1.3.
- For yderligere at berige enkelt cellesuspension på T-celler, anvender magnetiske perler adskillelse protokollerved hjælp af enten positive eller negative udvælgelsesprocedurer 12. For at adskille donor fra recipientceller, brug kongene mus således at for eksempel recipientmus udtrykke leukocytmarkør CD45,1 mens donor-T-celler udtrykker CD45,2 12.
- At mærke T-celler, inkuberes dem i 1 ml PBS indeholdende 5 pM af carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) i en optimal celledensitet på 5 x 10 6 celler / ml. Cellerne inkuberes i 20 minutter ved 37 ° C beskyttet mod lys eksponering. Efter inkubation centrifugeres celler ved 260 xg i 5 min, discard supernatant, og resuspender cellerne i 3 ml føtalt bovint serum (FBS) neutralisere CFSE.
- Centrifuger cellerne ved 260 xg i løbet 10 minutter og resuspender i passende volumen af PBS, således at 100 pi opløsning indeholder 2 x 10 6 celler. Indgyde modtagende kongene mus med 2 x 10 6 celler / mus via retro-orbital sinus injektion 13.
- Aflive recipientmus på dag 3, 4 og 5 postvaccination ved hjælp af isofluran anæstesi efterfulgt af cervikal dislokation. Høste mediastinale lymfeknuder og forberede enkeltcelle-suspensioner for flowcytometri, som angivet i 2.1.2-2.1.5.
- Identificere donorceller ved farvning af enkeltcelle-suspensioner i 100 pi af et antistof cocktail indeholdende: 0,25 ug anti-muse CD3, CD4 og CD8-antistoffer; 0,5 ug anti-muse CD45,1 eller CD45,2 antistof (afhængigt af fænotypen af donorceller). Forlade FL-1 kanal i flowcytometer åben (FITC) for at bestemme fortynding profil CFSE 12 (figur 2B).
3. Kimære mus til at dissekere Genspecifikke Vaccine Responses
BEMÆRK: generation af konkurrencedygtige knoglemarv kimærer bruger DTR-baserede musemodeller tillader diskrimination af celle-specifikke funktioner under immunrespons på vacciner. Her viser vi en ekstra strategi hvilken kombination af DTR-udtrykkende donor calen med celler fra knockout mus tilladelser til at studere gen specifikke funktioner under immunitet i bestemte celle rum. I eksemplet genererer vi mus med specifik sletning af toll-like receptor 3 (TLR3) i Langerin + CD103 + DC'er.
- Fremstilling af knoglemarvs donorceller
- Arbejde under et biosikkerhed på niveau II kabinet. Undgå forurening med hjælp udelukkende autoklaverede instrumenter.
- For at generere knoglemarv kimære mus, brug kongene CD45,1 + C57BL / 6 hunmus som modtagere, og brug TLR3 - / -, Langerin-DTR / EGFP eller wt mus, der udtrykker CD45,2 + som donorer. Under anvendelse kongene donor- og recipientmus tillader differentiering af donor- og recipientceller via flowcytometri og dette muliggør indpodning, der skal evalueres.
- At opnå donor knoglemarvsceller, aflive donormus med isofluran anæstesi efterfulgt af cervikal dislokation. Med skarpe saks udføre indsnit omkring anklerne, så mOuse muskulatur er udsat for.
- Ved stump pincet trække muse hud og pels forsigtigt fra anklen mod hofterne således at benmusklerne er synlige.
- Med skarpe saks klippe musen ben på højden af hofterne og over hovedet på lårbenet.
- Placere benene på en petriskål og på is. Arbejde hurtigt og fjerne alle muskler til at afsløre knoglerne.
- Separate lårben og skinneben. Placere knoglerne i en opløsning af 70% ethanol i 5 minutter for at fjerne eventuelle bakterier og placere dem straks på en anden petriskål indeholdende 5 ml serum-frit DMEM. Skær knogle ender bruger skarp saks og skyl knoglemarven i DMEM. For at gøre dette, flush 1 ml DMEM ind i knoglen ved at indsætte en 26 G nål fastgjort til en 5 ml sprøjte. Sørg for, at knoglerne ser hvid (tom) efter skylning.
- Saml alle knoglemarvsceller fra donor mus i 10 ml DMEM. Generere enkeltcelle-suspensioner fra knoglemarvsceller ved at lede høst gennem en 70 um cellefilter.
- Cløre enkeltcelle-suspensioner af knoglemarvsceller ved centrifugering ved 260 xg i 10 minutter ved 4 ° C i en kølecentrifuge. Resuspender cellepellet i 10 ml PBS. Nedbryder røde blodlegemer bruger rbcL løsning som beskrevet i 2.1.3 og 2.1.4.
- Tæl knoglemarvsceller anvendelse af enten et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller. Vurdere cellernes levedygtighed ved bestemmelse af døde celler via trypan blue-farvning 13. Optimalt, en enkelt dyr udbytter omkring 3 x 10 7 hvide blodlegemer / mus med en levedygtighed på mindst 80%.
- I tilfælde af totale knoglemarvsceller kimærer, forberede TLR-3 - / - eller wt donorceller. Optimal cellekoncentrationen er 2 x 10 7 celler / ml siden 2 x 10 6 celler i 100 pi PBS vil blive anvendt til transplantation. Hvis det ikke anvendes straks, bevare donorceller ved -80 ° C ved hjælp af langsomme frysning teknikker og FBS med 10% DMSO. For den blandede kimære model, mix Langerin-DTR-donor celler og TLR3 - / -
- Mus bestråling og transplantation
- Bestråle hunmus mellem 6 - 8 uger gamle i en cæsium 137 kilde strålerøret. Giv mus to doser på 550 rad 4 timer fra hinanden. Split bestråling minimerer akut hepatisk toksicitet og derfor reducerer mus letalitet på grund af bestråling protokollen.
- Efter bestråling, holder mus under behandling med antibiotika til to uger. Giv antibiotika med drikkevandet ved 2,5-5 mg Baytril / kg.
- 2 - 4 timer efter den anden bestråling, transplantation mus med donor knoglemarvsceller intravenøst. Udføre injektionen af donorceller via retro-orbital sinus injektion 13 og under isofluran-narkose ved hjælp maksimalt volumen på 100 pi PBS indeholdende 2 x 10 6 celler.
- Fire uger efter transplantation, evaluere indpodning i en prøve af 100pi af perifert blod via flowcytometri hjælp af en maskine i stand til at læse mindst to farver. For at skelne mellem donor og radio-resistente recipientceller bruge kommercielt tilgængelige fluorescens-mærket CD45,1 og CD45,2 anti-muse-antistoffer ved hjælp af fortyndinger mellem 1/100 og 1/200. Optimal indpodning af donorceller bør være mindst 80% af de samlede hæmatopoietiske celler i perifert blod.
- Vaccination og målrettet udtynding
- Vaccinere mus med rekombinant levende svækkede influenzavaccine via intranasal. For mus vaccination, bedøver mus med 5% isofluran i oxygen ved hjælp af en præcision fordamper. Brug en 200 pi pipette til at administrere 50 pi PBS indeholdende 10 3 plakdannende enheder (pfu) af vaccinen.
- At generere det endelige musemodel, behandle mus med 50 ng DT fortyndet i 50 pi PBS intranasalt. Administrere DT dråbe for dråbe direkte til næseborene af bedøvede mus som beskrevet i 3.3.1. Treat mice med daglige doser startende behandling på dag -2 før vaccination indtil dag 2 efter vaccination (figur 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generering af rekombinante levende svækkede influenzavacciner kan opnås ved transfektion af plasmider kodende for de otte segmenter af influenzavirus under kontrol af tovejs promotorer 5. Et koldadapteret influenzavaccine indeholder sædvanligvis seks segmenter af et koldadapteret stamme samt HA og NA af influenza-stammen af valg (f.eks H1N1) (figur 1A). Princippet om koldadaptation er baseret på virus-begrænset replikation ved 33 ° C, temperaturen af den øvre-luftveje (URT) i mus og mennesker 14. Derfor kan vaccinen replikere i nogen grad i URT men kan ikke forårsage nedre luftveje lungebetændelse. Anvendelse af fusion PCR-teknologi, en konserveret region i stænglen af det virale neuraminidase (NA) blev erstattet af en sporbar OVA peptid (SIINFEKL) (figur 1B).
At spore vaccine-specifikke reaktioner i kinetikundersøgelser vi har draget fordel af sporbare peptider afledt af vaccineformulering samt kimære musemodeller. Mellem dag 3 og 6 efter vaccination, SIINFEKL-bærende CD103 + DC'er kan påvises i lungen-drænende lymfeknuder 12 (figur 2A). Multiparametric flowcytometri tillader kvantificering af vaccine-afledt antigenpræsentation i realtid. Desuden infusion af SIINFEKL-specifikke T-celler muliggør kvantificering af vaccine-specifikke CD8 T-celle-responser (figur 2B).
For at evaluere genspecifikke funktioner under vaccination udtænkt vi en musemodel kombinerer DTR-teknologi og konkurrencedygtige knoglemarv kimærer (figur 3A). Ved at gøre dette, blev tab af genfunktion målrettet til specifikke cellerum i løbet af immunresponser til vaccination (figur 3B, C).
52.803 / 52803fig1.jpg "/>
Figur 1. Engineering af sporbare LAIVs. (A) Influenza-segmenter klonet i ambisense plasmider (PDZ rygraden som beskrevet af Martinez-Sobrido et al. 5) blev transficeret ind i 293T-celler under anvendelse af lipofectamin 2000. 24 timer efter transfektion supernatanter opnået fra 293T-celler blev anvendt til at coate influenza-eftergivende Madin-Darby hunde nyre (MDCK) celler i nærværelse af 1% af TPCK trypsin. Alle protokollen blev udført ved 33 ° C. Virale supernatanter fra MDCK-celler blev derefter inokuleret i 9 dage gamle befrugtede hønseæg i tre dage ved 33 ° C. Viral redning blev bekræftet ved PCR-baseret virale genom amplifikation og sekventering. (B) For at indsætte OVA-afledte SIINFEKL peptid ind i influenza neuraminidase (NA), en konserveret region (resterne 65 til 72,) af NA-genet fra A / Puerto Rico / 8/34-(H1N1) virus blev erstattet af en kort cDNA, der koder SIINFEKL peptidet via fusionPCR. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Vaccine sporing teknikker. (A) migrerende DC'er blev gated i de mediastinale lymfeknuder (MLNs) som CD11c with MHC klasse II hi celler. I eksemplet blev antigen-bærende vandrende CD103 + DC'er identificeret som CD103 + H-2b -SIINFEKL + celler ved flowcytometri. (B) OT-I-specifikke T-celler blev infunderet til mus på samme dag for vaccination. Fire dage efter blev celler opsamlet fra lymfeknuderne i vaccinerede mus og vurderet for deres proliferation profil. CFSE fortynding på FL-1 kanal blev anvendt som indikator for celledeling. CAV: Cold-tilpassede vaccine; CAV SIINFEKL :. Kold-tilpassede vaccine, som udtrykker OVA-afledt SIINFEKL peptid Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. genfunktion undersøgelser. (A) Skematisk af knoglemarv kimærer (BMC) og vaccinationsstrategier. (-2 Og +2 refererer til administration af DT to dage før eller efter vaccination). (B) Tilsætning af DT i kimære mus, der udtrykker Langerin-DTR muliggør specifik udtømning af vandrende Langerin + DC'er co-udtrykke CD103 i lungen. (C) Sammenlignende analyse af vaccine-specifikke T-celler i kimære mus. Påvisning af NP 366-374 -specifikke CD8 T-celler blev udført via kommerciel dextramer farvning.803fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse beskriver vi, hvordan revers genetik og kimære mus-modeller kan anvendes til at belyse de fysiologiske og molekylære mekanismer for vaccine-inducerede immunitet. Influenza revers genetik er etableret i mange laboratorier og har spillet en ledende rolle i forståelsen influenza patogenese, replikation, og transmission 17. Et centralt punkt i vores protokol er redning af koldadapterede influenzavacciner udtrykker fremmede epitoper. Mens strategien om at indføre korte cDNAer i stilken af neuraminidase er blevet beskrevet af mange grupper, investigator skal sikre, at ingen yderligere mutationer introduceres under produktionen vaccine i æg, og at vaccinen er i stand til at replikere i luftvejene uden at inducere lungebetændelse 5,12. Da både stilken af det virale neuraminidase samt andre regioner af influenza-genomet såsom NS-gensegment og PB1 segmentet tillader tildeling af fremmede sekvenser 19,20, kan modifikationer af vores protokol anvendes til at tilføje yderligere fremmede peptider til for eksempel forstå hierarkier respons T-celle immunrespons mod influenzavirus, et centralt punkt for rationel vaccine design.
Ved at kombinere sporbare vacciner og DTR-baserede udtømning af DC delmængder har vi været i stand til at målrette tab af genfunktion til specifikke celle-delmængder. Denne teknologi er blevet anvendt før at belyse immunrespons til patogener 21, men ikke at dissekere veje er ansvarlige for beskyttelsen vaccine. På grund af tilgængeligheden af DTR-baserede modeller og fleksibiliteten af teknikken til at generere kimære mus, kunne denne teknik udvides yderligere til yderligere leukocytpopulationer og gener med immunfunktioner. Det er vigtigt at bemærke, at DT behandling også kan resultere i udtømning af yderligere DC delmængder udtrykker Langerin såsom CD8a + DC'er i lymfevæv. Derfor er det stærkt anbefales at perform en dosis-respons studie for at evaluere effekten af DT behandling. En potentiel advarsel i vores model er, at allogen knoglemarvstransplantation har vist sig at nedsætte den samlede antiviral CD8 T-celle-immunitet 15. Således forsigtighed skal udvises, når man sammenligner data mellem transplanterede og ikke-transplanterede mus.
Flere vigtige humane patogener, for hvilke der er et presserende behov for vacciner kan studeres i musemodeller hjælp vildtype patogener eller mus surrogater. Disse indbefatter influenzavirus, Plasmodium, og Ebola virus. De foreslåede i denne undersøgelse teknikker kan hjælpe til at forstå den grundlæggende mekanisme af eksperimentelle vacciner mod disse patogener og derfor, at rationalisere vaccine design.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1x) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| OptiMEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10x | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
References
- Bevan, M. J. Understand memory, design better vaccines. Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).
- Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
- Querec, T. D. Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans. Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. 3, (2010).
- Haniffa, M. Human Tissues Contain CD141hi Cross-Presenting Dendritic Cells with Functional Homology to Mouse CD103+ Nonlymphoid Dendritic Cells. Immunity. 37, 60-73 (2012).
- Haniffa, M., Collin, M., Ginhoux, F. Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and mouse. Adv. Immunol. 120, 1-49 (2013).
- Jung, S. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17, 211-220 (2011).
- Lahl, K., Sparwasser, T. In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model. Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).
- Duffield, J. S. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J. Clin. Invest. 115, 56-65 (2005).
- Meredith, M. M. Expression of the zinc finger transcription factor zDC. J. Exp. Med. 209, 1153-1165 (2012).
- Girón, J. V. Mucosal Polyinosinic-Polycytidylic Acid Improves Protection Elicited by Replicating Influenza Vaccines via Enhanced Dendritic Cell Function and T Cell Immunity. J. Immunol. 193, 1324-1332 (2014).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. bib.usb.ve. , (1983).
- Cox, R. J., Brokstad, K. A., Ogra, P. Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines. Scand. J. Immunol. 59, 1-15 (2004).
- Gowdy, K. M. Impaired CD8(+) T cell immunity after allogeneic bone marrow transplantation leads to persistent and severe respiratory viral infection. Transpl. Immunol. 32, 51-60 (2015).
