Introduction
Genereringen av immunologisk hukommelse i fravær av sykdom er fysiologiske grunnlaget for effektiv vaksinering 1. Nylig har systembiologi baserte tilnærminger avslørte at vellykkede vaksiner som for eksempel gul feber-vaksine, induserer en sterk induksjon av medfødte immunresponser og aktivering av flere undergrupper av dendrittiske celler (DCS), som i sin tur, å føre multilineage aktivering av antigen- spesifikke T-celler 2,3. Siden DC er de eneste immun cellepopulasjon med evne til å aktivere antigen-spesifikke naive T-celler 4, er studiet av deres funksjon under vaksinasjon viktig å forstå immunresponser mot vaksiner og å utforme fremtidige strategier mot utfordrende patogener.
Et system som tillater sporing av forskjellige DCS delmengder i løpet av immunresponser mot vaksiner ville være ønskelig for å etablere en nøyaktig kinetikken til DC migrering til lymfevev, og derfor å tilveieinnsikt i de fysiologiske mekanismene som er ansvarlig for igangsetting av vaksinen spesifikke adaptiv immunitet. Revers genetikk baserte tilnærminger tilbyr muligheten for å generere modifiserte, levende-svekkede vaksiner som kan brukes eksperimentelt til dette formålet. Siden innføringen per influensa forskning, har plasmid-basert revers genetikk vært mye brukt til å generere rekombinante influensastammer inkludert LAIVs. Standardprotokollene for å redde rekombinante influensavirus krever multi transfeksjon av høyt transfectable cellelinjer med ambisense plasmider (som produserer både positive og negative sense RNA) inneholdende åtte influensa viral segmenter samt forsterkning i et ettergivende system slik som Madin-Darby kaninnyre ( MDCK-celler) og / eller kylling embryonerte egg 5. Men fortsatt bruk av revers genetikk å generere molekylære verktøy for å studere immunmekanismer vaksinasjon uutforsket.
Den generasjonenav nye musemodeller slik spesifikk uttømming av immuncelle undergrupper, inkludert DC, har åpnet nye muligheter for å forstå de grunnleggende immun mekanismene bak vaksine-fremkalte beskyttelse. Sammenligningen mellom DC-undergruppe funksjoner hos mus og mennesker har vist at, for en stor del, mus og humane DC er funksjonelt homologe 6,7, disse funn tyder sterkt på at utviklingen av musemodeller tillater spesifikk uttømming DCS i steady state og i løpet av inflammatoriske tilstander, kan tjene til å forstå fysiologi av DC-responser hos mennesker. I de senere år har en rekke musemodeller er blitt generert som bærer transgener som uttrykker simian difteri-toksin (DT) reseptor (DTR) under kontroll av promoter-regionen av et gen av interesse 8,9. Siden musevev ikke naturlig uttrykke DTR, disse modellene tillater betinget utarming av celle undergrupper bærer målrettet genet av interesse på musen inokulering med DT. Dermed vår ability til å utarme spesifikke DC og andre leukocytter in vivo under fysiologiske prosesser, har blitt kraftig forbedret ved utvikling av DTR-baserte ro. Men mens disse transgene musemodeller har blitt brukt i stor utstrekning for å forstå ontogeny av immunsystemet, er deres anvendelse til vaksineutvikling er neppe testet. Her, ved å kombinere influensa revers genetikk og DTR-baserte konkurranse benmarg chimeras, foreslår vi en metode for å studere kinetikk vaksineimmunitet samt individuelle genfunksjon under immunresponser mot vaksiner in vivo. Anvendelsen av denne teknologien for preklinisk vurdering av nye vaksiner mot utfordrende smittsomme sykdommer kan bidra til å effektivisere vaksine design og teste vaksinekandidater in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøk ble gjennomført i henhold til godkjente protokoller og følge retningslinjene i den tyske dyrevern lov. Alle ansatte som utfører dyreforsøk gått opplæringsprogrammer i henhold til kategori B eller C i Federation of European Laboratory Animal Science foreninger.
1. generasjon av rekombinant levende svekkede influensavaksiner med Omvendt Genetics
MERK: detaljert protokoll for generering av rekombinante influensavirus ved revers genetikk har blitt beskrevet av tidligere studier 5 og er ute av omfanget av denne rapporten. Kort fortalt er redning av kuldetilpassede influensavaksiner (CAV) gjort i en biosikkerhet klasse II skap under biosikkerhetsnivå 2 (BSL2) oppdemming, og innebærer tiltakene beskrevet nedenfor. Transfeksjon og infeksjon protokollen følger det av Martinez-Sobrido et al. 5.
- Generere en reassortant kald tilpasset influensavaksine ved bruk som bakgrunn av kuldetilpassede stamme A / Ann Arbor / 6/60 (H2N2), så vel som hemagglutinin (HA) og en modifisert neuraminidase (NA) for A / PR / 8/34 (H1N1) stamme ( figur 1A). Modifikasjonen på NA-genet består av en PCR-basert utskifting av en konservert sekvens i proteinet stilken (restene 65-72) av en kort cDNA-sekvens som koder for kylling ovalbumin (OVA) avledede peptid SIINFEKL (figur 1B). Den SIINFEKL peptid er et meget immunodominant peptid i sammenheng med H-2b MHC klasse I-begrenset responsen av C57BL / 6-mus 12.
- Plate 10 6 293T celler per brønn i 6-brønners plater ved bruk av DMEM 10% føtalt bovint serum (FBS) supplert med 1% penicillin / streptomycin (P / E).
- Forbered plasmid transfeksjon blanding: Tilsett 1 ug av hver av de cDNA-plasmider som koder for PB2, PB1, PA, NP, M, NS fra influensa A / Ann Arbor / 6/60 stamme og 1 pg av plasmidene som koder for de NA -SIINFEKL ogHA fra influensa A / PR / 8/34. Legg forvarmet OptiMem (15 ul i et sluttvolum på 100 ul / brønn).
- Inkuber transfeksjon blanding i 30 min ved RT.
- Tilsett 100 ul transfeksjonsbuffer blanding / brønn og inkuberes i 16 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Endre celle media ved DMEM 0,3% BSA 1% P / E på 33 ° C og 5% CO 2 for 5 timer.
- Tilsett 10 6 influensa permissive MDCK-celler i DMSO inneholdende 1 pg / ml trypsin fra bovin bukspyttkjertel behandlet med L-1-Tosylamide-2-fenyletyl klormetylketon (TPCK-trypsin). Opprettholde 293T-MDCK co-kulturer for 2 - 3 dager ved 33 ° C og 5% CO 2.
- Samle supernatanter av MDCK-293T celler ko-kulturer og klart ved sentrifugering ved 260 xg i 5 min.
- Inokuler 9-10 dager gamle kylling embryonerte egg i sterile betingelser. For å gjøre dette, lage et hull på toppen av eggeskallet som indikert av Martinez-Sobrido et al. 5.
- Dekk eggeskallet viddh smeltet voks med en bomullsdott og inkuber inokulert kylling egg for 3 dager ved 33 ° C.
- Høste allantoinvæsken fra infiserte embryon egg: Vask eggeskall med 70% etanol. Åpne egg med en meget forsiktig sprekk i den øvre del og fjern allantoiske membran ved hjelp av sterile pinsetter. Bruke en 10 ml pipette for å samle inn så mye væske som mulig (typisk 6 - 10 ml). Sentrifuger ved 260 xg i 10 min ved 4 ° C, og overfører fjernet allantoinvæsken til nye rør.
2. Spore Vaksine-spesifikk immunitet
- Sporing av peptid-bærende dendrittiske celler (DC)
- For mus vaksinasjon, bedøve mus med 5% isofluran i oksygen ved hjelp av en presisjon fordamper. Bruk en 200 ul pipette for å administrere 50 ul PBS inneholdende 3 10 plaque-dannende enheter (pfu) av vaksinen uttrykker SIINFEKL peptidet via dråper direkte til muse neseborene.
- Tre dager etter vaksinasjon, euthanize mus via isoflurananestesi fulgt ved cervikal dislokasjon.
- Løft musen huden på midtlinjen rett under brystkasse med pinsett og skjær et lite snitt gjennom huden med saks. Fra det punktet av snittet, lage en 3-5 cm lang skjære gjennom huden mot både hode og hale, og deretter to 2 cm snitt fra midtlinjen lateralt fra hver ende. Vipp av huden for å avsløre peritoneal og thorax hulrom. Skjær forsiktig gjennom membraner rundt bukhinnen å eksponere thorax.
- For å få tilgang mediastinum kutte diafragma og bunnen av buret ribbein. Finne og fjerne to mediastinum lymfeknuter (MLNer): En rygg- og sideveis ved siden av thymus, medialt tilstøtende til brachiocephalic arterie, nær den ventrale side av luftrøret.
- Å høste MLNer bruke buede tang. Plasser tang under lymfeknuter og trekke dem forsiktig opp. Plasser lymfeknuter i en 6-brønners plate inneholdende 1 ml DMEM og fjerne eventuelle connective eller fettvev rundt knutepunktet.
- Erte hver prøve grundig med to 26 G nåler festet til en ml sprøyter. Å erte lymfeknute, holder det med en nål mens bryte åpen lymfeknute med andre nål. Når dette er gjort riktig, er konsentrert celler sprengning fra lymfeknute lett observeres i media. Passere alle vev materiale gjennom et 70 mikrometer nylonfilter for å oppnå en enkelt cellesuspensjon.
- Sentrifuger enkeltcellesuspensjoner i 10 minutter ved 260 x g i en avkjølt sentrifuge. Cellepelleten suspenderes i 2 ml av røde blodceller Lysing (RbCl) Buffer å lysere røde blodceller. Tillat lysering for å gå videre i 3 minutter ved RT.
- Nøytralisere RbCl buffer via sentrifugering og celle resuspensjon i 2 ml iskald PBS.
- Plate celler i U-formede 96-brønners plater ved en konsentrasjon av 10 7 celler / ml i et sluttvolum på 100 ul.
- For flowcytometri analyse, blokk celle Fc-reseptorer hjelp1 ug av anti-mus CD16 / CD32-antistoffer per 10 6-celler i 15 minutter på is.
- Sentrifuger plater og forkaste Supernatantene av plate flicking. Inkuber individuelle brønner med overflaten antistoff kombinasjon av valg. Typisk for påvisning av dendrittiske celler i lymfeknuter, bør Antistoffblandingen omfatter: 0,25 ug av anti-CD11c, 0,25 ug av CD11b, 0,5 ug av MHC klasse II, 0,25 ug av CD103 og 0,15 ug av CD8a i et sluttvolum på 100 ul.
- For negative gating, tilsett 0,25 mikrogram av anti-CD3, CD19, NK1.1 eller en avstamning cocktail (Figur 2A). Alternative port strategier samt protokoller for skikkelig kompensasjon av flere fluorescerende fargestoffer kan finnes på nettsiden til Immunologisk Genome Project. I tillegg til de overflatemarkører av valg, tilsett 1 ug av et antistoff mot H-2K b bundet til SIINFEKL til cocktail. Dette kommersielt tilgjengelig antistoff vil tillate visualisering av DCs jegn som SIINFEKL peptid er bundet til overflaten MHC klasse I.
- Inkuber cellene med overflate antistoffer i 30 minutter på is. Beskytt plate mot lys. Sentrifuger plater på 260 xg for 5 min og vask med 2 ml PBS to ganger. Overfør cellene til flowcytometri rør for analyse.
- Vurdering av vaksine-spesifikke T-celle-proliferasjon
- Skaff donor T-celler fra kommersielt tilgjengelig TCR-transgene mus (OT-I mus) (C57BL / 6-Tg (TCR aTcrb) 1100Mjb / J) der alle de genererte CD8 T-celler er spesifikke for SIINFEKL peptidet. Avlive mus ved isoflurananestesi fulgt ved cervikal dislokasjon. Innhøsting milt ved å utføre et snitt i bukhulen. Plasser milt / s i 2 ml DMEM / milt og fjerne binde og fettvev.
- Generere en enkelt cellesuspensjon fra milt etter den fremgangsmåte som er beskrevet i 2.1.2 og 2.1.3.
- Å berike enkeltcellesuspensjonen på T-celler videre, bruke magnetisk perle separasjons protokollerved hjelp av enten positive eller negative seleksjonsprosedyrer 12. For å skille donor fra mottakerceller, bruker congenic mus, slik at for eksempel resipientmus uttrykke leukocytter markør CD45.1 mens donor T-celler uttrykker CD45.2 12.
- Å merke T-celler, inkuberes de i 1 ml PBS inneholdende 5 pM karboksyfluorescein succinimidylester (CFSE) i en optimal celletetthet på 5 x 10 6 celler / ml. Inkuber cellene i 20 minutter ved 37 ° C beskyttet mot lys. Etter inkubering i sentrifuger cellene ved 260 xg i 5 min, Fjern supernatant og resuspender cellene i 3 ml føtalt bovint serum (FBS) nøytralisere CFSE.
- Sentrifuger cellene ved 260 xg i 10 min og resuspendert i tilstrekkelig volum PBS, slik at 100 ul av oppløsning inneholder 2 x 10 6 celler. Sette mot mottaker congenic mus med 2 x 10 6 celler / mus via retro-orbital sinus injeksjon 13.
- Avlive resipientmus på dager 3, 4 og 5 post-vaksinasjon ved hjelp isoflurananestesi fulgt ved cervikal dislokasjon. Høste mediastinale lymfeknuter og forberede enkeltcellesuspensjoner for flowcytometri som angitt i 2.1.2-2.1.5.
- Identifiser donorceller ved farging enkeltcellesuspensjoner i 100 ul av et antistoff cocktail som inneholdt: 0,25 ug av anti-muse-CD3, CD4 og CD8-antistoffer; 0,5 ug av anti-mus CD45.1 eller CD45.2 antistoff (avhengig av fenotypen av donorceller). La FL-kanal for en flowcytometer åpen (FITC) for å bestemme fortynningen profil CFSE 12 (figur 2B).
3. Chimeriske Mus å dissekere Responses genspesifikke vaksine
MERK: generasjonen av konkurransebeinmargs kimeras bruker DTR-baserte musemodeller tillater diskriminering av celle-spesifikke funksjoner under immunrespons på vaksiner. Her viser vi en ekstra strategi ved hvilken kombinasjon av DTR-uttrykke donor calen med celler fra knockout mus tillatelse for å studere gen-spesifikke funksjoner i løpet av immunitet i bestemte cellekamre. I eksempelet genererer vi mus med spesifikk sletting av toll-like receptor 3 (TLR3) i Langerin + CD103 + DC.
- Utarbeidelse av beinmargsdonorceller
- Arbeide under et biosikkerhetsnivå II kabinett. Unngå forurensning ved hjelp utelukkende autoklaveres instrumenter.
- For å generere beinmargs kimære mus, bruke congenic CD45.1 + C57BL / 6 hunnmus som mottakere, og bruke TLR3 - / -, Langerin-DTR / EGFP, eller wt mus som uttrykker CD45.2 + som donorer. Ved hjelp av congenic giver- og mottaker mus muliggjør differensiering av giver- og mottakercellene via flowcytometri, og dette gjør det mulig innpoding som skal evalueres.
- For å få donorbenmargceller, avlive giver mus med isoflurananestesi fulgt av halsdislokasjon. Med skarp saks utføre snitt rundt anklene slik at mOuse muskulatur er utsatt.
- Bruke sløv tang trekke muse hud og pels forsiktig fra ankelen mot hoftene slik at leggmusklene er synlige.
- Med skarp saks klippet muse beina på høyden av hoftene og over hodet på femur.
- Plasser ben på en petriskål og på is. Arbeide raskt og fjerne alle muskler til å eksponere bein.
- Separate lårben og skinneben. Plasser bein i en løsning av 70% etanol i 5 minutter for å fjerne eventuelle bakterier og plassere dem umiddelbart på en annen petriskål inneholdende 5 ml serumfritt DMEM. Skjær beinet slutter å bruke skarp saks og skyll benmarg inn i DMEM. For å gjøre dette, flush 1 ml DMEM i beinet ved å sette inn en 26 G nål festet til en 5 ml sprøyte. Sørg for at knoklene ser hvit (tom) etter spyling.
- Samle alle benmargceller fra mus som donor i 10 ml DMEM. Generere enkeltcellesuspensjoner fra benmargceller ved å sende innhøstingen gjennom en 70 mikrometer celle sil.
- Cløre enkeltcellesuspensjoner av benmargceller ved sentrifugering ved 260 xg i 10 min ved 4 ° C i en avkjølt sentrifuge. Resuspender cellepelleten i 10 ml PBS. Utarme røde blodlegemer ved hjelp av RbCl oppløsning, som beskrevet i 2.1.3 og 2.1.4.
- Telle benmargceller ved hjelp av enten en hemocytometer eller en automatisert celleteller. Vurdere cellelevedyktigheten ved bestemmelse av døde celler via trypanblått-farving 13. Optimalt en enkelt dyr utbytter rundt 3 x 10 7 hvite blodceller / mus med en levedyktighet på minst 80%.
- I tilfelle av totale benmarg kimærer, forberede TLR-3 - / - eller wt donorceller. Den optimale cellekonsentrasjonen er 2 x 10 7 celler / ml etter 2 x 10 6 celler i 100 ul PBS som skal brukes for transplantasjon. Hvis det ikke brukes umiddelbart, bevare donorceller ved -80 ° C ved hjelp av langsomme frysing teknikker og FBS med 10% DMSO. For blandet kimære modell, bland Langerin-DTR-donorceller og TLR3 - / -
- Mus bestråling og transplantasjon
- Bestråle hunnmus mellom 6 - 8 ukers alder i et Cesium-137 kilde irradiator. Gi mus to doser av 550 rad 4 timer fra hverandre. Split bestråling reduserer akutt levertoksisitet, og reduserer derfor mus dødelighet på grunn av bestråling protokollen.
- Etter bestråling holde mus ved behandling med antibiotika for to uker. Gi antibiotika med drikkevannet på 2,5 til 5 mg Baytril / kg.
- 2 - 4 timer etter den annen bestråling, transplanterte mus med donor benmargceller intravenøst. Utfør injeksjon av donorceller via retro-orbital sinus injeksjon 13 og under isoflurananestesi bruker maksimalt volum på 100 mL PBS som inneholder 2 x 10 6 celler.
- Fire uker etter transplantasjonen, evaluere innpoding i en prøve av 100ul av perifert blod ved flowcytometri ved anvendelse av en maskin i stand til å lese i det minste to farger. For å skille mellom donor og radiobestandig mottakercellene, bruk kommersielt tilgjengelig fluoresceinmerket CD45.1 og CD45.2 anti-mus antistoffer ved hjelp fortynninger mellom 1/100 og 1/200. Optimal innpoding av donorceller bør være minst 80% av de totale hematopoetiske celler i perifert blod.
- Vaksinasjon og målrettet utarming
- Vaksinere mus med rekombinant levende svekkede influensavaksine via intranasal. For mus vaksinasjon, bedøve mus med 5% isofluran i oksygen ved hjelp av en presisjon fordamper. Bruk en 200 ul pipette for å administrere 50 ul PBS inneholdende 3 10 plaque-dannende enheter (pfu) av vaksinen.
- For å generere den endelige musemodell, behandle mus med 50 ng av DT fortynnet i 50 mL PBS intranasalt. Administrere DT dråpe for dråpe direkte til neseborene av bedøvet mus som beskrevet i 3.3.1. Unn miCE med daglige doser som starter behandling på dagen -2 før vaksinasjonen til dag 2 etter vaksinasjon (figur 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generering av rekombinante levende-svekkede influensavaksiner kan oppnås ved transfeksjon av plasmider som koder for de åtte segmenter av influensavirus under kontroll av promotorer toveis 5. En kald-tilpasset influensavaksine inneholder som regel seks segmenter av en kald-tilpasset belastningen samt HA og NA av influensavirus av valget (f.eks H1N1) (figur 1A). Prinsippet for kald-tilpasning er basert på virus-replikasjon begrenset ved 33 ° C, temperaturen i det øvre luftveier (URT) i mus 14 og mennesker. Derfor kan vaksinen replikere i en viss utstrekning i URT men kan ikke forårsake nedre luftveisbetennelse. Ved hjelp av fusjons PCR-teknologi, en konservert region i stammen av viral neuraminidase (NA) ble byttet ut med en sporbar OVA-avledet peptid (SIINFEKL) (figur 1B).
Å spore vaksinespesifikke tiltak i kinetikk studiene vi har benyttet seg av sporbare peptider avledet fra vaksinesammensetningen samt kimære musemodeller. Mellom dag 3 og 6 etter vaksinering, SIINFEKL bærende CD103 + DC kan påvises i lungene drenerende lymfeknuter 12 (Figur 2A). Multiparametric flowcytometri tillater kvantifisering av vaksine-avledede antigen-presentasjon i sann tid. I tillegg tillater tilførsel av SIINFEKL-spesifikke T-celler kvantifisering av vaksine-spesifikke CD8 T-celle-responser (Figur 2B).
Å evaluere genspesifikke funksjoner under vaksinering vi utviklet en musemodell som kombinerer DTR-teknologi og konkurransedyktige benmargs chimeras (figur 3A). Ved å gjøre dette, ble tap av genfunksjon målrettes mot bestemte cellekamre i løpet av immunresponser til vaksinering (figur 3B, C).
52803 / 52803fig1.jpg "/>
Figur 1. Engineering av spor LAIVs. (A) Influensa segmenter klonet i ambisense plasmider (PDZ ryggrad som beskrevet av Martinez-Sobrido et al. 5) ble transfektert inn 293T celler ved hjelp Lipofectamine 2000. 24 timer etter transfeksjon, Supernatantene hentet fra 293T celler ble brukt til å belegge influensa-permissive Madin-Darby kaninnyre (MDCK) celler i nærvær av 1% av TPCK trypsin. Hele protokollen ble utført ved 33 ° C. Virale supernatanter fra MDCK-celler ble deretter inokulert i 9 dager gamle embryonerte kyllingegg i tre dager ved 33 ° C. Viral redning ble bekreftet av PCR-basert viral genom forsterkning og sekvensering. (B) For å sette inn OVA-avledet SIINFEKL peptid inn i influensa neuraminidase (NA), et konservert område (rester 65-72) av NA genet av A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) ble byttet ut med en kort cDNA som koder for peptidet SIINFEKL via fusjonPCR. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Vaccine tracing teknikker. (A) trekkende DC ble inngjerdet i mediastinale lymfeknutene (MLNer) som CD11c MED MHC klasse II hi celler. I eksemplet ble det antigen-bærende trekkende CD103 + DC identifisert som CD103 + H-2 + b -SIINFEKL celler ved flow cytometri. (B) OT-I-spesifikke T-celler ble tilført til mus på samme vaksinasjonsdagen. Fire dager etter ble cellene samlet inn fra lymfeknutene av vaksinerte mus og vurdert for spredning profil. CFSE fortynning på FL-1 kanal ble benyttet som indikator for celledeling. CAV: Cold-tilpasset vaksine; CAV SIINFEKL .: Cold-tilpasset vaksine uttrykker OVA-avledet SIINFEKL peptid Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. gen-funksjon studier. (A) Skjematisk av beinmargs chimeras (BMC) og vaksinasjonsstrategier. (-2 Og 2 refererer til administrasjon av DT to dager før eller etter vaksinasjon). (B) Tilsetting av DT i kimære mus som uttrykker Langerin-DTR tillater spesifikk uttømming av trekkfugl Langerin + DC coexpressing CD103 i lungen. (C) Comparative analyse av vaksine-spesifikke T-celler i kimære mus. Påvisning av NP 366-374-spesifikke CD8 T-celler ble gjort via kommersielle dextramer farging.803fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien vil vi beskrive hvordan revers genetikk og kimære musemodeller kan anvendes for å belyse de fysiologiske og molekylære mekanismer for vaksine-indusert immunitet. Influensa revers genetikk er etablert i mange laboratorier og har spilt en sjefsrolle i å forstå influensa patogenesen, replikering, og overføring 17. Et sentralt punkt i vår protokoll er redningen av kuldetilpassede influensavaksiner uttrykker utenlandske epitoper. Selv om strategien for innføring av korte cDNA inn i stilken av neuraminidase er blitt beskrevet av flere grupper, må undersøkeren for å sikre at ingen ytterligere mutasjoner introdusert i løpet av vaksineproduksjon i egg, og at vaksinen er i stand til å replikere i luftveiene uten å indusere lungebetennelse 5,12. Siden både stilken av viral neuraminidase, så vel som andre regioner av genomet som for eksempel influensa NS gensegment og PB1 segment tillate allokering av fremmede sekvenser 19,20, kan modifikasjoner av vår protokoll benyttes for å legge til flere fremmede peptider for å, for eksempel, forstår hierarkier av T-celle immunrespons mot influensavirus, et sentralt punkt for rasjonell vaksine design.
Ved å kombinere spor vaksiner og DTR-baserte uttømming av DC undergrupper har vi vært i stand til å målrette tap av gen-funksjon til spesifikke celle undergrupper. Denne teknologien har vært anvendt tidligere for å klargjøre immunrespons mot patogener 21, men ikke til å dissekere trasé som er ansvarlige for vaksinebeskyttelse. På grunn av tilgjengeligheten av DTR-baserte modeller og fleksibiliteten av teknikken for å generere kimære mus, kan denne teknikken bli ytterligere utvidet til ytterligere leukocyttpopulasjoner og gener med immunfunksjoner. Det er viktig å merke seg at DT behandling kan også resultere i uttømming av ytterligere delmengder DC som uttrykker langerin som CD8a + DC i det lymfoide vev. Derfor er det sterkt anbefalt å perform en dose-respons studie for å evaluere effekten av DT behandling. En potensiell trussel for vår modell er at allogen benmargstransplantasjon har vist seg å redusere den totale antiviral CD8 T-celle immunitet 15. Dermed har forsiktighet utvises når man sammenligner data mellom transplanterte og ikke-transplanterte mus.
Flere viktige menneskelige patogener som vaksiner er sterkt behov kan studeres i musemodeller ved hjelp av vill type patogener eller muse surrogater. Disse inkluderer influensavirus, Plasmodium, og Ebola-viruset. De teknikker som er foreslått i denne undersøkelsen kan bidra til å forstå den grunnleggende mekanismen for eksperimentelle vaksiner mot slike patogener og derfor, for å rasjonalisere vaksine design.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1x) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| OptiMEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10x | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
References
- Bevan, M. J. Understand memory, design better vaccines. Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).
- Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
- Querec, T. D. Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans. Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. 3, (2010).
- Haniffa, M. Human Tissues Contain CD141hi Cross-Presenting Dendritic Cells with Functional Homology to Mouse CD103+ Nonlymphoid Dendritic Cells. Immunity. 37, 60-73 (2012).
- Haniffa, M., Collin, M., Ginhoux, F. Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and mouse. Adv. Immunol. 120, 1-49 (2013).
- Jung, S. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17, 211-220 (2011).
- Lahl, K., Sparwasser, T. In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model. Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).
- Duffield, J. S. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J. Clin. Invest. 115, 56-65 (2005).
- Meredith, M. M. Expression of the zinc finger transcription factor zDC. J. Exp. Med. 209, 1153-1165 (2012).
- Girón, J. V. Mucosal Polyinosinic-Polycytidylic Acid Improves Protection Elicited by Replicating Influenza Vaccines via Enhanced Dendritic Cell Function and T Cell Immunity. J. Immunol. 193, 1324-1332 (2014).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. bib.usb.ve. , (1983).
- Cox, R. J., Brokstad, K. A., Ogra, P. Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines. Scand. J. Immunol. 59, 1-15 (2004).
- Gowdy, K. M. Impaired CD8(+) T cell immunity after allogeneic bone marrow transplantation leads to persistent and severe respiratory viral infection. Transpl. Immunol. 32, 51-60 (2015).
