Introduction
Het genereren van immunologische geheugen in de afwezigheid van ziekte is de fysiologische basis van efficiënte vaccinatie 1. Onlangs zijn systemen-biologie gebaseerde benaderingen bleek dat succesvolle vaccins zoals gele koorts vaccin, induceert een sterke inductie van de aangeboren immuunrespons en activatie van verschillende subsets van dendritische cellen (DCs), die op hun beurt leiden tot activatie van antigeen multilineage specifieke T-cellen 2,3. Aangezien DCs de enige immuuncel populatie met de mogelijkheid om antigenspecifieke naïeve T-cellen activeren 4, de studie van hun functie tijdens de vaccinatie essentieel voor de immuunrespons op vaccins begrijpen en toekomstige strategieën te ontwikkelen tegen pathogenen uitdagend.
Een systeem dat opsporing van verschillende DC subsets tijdens de immuunrespons op vaccins zou wenselijk zijn om een nauwkeurige kinetiek van DC migratie naar lymfoïde weefsel vast te stellen en derhalve te voorzieninzicht in de fysiologische mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de initiatie van de vaccin-specifieke adaptieve immuniteit. Reverse genetica gebaseerde aanpak bieden de mogelijkheid genereren gemodificeerd levend-verzwakte vaccins die experimenteel kan worden met dit doel. Sinds de uitvoering ervan op influenza onderzoek, heeft-plasmide gebaseerde reverse genetics op grote schaal toegepast om recombinante influenzastammen inclusief LAIVs genereren. Standaardprotocollen te redden recombinante influenzavirussen vereist multi-transfectie van sterk transfectable cellijnen ambisense plasmiden (die zowel positieve als negatieve sense RNA) die de acht segmenten van influenza virus en amplificatie in een tolerante systeem zoals Madin-Darby Canine Kidney ( MDCK) cellen en / of geëmbryoneerde kippeneieren 5. De toepassing van reverse genetica moleculaire technieken genereren om de immune mechanismen van vaccinatiestudie blijft onontdekt.
The generationvan nieuwe muismodellen waardoor specifieke uitputting van immuuncelsubklassen, inclusief DC, heeft geopend nieuwe mogelijkheden om de fundamentele immuun onderliggende mechanismen-vaccin ontlokte bescherming begrijpen. De vergelijking tussen DC subgroep functies in muis en mens is gebleken dat, voor een groot deel, muis en humane DCs functioneel homoloog 6,7 Deze bevindingen suggereren sterk dat de ontwikkeling van muismodellen om specifieke depletie van DCs in de steady state en bij ontstekingsaandoeningen, kan dienen om de fysiologie van DC responsen in mensen begrijpen. In de afgelopen jaren een aantal muismodellen zijn gegenereerd dragende transgenen tot expressie het simian difterietoxine (DT) receptor (DTR) onder de controle van het promotorgebied van een gen van interesse 8,9. Sinds muisweefsels nature niet uitdrukken DTR, deze modellen maken voorwaardelijke uitputting van de cel subsets die het doelwit gen van belang bij de muis inenting met DT. Aldus onze ability specifieke DCs en andere leukocyten in vivo afbreken tijdens fysiologische processen, is sterk verbeterd door de ontwikkeling van DTR-gebaseerde ro. Hoewel transgene muismodellen zijn uitgebreid toegepast om de ontogenie van het immuunsysteem begrijpen ervan op vaccinontwikkeling is nauwelijks onderzocht. Hier, door het combineren van influenza reverse genetics en DTR-gebaseerde competitieve beenmerg chimeren, stellen we een methode om de kinetiek van vaccinimmuniteit evenals individuele bestudering van genfunctie tijdens de immuunrespons op vaccins in vivo. De toepassing van deze technologie voor preklinische evaluatie van nieuwe vaccins tegen uitdagende infectieziekten kan bijdragen tot vaccinontwerp rationaliseren en vaccin gegadigden in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal experimenten werden uitgevoerd volgens de goedgekeurde protocollen en volgens de richtlijnen van de Duitse dierenbescherming wet. Alle medewerkers uitvoeren van dierproeven doorgegeven opleidingen volgens categorie B of C van de Federation of European Laboratory Animal Science Associations.
1. Generatie van recombinant levend verzwakt Influenza Vaccines door Reverse Genetics
OPMERKING: De gedetailleerd protocol voor het genereren van recombinant influenzavirussen van reverse genetics is beschreven door de vorige studies 5 en buiten het bereik van dit rapport. In het kort wordt redding van koude aangepaste griepvaccins (CAV) gedaan in een klasse II bioveiligheid kast onder bioveiligheidsniveau 2 (BSL2) insluiting, en omvat stappen hieronder. De transfectie en infectie protocol volgt die van Martinez-Sobrido et al. 5.
- Genereer een reassortant koude aangepast influenzavirusvaccin gebruikt als achtergrond van de aan koude aangepaste stam A / Ann Arbor / 6/60 (H2N2), en het hemagglutinine (HA) en een gemodificeerde neuraminidase (NA) van de A / PR / 8/34 (H1N1) stam ( Figuur 1A). De wijziging in het NA-gen bestaat uit een PCR-gebaseerde vervanging van een geconserveerde sequentie in het eiwit steel (resten 65-72) van een korte cDNA sequentie die voor het kippen ovalbumine (OVA) afgeleide peptide SIINFEKL (Figuur 1B). De SIINFEKL peptide een zeer immunodominant peptide in de context van de H-2b MHC klasse I-beperkte reactie van C57BL / 6-muizen 12.
- Plate 10 6 293T-cellen per putje in 6-well platen middels DMEM 10% foetaal runderserum (FBS) aangevuld met 1% penicilline / streptomycine (P / E).
- Bereid plasmide transfectie mengsel: Voeg 1 pg van elk van de plasmiden die coderen voor PB2 cDNA, PB1, PA, NP, M, NS van influenza A / Ann Arbor / 6/60-stam en 1 ug van de plasmiden die coderen voor de NA -SIINFEKL enHA van influenza A / PR / 8/34. Add voorverwarmde OptiMEM (15 pl voor een eindvolume van 100 gl / putje).
- Incubeer transfectie mix gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 100 ul van transfectiemengsel / putje en incubeer gedurende 16 uur bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Verander celmedia DMEM met 0,3% BSA 1% P / E bij 33 ° C en 5% CO2 gedurende 5 uur.
- Voeg 10 6 influenza permissieve MDCK cellen in DMSO die 1 ug / ml trypsine uit runderen pancreas behandeld met L-1-Tosylamide-2-fenylethyl chloormethylketon (TPCK-trypsine). Handhaaf de 293T-MDCK co-kweken voor 2-3 dagen bij 33 ° C en 5% CO 2.
- Verzamel supernatanten van MDCK-293T cellen co-kweken en duidelijk door centrifugatie bij 260 xg gedurende 5 minuten.
- Inoculeer 9-10 dagen oude kippen bevruchte eieren in steriele omstandigheden. Hiervoor maken een gat op de top van de eierschaal zoals aangegeven door Martinez-Sobrido et al. 5.
- Bedek de eierschaal with gesmolten was met een wattenstaafje en incubeer de geënte kippeneieren gedurende 3 dagen bij 33 ° C.
- Oogst de allantoïsvocht van de besmette bevruchte eieren: Was de eierschalen met 70% ethanol. Open het ei met een zeer zacht scheur in het bovenste gedeelte en verwijder de allantoïs membraan met steriele pincet. Gebruik een pipet 10 ml te verzamelen zoveel vloeistof mogelijk (gewoonlijk 6-10 ml). Centrifugeer bij 260 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en breng het gewiste allantoïsvloeistof nieuwe buizen.
2. Tracking Vaccin-specifieke immuniteit
- Opsporen van peptide-dragende dendritische cellen (DCs)
- Voor muizen vaccinatie verdoven muizen met 5% isofluraan in zuurstof met een precisie vaporizer. Gebruik een pipet om 200 ul 50 ul PBS dat 10 3-plaque vormende eenheden (pfu) van het vaccin de SIINFEKL peptide via druppeltjes expressie direct naar muis neus toedienen.
- Drie dagen na de vaccinatie, euthanize muizen via isofluraan anesthesie gevolgd door cervicale dislocatie.
- Til de muis huid op de middenlijn net onder de ribbenkast met een tang en snijd een kleine incisie door de huid met een schaar. Vanuit het oogpunt van de incisie, maak een 3-5 cm lange dwars door de huid naar beide kop en staart, vervolgens twee incisies 2 cm vanaf de middellijn zijwaarts van elk eind. Trek de huid naar de peritoneale holten en thoracale onthullen. Knip voorzichtig door de membranen rond het buikvlies aan de thorax bloot.
- Om het mediastinum stuurde de diafragma en de onderkant van de kooi rib. Zoek en verwijder 2 mediastinale lymfklieren (MLNS), iets dorsaal en lateraal grenst aan de thymus, mediaal grenzend aan de brachiocephalicus slagader, in de buurt van de ventrale zijde van de luchtpijp.
- Om de oogst van het MLNS gebruiken gebogen pincet. Plaats tang onder de lymfeklieren en trek ze voorzichtig omhoog. Plaats lymfeklieren in een 6-wells plaat met 1 ml DMEM en verwijder alle verbve of vetweefsel rond het knooppunt.
- Plaag elk monster grondig met twee 26 G naalden grenst aan 1 ml injectiespuiten. Om de lymfeklier plagen, houd hem neer met een naald tijdens het openbreken van de lymfeklieren met de andere naald. Wanneer dit goed gebeurt, geconcentreerd cellen barsten van de lymfeknoop gemakkelijk waargenomen in de media. Pass alle weefsel materiaal door een 70 um nylon filter om enkele celsuspensies te verkrijgen.
- Centrifuge enkele cel suspensies gedurende 10 min bij 260 xg in een gekoelde centrifuge. Resuspendeer de cel pellet in 2 ml van rode bloedcellen Lysing (RbCl) buffer om rode bloedcellen te lyseren. Laat lysis men gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Neutraliseren rbcL buffer via centrifugeren en cel resuspensie in 2 ml ijskoude PBS.
- Plaat cellen in U-vormige 96-well platen in een concentratie van 10 7 cellen / ml in een uiteindelijk volume van 100 pi.
- Voor flowcytometrieanalyse, blok cel Fc-receptoren met behulp1 ug anti-muis CD16 / CD32 antilichamen per 10 6 cellen gedurende 15 min op ijs.
- Centrifuge borden en gooi supernatantia door bord te vegen. Incubeer afzonderlijke putjes met het oppervlak antilichaam combinatie van keuze. Typisch voor detectie van dendritische cellen in lymfklieren, de antilichaam cocktail moet omvatten: 0,25 ug anti-CD 11 c, CD 11 b 0,25 ug, 0,5 ug van MHC klasse II, 0,25 ug CD103 en 0,15 ug CD8a in een eindvolume van 100 ul.
- Bij negatieve gating, voeg 0,25 ug anti-CD3, CD19, NK1.1 of een afstamming cocktail (Figuur 2A). Alternatieve gating strategieën en protocollen voor een juiste vergoeding van meerdere fluorescerende kleurstoffen kunnen worden gevonden op de website van de immunologische Genome Project. Naast de oppervlakte markers gekozen, voeg 1 ug van een antilichaam tegen H-2Kb gebonden aan SIINFEKL aan de cocktail. Dit commercieel beschikbaar antilichaam zal visualisatie van DCs i toestaann die SIINFEKL peptide gebonden aan MHC klasse I oppervlakte
- Incubeer de cellen met antilichamen tegen oppervlak 30 min op ijs. Bescherm plaat uit licht. Centrifugeer platen bij 260 xg gedurende 5 minuten en wassen met 2 ml PBS twee keer. Overdracht cellen om flowcytometrie buizen voor analyse.
- Evaluatie van het vaccin-specifieke T-cel proliferatie
- Verkrijgen van donor-T-cellen uit commercieel verkrijgbare TCR-transgene muizen (OT-I-muizen) (C57BL / 6-Tg (Tcr aTcrb) 1100Mjb / J) waarbij alle gegenereerde CD8 T-cellen specifiek voor het SIINFEKL peptide. Euthanaseren muizen met isofluraan anesthesie gevolgd door cervicale dislocatie. Oogst de milt door het uitvoeren van een incisie in de buikholte. Plaats milt / s in 2 ml DMEM / milt en verwijder bindweefsel en vetweefsel.
- Genereer enkele cel suspensies van milt na de in 2.1.2 en 2.1.3 beschreven procedure.
- Om verder te verrijken de enkele celsuspensie op T-cellen, gelden magnetische kraal scheiding protocollenmet behulp van positieve of negatieve selectie procedures 12. Om donor van de ontvanger cellen te onderscheiden, gebruik congene muizen zodat bijvoorbeeld ontvangende muizen drukken de leukocyten marker CD45.1 terwijl donor T-cellen te uiten CD45.2 12.
- Om T-cellen te labelen, incubeer ze in 1 ml PBS dat 5 uM carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) een optimale celdichtheid van 5 x 10 6 cellen / ml. Incubeer cellen gedurende 20 minuten bij 37 ° C beschermd tegen blootstelling aan licht. Na incubatie Centrifugeer cellen bij 260 xg gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer cellen in 3 ml foetaal runderserum (FBS) te neutraliseren CFSE.
- Centrifugeer cellen bij 260 xg gedurende 10 min en resuspendeer in het toereikend volume PBS dat 100 pi oplossing bevat 2 x 10 6 cellen. Bezielen ontvanger congene muizen met 2 x 10 6 cellen / muis via retro-orbitale sinus injectie 13.
- Euthanaseren ontvangende muizen op dag 3, 4 en 5 post-vaccinatie met behulp van isofluraan anesthesie gevolgd door cervicale dislocatie. Oogst mediastinale lymfeklieren en voor te bereiden enkele celsuspensies voor flowcytometrie zoals aangegeven in 2.1.2-2.1.5.
- Identificeer donorcellen door kleuring van de eencellige suspensies in 100 ui van een antilichaam cocktail bevattende: 0,25 ug anti-muizen CD3, CD4 en CD8 antilichamen; 0,5 ug anti-muis antilichaam CD45.1 of CD45.2 (afhankelijk van het fenotype van donorcellen). Laat de FL-1 kanaal van de flowcytometer geopend (FITC) aan de verwatering profiel van CFSE 12 (figuur 2B) te bepalen.
3. Chimère muizen Gene-specifieke Vaccin Reacties ontleden
Opmerking: Het produceren van competitieve beenmerg middels chimaera DTR-gebaseerde muismodellen maakt discriminatie van celspecifieke functies tijdens immuunrespons op vaccins. Hier laten we een extra strategie welke combinatie van DTR-uiting donor cel met cellen uit knockout muizen toelaat om gen-specifieke functies te bestuderen tijdens de immuniteit in specifieke cel compartimenten. In het voorbeeld genereren we muizen met specifieke verwijdering van toll-like receptor 3 (TLR3) in Langerin + CD103 + DCs.
- Bereiding van beenmerg donorcellen
- Werken onder een bioveiligheidsniveau II kabinet. Vermijd verontreiniging door het gebruik van uitsluitend geautoclaveerd instrumenten.
- Om beenmerg chimere muizen te genereren, gebruiken congene CD45.1 + C57BL / 6 vrouwelijke muizen als ontvangers en gebruik TLR3 - / -, Langerin-DTR / EGFP, of wt muizen die CD45.2 + als donor. Met congenic donor en ontvangende muizen maakt de differentiatie van donor en ontvanger cellen via stroomcytometrie en dit laat enting worden geëvalueerd.
- Om donor beenmergcellen te verkrijgen, euthanaseren donor muizen met isofluraananesthesie gevolgd door cervicale dislocatie. Met een scherpe schaar voeren incisies rond de enkels, zodat de mOuse musculatuur wordt blootgesteld.
- Met behulp van stompe tang trekken muis huid en vacht van de enkel in de richting van de heupen zodat beenspieren zichtbaar zijn.
- Met scherpe schaar knippen muis benen op de hoogte van de heupen en boven de kop van het dijbeen.
- Plaats benen op een petrischaal en op ijs. Werk snel en verwijder alle spieren aan de botten bloot.
- Aparte bovenbenen en tibiae. Plaats botten in een oplossing van 70% ethanol gedurende 5 minuten om eventuele bacteriën te verwijderen en deze direct op een andere petrischaal met 5 ml serumvrij DMEM. Snijd bot eindigt met een scherpe schaar en spoel het beenmerg in de DMEM. Hiervoor spoelen 1 ml van DMEM in het bot door het met een 26 G naald bevestigd aan een injectiespuit 5 ml. Zorg ervoor dat de botten er wit uitzien (leeg) na het spoelen.
- Verzamel alle beenmergcellen van donor muizen in 10 ml DMEM. Genereer enkele cel suspensies van beenmergcellen door het passeren van de oogst door een 70 um cel zeef.
- Clear enkelvoudige celsuspensies van beenmergcellen door centrifugatie bij 260 xg gedurende 10 min bij 4 ° C in een gekoelde centrifuge. Resuspendeer celpellet in 10 ml PBS. Afbreken rode bloedcellen middels rbcL oplossing zoals beschreven in 2.1.3 en 2.1.4.
- Telling beenmergcellen behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celteller. Beoordelen cel levensvatbaarheid door bepaling van dode cellen via trypaanblauw vlekken 13. Optimaal één enkel dier levert ongeveer 3 x 10 7 witte bloedcellen / muis met een levensvatbaarheid van ten minste 80%.
- Bij totale beenmerg chimaera bereiden TLR-3 - / - en wt donorcellen. De optimale celconcentratie is 2 x 10 7 cellen / ml sinds 2 x 10 6 cellen in 100 pi PBS worden gebruikt voor transplantatie. Indien niet onmiddellijk gebruikt, behouden donorcellen bij -80 ° C met behulp van trage invriezen technieken en FBS met 10% DMSO. Voor de gemengde chimerische model, meng Langerin-DTR-donorcellen en TLR3 - / -
- Mouse bestraling en transplantatie
- Bestralen vrouwelijke muizen tussen 6-8 weken oud in een Cesium-137 bron bestraler. Geef muizen twee doses van 550 rad 4 uur apart. Split bestraling minimaliseert acute levertoxiciteit en vermindert dus de muis dodelijkheid te wijten aan de bestraling protocol.
- Na bestraling houden muizen onder behandeling met antibiotica gedurende twee weken. Geef antibiotica met het drinkwater op 2,5-5 mg Baytril / kg.
- 2 - 4 uur na de tweede bestraling, transplantatie muizen met donor beenmergcellen intraveneus. Voer de injectie van donorcellen via retro-orbitale sinus injectie 13 en onder isofluraan anesthesie maximumwaarden volume van 100 ul PBS dat 2 x 10 6 cellen.
- Vier weken na transplantatie evalueren engraftment in een monster van 100gl perifeer bloed via stroomcytometrie onder toepassing van een machine dat minstens twee kleuren lezen. Om onderscheid te maken tussen donor en radio-resistente ontvangende cellen, commercieel verkrijgbaar fluorescent gelabelde CD45.1 en CD45.2 anti-muis antilichamen met behulp van verdunningen tussen 1/100 en 1/200. Optimale enting van donorcellen ten minste 80% van hematopoietische cellen in perifeer bloed.
- Vaccinatie en doelgerichte uitputting
- Vaccineren muizen met recombinant levend verzwakt griepvaccin via intranasale. Voor muizen vaccinatie verdoven muizen met 5% isofluraan in zuurstof met een precisie vaporizer. Gebruik een pipet om 200 ul 50 ul PBS dat 10 3-plaque vormende eenheden (pfu) van het vaccin toe.
- Bij het inbrengen muismodel genereren behandel muizen met 50 ng DT verdund in 50 pl PBS intranasaal. Dien DT druppel voor druppel rechtstreeks aan de neusgaten van verdoofde muizen, zoals beschreven in 3.3.1. Treat mice met dagelijkse doses begin van de behandeling op dag -2 voor de vaccinatie tot en met dag 2 na de vaccinatie (Figuur 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generering van recombinant levend geattenueerde influenza vaccins kunnen worden bereikt door transfectie van plasmiden die coderen voor de acht segmenten van influenza virus onder controle van bidirectionele promoters 5. Een koude aangepast influenzavaccin bevat gewoonlijk zes segmenten van een aan koude aangepaste stam en de HA en NA van influenza-stam gekozen (bijvoorbeeld H1N1) (Figuur 1A). Het principe van aanpassing aan koude is gebaseerd op virus beperkte replicatie bij 33 ° C, de temperatuur van de bovenste luchtwegen (URT) bij muizen en mensen 14. Daarom kan het vaccin repliceren enigszins in de URT maar kan niet leiden lagere luchtwegen longontsteking. Het gebruik van fusie PCR-technologie, een geconserveerd gebied in de steel van het virale neuraminidase (NA) wordt gewisseld voor een traceerbaar OVA-afgeleide peptide (SIINFEKL) (Figuur 1B).
Om vaccin-specifieke reacties in kinetiek studies volgen we hebben benut traceerbaar peptiden afgeleid van het vaccinpreparaat en chimère muismodellen. Tussen dag 3 en 6 na vaccinatie, SIINFEKL-dragende CD103 + DCs kan worden gedetecteerd in de long drainerende lymfeklieren 12 (Figuur 2A). Multiparametrische flowcytometrie maakt kwantificering van vaccin afgeleide antigeenpresentatie in real time. Bovendien infusie van SIINFEKL-specifieke T cellen te kwantificeren vaccin-specifieke CD8 T cellen (Figuur 2B).
Om gen-specifieke functies te evalueren tijdens vaccinatie we bedacht een muismodel te combineren DTR-technologie en concurrerende beenmerg hersenschimmen (figuur 3A). Hierdoor verlies van genfunctie is gericht op specifieke celcompartimenten de loop van de immuunrespons op de vaccinatie (Figuur 3B, C).
52.803 / 52803fig1.jpg "/>
Figuur 1. Technische traceerbare LAIVs. (A) Influenza segmenten gekloneerd in plasmiden ambisense (PDZ backbone zoals beschreven door Martinez-Sobrido et al. 5) werden getransfecteerd in 293T cellen met behulp van Lipofectamine 2000 24 uur na transfectie supernatanten verkregen uit 293T cellen werden gebruikt voor het bekleden influenza-tolerante Madin-Darby hondennier (MDCK) cellen in de aanwezigheid van 1% van TPCK trypsine. Al het protocol werd uitgevoerd bij 33 ° C. Virale supernatanten van MDCK-cellen werden vervolgens geïnoculeerd in 9 dagen oude bevruchte kippen eieren gedurende drie dagen bij 33 ° C. Virale rescue werd bevestigd door PCR-gebaseerde virale genoom amplificatie en sequencing. (B) De OVA afgeleide SIINFEKL peptide te voegen in de griep neuraminidase (NA), een geconserveerd gebied (resten 65-72) van het NA-gen van A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) virus werd vervangen door een korte cDNA dat codeert voor het peptide SIINFEKL via fusionPCR. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Vaccin tracing technieken. (A) Trekkende DC werden afgesloten in de mediastinale lymfklieren (MLNS) als CD11c med MHC klasse II hi cellen. In de voorbeeld-antigeen dragende trekkende CD103 + DC werden geïdentificeerd als CD103 + H-2 b -SIINFEKL + cellen door flowcytometrie. (B) OT-I-specifieke T-cellen werden toegediend aan muizen op de dag van vaccinatie. Vier dagen later werden de cellen verzameld uit de lymfeknopen van gevaccineerde muizen en beoordeeld op hun proliferatie profiel. CFSE verdunning op de FL-1 kanaal werd gebruikt als indicator van de celdeling. CAV: Cold-aangepaste vaccin; CAV SIINFEKL :. Koude-aangepast vaccin dat OVA-afgeleide SIINFEKL peptide Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Gene functie studies. (A) Schematische weergave van beenmerg hersenschimmen (BMC) en vaccinatie-strategieën. (-2 En 2 hebben betrekking op toediening van DT twee dagen vóór of na vaccinatie). (B) toevoeging van DT in chimere muizen die Langerin-DTR maakt specifieke depletie van migrerende Langerin + DCs CD103 co-expressie in de long. (C) Comparative analyse vaccin-specifieke T-cellen in chimere muizen. Detectie van NP 366-374-specifieke CD8 T-cellen werd gedaan via commerciële dextramer vlekken.803fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie beschrijven we hoe reverse genetics chimerische muismodellen kan worden gebruikt om de fysiologische en moleculaire mechanismen van door vaccin geïnduceerde immuniteit te helderen. Influenza reverse genetics is opgericht in veel laboratoria en heeft een hoofdrol in het begrijpen van influenza pathogenese, replicatie en transmissie 17 gespeeld. Een belangrijk punt in ons protocol is redding van koude aangepaste influenzavaccins uiting buitenlandse epitopen. Hoewel de strategie van integratie van de korte cDNAs in de steel van het neuraminidase is beschreven door vele groepen, de onderzoeker moet voorkomen dat extra mutaties tijdens vaccinproductie in eieren en dat het vaccin in staat is tot replicatie in het ademhalingskanaal en zonder het geïntroduceerd longontsteking 5,12. Aangezien zowel de stengel van het virale neuraminidase en andere gebieden van het influenza-genoom, zoals de NS-gensegment en PB1 segment verdeling van vreemde sequenties 1 toestaan9,20, kunnen modificaties van ons protocol worden gebruikt om extra vreemde peptiden, bijvoorbeeld begrijpen de hiërarchieën van de T-cel immuunreactie tegen griepvirus, onmisbaar voor rationeel vaccinontwerp voegen.
Door het combineren traceerbaar vaccins en DTR-gebaseerde depletie van DC subsets we in staat om verlies van genfunctie specifieke cel subsets gericht zijn. Deze techniek is toegepast voordat immuunrespons tegen pathogenen 21 verhelderen, maar niet trajecten belast vaccinbescherming ontleden. Door de beschikbaarheid van DTR-gebaseerde modellen en de flexibiliteit van de techniek om chimere muizen te genereren, kan deze techniek verder worden uitgebreid met extra leukocyt populaties en genen met immuunfuncties. Het is belangrijk op te merken dat DT behandeling ook leiden tot de uitputting van additionele DC subsets expressie Langerin zoals CD8a + DCs in de lymfoïde weefsels. Daarom wordt het sterk aanbevolen om perform een dosis-respons studie naar de effecten van DT behandeling te evalueren. Een potentieel nadeel van ons model is dat allogene beenmergtransplantatie is aangetoond dat algehele antiviral CD8 T cel immuniteit 15 verminderen. Dus, voorzichtigheid moet worden betracht bij het vergelijken van gegevens tussen de getransplanteerde en niet-getransplanteerde muizen.
Een aantal belangrijke menselijke pathogenen waarvoor vaccins zijn dringend nodig kan worden bestudeerd in muismodellen met wild-type pathogenen of muis surrogaten. Deze omvatten influenza virus, Plasmodium en Ebola virus. De in deze studie voorgestelde technieken kunnen helpen bij het begrijpen van de fundamentele mechanisme van experimentele vaccins tegen deze ziekteverwekkers en daarom vaccin ontwerp rationaliseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1x) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| OptiMEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10x | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
References
- Bevan, M. J. Understand memory, design better vaccines. Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).
- Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
- Querec, T. D. Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans. Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. 3, (2010).
- Haniffa, M. Human Tissues Contain CD141hi Cross-Presenting Dendritic Cells with Functional Homology to Mouse CD103+ Nonlymphoid Dendritic Cells. Immunity. 37, 60-73 (2012).
- Haniffa, M., Collin, M., Ginhoux, F. Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and mouse. Adv. Immunol. 120, 1-49 (2013).
- Jung, S. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17, 211-220 (2011).
- Lahl, K., Sparwasser, T. In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model. Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).
- Duffield, J. S. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J. Clin. Invest. 115, 56-65 (2005).
- Meredith, M. M. Expression of the zinc finger transcription factor zDC. J. Exp. Med. 209, 1153-1165 (2012).
- Girón, J. V. Mucosal Polyinosinic-Polycytidylic Acid Improves Protection Elicited by Replicating Influenza Vaccines via Enhanced Dendritic Cell Function and T Cell Immunity. J. Immunol. 193, 1324-1332 (2014).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. bib.usb.ve. , (1983).
- Cox, R. J., Brokstad, K. A., Ogra, P. Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines. Scand. J. Immunol. 59, 1-15 (2004).
- Gowdy, K. M. Impaired CD8(+) T cell immunity after allogeneic bone marrow transplantation leads to persistent and severe respiratory viral infection. Transpl. Immunol. 32, 51-60 (2015).
