Introduction
hastalığın yokluğunda immünolojik bellek üretimi etkili bir aşı 1 fizyolojik temelidir. Son zamanlarda, sistem biyolojisi-bazlı yaklaşımlar, sarı humma aşı olarak başarılı bir şekilde aşılar, sırayla, kurşun antijen aktivasyonunu multilineage doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinin ve dendritik hücreler (DC), birkaç alt takımından aktivasyon kuvvetli bir uyarımının neden olduğunu ortaya koymuştur Belirli T hücreleri 2,3. DH'ler, antijene özel T hücrelerinin naif 4 aktive etme kabiliyetine sahip, sadece bağışık hücre popülasyonu olduğu için, aşılama sırasında fonksiyonunun çalışması aşılara bağışıklık tepkilerini anlamak ve zorlu patojenlere karşı gelecek stratejilerini tasarımı için çok önemlidir.
Aşılara bağışıklık tepkilerinin sırasında farklı DCler alt kümelerinin izleme sağlayan bir sistem sağlamaktır, bu nedenle lenfoid dokulara DC göç doğru bir kinetik oluşturulması için arzu edilebilir, ve olurAşı özgü adaptif bağışıklık başlatılmasından sorumlu fizyolojik mekanizmaların içgörü. Genetik temelli Ters yaklaşımlar, olasılık modifiye oluşturmak için bu amaçla deneysel kullanılabilecek canlı zayıflatılmış aşılar sunuyoruz. İnfluenza araştırma uygulanması için, plazmid bazlı ters genetik yaygın LAIVs de dahil olmak üzere rekombinant influenza suşları oluşturmak için kullanılmıştır. Standart protokolleri (rekombinant influenza virüsleri gibi Madin-Darby köpek böbrek gibi hoşgörülü sistemde yükseltilmesi yanı sıra sekiz grip viral segmentleri içeren ambisens plazmid ile son derece transfectable hücre hatları (pozitif ve negatif anlamda RNA hem üreten) multi-transfeksiyonunu gerektiren kurtarmak için MDCK) hücreleri ve / veya tavuk embriyo haline getirilmiş yumurtalar 5. Bununla birlikte, aşı, bağışıklık mekanizmaları incelemek amacıyla moleküler araçlar üretmek için ters genetik uygulama keşfedilmemiştir.
nesilDC'lerle dahil bağışıklık hücre alt, spesifik tükenmesi izin yeni fare modellerinin, aşı tetiklenen koruma altında yatan temel bağışıklık mekanizmaları anlamak için yeni olanaklar açtı. farelerde ve insanlarda DC alt fonksiyonları arasında karşılaştırması büyük ölçüde, fare ve insan DH'leri güçlü, homolog işlevsel bu bulgular 6,7 olan fare modellerinin geliştirilmesi kararlı halde DC'lerin belirli bir tükenmesi izin düşündürmektedir ortaya koymuştur ve iltihaplı koşullar sırasında, insanlarda DC tepkilerinin fizyolojisini anlamak için hizmet edebilir. Son yıllarda, fare modelleri bir kaç İlgi 8,9 arasında bir genin promotör bölgesinin kontrolü altında simian difteri toksini (DT) reseptörü (DTR) eksprese eden transgenler taşıyan üretilmiştir. Fare dokuları doğal DTR ifade olmadığından, bu modeller DT ile fare inokülasyon üzerine ilgi hedeflenen genini taşıyan hücre alt koşullu tükenmesi izin verir. Böylece, abilifizyolojik işlemler sırasında in vivo özel DCler ve diğer lökosit tüketmek ty, büyük DTR-tabanlı ro gelişmesi ile geliştirilmiştir. Bu transgenik fare modelleri, immün sistemin ontogenezini anlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır ancak bununla birlikte, aşı gelişimi için uygulama pek test edilmiştir. Burada, grip ters genetik ve DTR-temelli rekabet kemik iliği kimeralar birleştirerek, biz in vivo aşılara bağışıklık yanıtları sırasında aşı bağışıklık yanı sıra bireysel gen fonksiyonu kinetiğini incelemek için bir yöntem öneriyoruz. zorlu bulaşıcı hastalıklara karşı yeni aşıların klinik öncesi değerlendirilmesi için bu teknolojinin uygulama aşı tasarımı rasyonalize etmek ve in vivo aşı adayları test etmeye yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneyleri onaylanmış protokollere ve Alman hayvan koruma yasasının yönergeleri izleyerek göre gerçekleştirilmiştir. Hayvan deneyleri yürüten tüm personel kategori B veya Avrupa Laboratuar Hayvan Bilimi Dernekleri Federasyonu C'ye göre eğitim programları geçti.
Ters Genetik tarafından Rekombinant Canlı Atenüe Grip Aşıları 1. Nesil
NOT: ters genetik rekombinant influenza virüslerinin nesil için detaylı bir protokol önceki çalışmalarda 5 tarafından açıklanan ve bu raporun kapsamı dışında olmuştur. Kısaca, soğuk adapte influenza aşıları (CAV) kurtarma biyogüvenlik seviyesinin altında bir biyogüvenlik sınıf II kabini içinde 2 (BSL2) çevreleme yapılması ve aşağıda ayrıntılı adımları içerir edilir. transfeksiyon ve enfeksiyon protokolü izler Martinez-Sobrido ve ark. 5.
- Bir reassortant soğuk adapte influenza üretarka plan olarak soğuğa uyarlanmış suş A / Ann Arbor / 6/60 (H2N2), hem de hemaglütinin (HA) ve bir tadil edilmiş nöraminidaz (NA) A / PR / 8/34 (H1N1) suşuna ait (kullanarak aşı Şekil 1A). NA geni modifikasyon tavuk ovalbümin (OVA) -türevi peptid SIINFEKL'yi (Şekil 1B) kodlayan kısa bir cDNA dizisi protein sap (kalıntılar 65-72), bir korunmuş sekans bir PCR-esaslı yerine konmalıdır. SIINFEKL peptiti C57BL / 6 farelerine 12 tepkisini I-kısıtlamalı lH-2b MHC sınıf bağlamında son derece immünodominant peptittir.
- % 1 penisilin / streptomisin (P / E) ile desteklenmiş DMEM,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile 6 oyuklu plakalar içerisinde oyuk başına Levha 10 6 293T hücreleri.
- Plazmid transfeksiyon karışımı hazırlayın: Ekle NA kodlayan PB2, PB1, PA, NP, E, NS influenza A / Ann Arbor / 6/60 soybaşı için cDNA ve plasmidlerin 1 ug kodlayan plazmidlerin her biri 1 ug -SIINFEKL veİnfluenza A / PR / 8/34 HA. (/ Oyuk 100 ul bir son hacim için 15 ul) OptiMEM önceden ısıtılmış ekleyin.
- Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile transfeksiyon karışımı inkübe edin.
- De / transfeksiyon karışımı 100 ul ilave edin ve 37 ° C'de 16 saat% 5 CO2 inkübe edin.
- 5 saat CO 2 33 ° C'de DMEM% 0.3 BSA% 1 P / E hücre ortamı değiştirmek ve% 5.
- L-1-tosilamid-2-feniletil klorometil keton (TPCK-tripsin) ile muamele büyükbaş hayvan pankreasından tripsin 1 ug / ml ihtiva eden DMSO içerisinde 10 6 influenza permisif MDCK hücreleri ekleyin. 33 ° C'de 3 gün% 5 CO2 - 2, 293T-MDCK ko-kültürler koruyun.
- 5 dakika boyunca 260 x g'de santrifüj ile MDCK 293T hücresi ko-kültürler süpernatantlar ve net toplayın.
- Steril şartlarda 10 gün eski tavuk embriyonlu yumurta - 9 aşılamak. Martinez-Sobrido ve arkadaşları tarafından gösterildiği gibi, bunun için, yumurta kabuğu üzerine bir delik açın. 5.
- Yumurta kabuğu zekâ Kapakh bir pamuklu çubuk kullanarak ve 33 ° C'de 3 gün boyunca aşılanmış tavuk yumurtası inkübe balmumu erimiş.
- Enfekte embriyolu yumurtaların alantoik akışkan hasat:% 70 etanol ile yumurta kabuklarını yıkayın. Çok yavaşça üst kısmında çatlak ve steril forseps kullanarak allantoik membran kaldırmak bir ile yumurta açın. (- 10 ml, tipik olarak 6) mümkün olduğu kadar çok sıvıyı toplamak için bir 10 ml'lik bir pipet kullanın. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 260 x g'de santrifüj ve yeni tüplere alantoik temizlenmiş sıvı transferi.
2. İzleme Aşı özgü Bağışıklık
- Peptid taşıyan dendritik hücrelerin İzleme (DC)
- Fare aşılama için, hassas buharlaştırıcı kullanılarak oksijen içinde% 5 izofluran ile fareler uyutmak. Fare burun doğrudan damlacıkları yoluyla SIINFEKL peptiti eksprese eden aşı 10 3 plak oluşturucu birim (pfu) ihtiva eden PBS içinde 50 ul yönetmek için bir 200 ul bir pipet kullanın.
- Post-aşılama, euthaniz Üç günizofluran anestezi ile E fareler, servikal dislokasyon ile takip etti.
- Sadece forseps ile göğüs kafesi altındaki orta hatta fare cildi kaldırın ve makas ile deri yoluyla küçük bir kesi kesti. 5 cm uzunluğunda her iki ucundan yanal orta hattan sonra, baş ve kuyruk hem doğru deri yoluyla iki 2 cm'lik kesiler kesti - kesi açısından, 3 yapmak. Peel geri cilt periton ve toraks boşlukları ortaya çıkarmak için. Dikkatle toraks maruz periton çevreleyen zarların kesti.
- Mediasten DIAFRAGMA ve kafes kaburga alt kesti erişmek için. Biraz dorsal ve ventral trakea kenarına yakın, brakiyosefalik arterin medial bitişik timus yanal bitişik, bulun ve 2 mediastinal lenf düğümleri (mLNs) çıkarın.
- MLNs kavisli bir forseps kullanmak hasat. Lenf düğümleri altına forseps yerleştirin ve yavaşça onları yukarı çekin. DMEM 1 ml ihtiva eden bir 6-yuvalı plaka içinde, lenf düğümleri yerleştirin ve bir bağlant kaldırmave veya yağ dokusu düğümü çevreleyen.
- 1 ml 'lik şırıngaya iliştirilmiş iki 26 G iğne ile iyice her bir örnek alay. Diğer iğne ile lenf nodu açık kırarak lenf nodu alay için, bir iğne ile basılı tutun. Bu doğru yapıldığında, lenf düğümünden patlama konsantre hücreleri kolayca medyada görülmektedir. Tek hücre süspansiyonları elde etmek için bir 70 um naylon filtre vasıtasıyla tüm doku materyali geçirin.
- Soğutuculu santrifüj 260 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj tek hücre süspansiyonları. Kırmızı kan hücrelerinin lize kırmızı kan hücresi Parçalama (rbcL) Tamponu 2 ml hücre pelletini. Liziz oda sıcaklığında 3 dakika boyunca ilerlemesine izin verir.
- Buz soğukluğunda PBS 2 ml santrifüj ve hücre yeniden süspanse ile rbcL tamponu nötralize.
- Levha hücreler 100 ul nihai hacim içinde 10 7 hücre / ml bir konsantrasyonda 96 oyuklu plakaları U-şekillidir.
- Analiz, blok hücre Fc-reseptörleri akış sitometrisi kullanılarakBuz üzerinde 15 dakika boyunca 10 6 hücre başına anti-fare CD16 / CD32 antikorlarının 1 ug.
- Santrifüj plakalar ve plaka Flicking tarafından süpernatantlar atın. Tercih edilen yüzey antikoru kombinasyonu ile, ayrı ayrı kuyuların inkübe edin. Tipik haliyle, lenf düğümleri dendritik hücrelerin saptanması için, antikor kokteyli içermelidir: 0.25, anti-CD11c ug, CD11b, 0.25 ug, MHC sınıf II, 0.5 ug, CD103, 0.25 ug ila 100 arasında bir nihai hacim içinde CD8α 0.15 ug ul.
- Negatif gating, anti-CD3, CD19, NK1.1 veya nesilli kokteyli (Şekil 2A), 0.25 ug ekleyin. Alternatif yolluk stratejileri yanı sıra birden fazla floresan boyalar uygun tazminat protokolleri immünolojik Genom Projesi'nin web sitesinde bulunabilir. Tercih edilen yüzey belirteçleri ek olarak, kokteyl SIINFEKL bağlı lH-2K B'ye karşı bir antikorun 1 ug ekleyin. Bu piyasada mevcut antikor DC'lerin i görselleştirme sağlayacakSIINFEKL peptid MHC sınıf I yüzey bağlı olduğu N
- Buz üzerinde 30 dakika boyunca yüzey antikorlar ile inkübe hücreleri. Işıktan plaka koruyun. 260 x g'de santrifüjleyin plakalar 5 dakika boyunca PBS ile iki kez 2 ml ile yıkanır. Analiz için sitometri tüpleri akış hücreleri aktarın.
- Aşı-spesifik T hücresi çoğalmasının değerlendirilmesi
- Ticari olarak temin edilebilen TCR-transgenik farelerden (OT-I fare) donör T hücrelerinin elde edilir (C57BL / 6-Tg (TCR aTcrb) 1100Mjb / J) içinde üretilen tüm CD8 T hücreleri ve SIINFEKL peptiti için spesifik olan. Servikal dislokasyon izofluran anestezi fareler öldürülür. Karın boşluğunda bir kesi yaparak Hasat dalak. DMEM / dalak 2 ml dalak / s yerleştirin ve bağ ve yağ doku kaldırmak.
- 2.1.2 ve 2.1.3 tarif edilen prosedür takip edilerek dalak tek hücre süspansiyonları oluşturmak.
- Ayrıca T hücreleri üzerindeki tek bir hücre süspansiyonu zenginleştirmek için, manyetik boncuk ayırma protokolleri uygulamakpozitif veya negatif seleksiyon prosedürleri 12 kullanarak. Alıcı hücrelerinden donör ayırt donör T hücreleri CD45.2 12 ifade ederken, örneğin alıcı fareler lökosit işaretleyici CD45.1 ifade böylece konjenik fareler kullanın.
- T hücreleri etiketlemek için, 5 x 10 6 hücre / ml'lik bir optimum hücre yoğunluğunda carboxyfluorescein süksinimidil ester (CFSE) 5 uM ihtiva eden 1 ml PBS içinde inkübe. Işığa maruz korunmaktadır, 37 ° C'de 20 dakika süreyle inkübe hücreleri. İnkübasyondan sonra, 3 ml cenin sığır serumu (FBS) içinde, 5 dakika, ıskarta yüzer, ve tekrar süspansiyon hücreleri için 260 x g'de santrifüj hücreleri CFSE etkisiz hale getirir.
- PBS yeterli hacmi içinde, 10 dakika ve tekrar süspansiyon içinde 260 x g'de santrifüjleyin hücreleri çözeltisinin 100 ul 2 x 10 6 hücre içerir, böylece. 2 x 10 6 hücre / retroorbital sinüs enjeksiyon yoluyla 13 fare ile alıcı konjenik fareler infüze.
- Günler 3, 4 ve 5 Direk- de alıcı fareler Euthanizeservikal dislokasyon tarafından takip Izofluran anestezi kullanılarak aşılama. Lenf düğümleri hasat ve 2.1.2-2.1.5 belirtildiği üzere akış sitometrisi için tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması.
- Ihtiva eden bir antikor kokteyli 100 ul tek hücre süspansiyonları boyama ile donör hücrelerin belirlenmesi: anti-fare CD3, CD4 ve CD8 antikorları, 0.25 ug; Anti-fare CD45.1 ya CD45.2 antikoru (donör hücrelerin fenotipi bağlı olarak) 0.5 ug. CFSE 12 (Şekil 2B) seyreltme profilini belirlemek için, açık (FITC) akış sitometresi FL-1 bir kanal bırakın.
Gen-özgü aşı Yanıt incelemek için 3. Kimerik fareler
Not: DTR tabanlı fare modelleri kullanılarak rekabetçi bir kemik iliği kimeralar üretilmesi aşılara bağışıklık yanıtı sırasında hücreye özel fonksiyonların ayırt edilmesini sağlar. Burada hangi kombinasyonu ile donör c DTR-ifade ek bir strateji göstermekknockout farelerde izni alınan hücrelerle arşın spesifik hücre bölümlerinde bağışıklık sırasında gen özel fonksiyonları incelemek için. Örnekte Langerin + CD103 + DCler Toll-benzeri reseptör 3 (TLR3) spesifik delesyonu ile fareleri üretmek.
- Kemik iliği donör hücrelerin hazırlanması
- Bir biyogüvenlik düzeyi II kabinin altında çalışmak. Münhasıran Otoklavlanmış araçları kullanarak kirlenmesini önlemek.
- , Kemik iliği kimerik fareler üretmek alıcı olarak konjenik CD45.1 + C57BL / 6 dişi fareleri kullanabilir ve TLR3 tarafından kullanmak için - / -, Langerin- DTR / EGFP veya wt fareler bağışçılar olarak CD45.2 + dile getirdi. Konjenik donör ve alıcı fareler kullanılarak akış sitometrisi ile, verici ve alıcı hücrelerin farklılaşmasını sağlar ve melezleme değerlendirilmesini mümkün kılar.
- Donör kemik iliği hücreleri elde servikal dislokasyon tarafından takip izofluran anestezi ile donör fareler euthanize. Keskin makas ayak bilekleri civarında kesiler yerine birlikte m kiouse kas maruz kalmaktadır.
- O bacak kasları görünür, böylece kullanılması künt forseps kalça doğru ayak bileği hafifçe fare deri ve kürk çekin.
- Keskin bir makas ile kalça hizasında ve femur başının üstünde fare bacaklarını kesti.
- Bir petri tabağına ve buz üzerinde bacakları yerleştirin. Hızlı çalışın ve kemikleri açığa çıkarmak için tüm kasları kaldırın.
- Ayrı femur ve tibia. Mümkün olan bakterileri yok ve serum içermeyen DMEM 5 ml ihtiva eden bir petri kabı hemen yerleştirmek için 5 dakika boyunca% 70 etanol çözeltisi içinde kemik yerleştirin. Kesme kemik DMEM içine kemik iliği keskin bir makas kullanarak ve floş biter. 5 ml şırıngaya takılı 26 G'lik bir iğne sokarak kemik içine, bu nedenle DMEM hizada 1 ml yapmak için. Kemikler yıkamadan sonra beyaz (boş) bakmak emin olun.
- DMEM, 10 ml donör farelerden gelen tüm kemik iliği hücreleri toplamak. 70 mikron hücre süzgecinden geçirerek hasat kemik iliği hücrelerinden tek hücre süspansiyonları oluşturun.
- Clsoğutuculu santrifüj içinde 4 ° C'de 10 dakika boyunca 260 x g'de santrifüj ile kemik iliği hücrelerinin kulak tek hücre süspansiyonları. 10 ml PBS içinde tekrar süspansiyon hücre peleti. 2.1.3 ve 2.1.4 de açıklandığı gibi rbcL çözümünü kullanarak kırmızı kan hücreleri İncelten.
- Hemasitometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak, kemik iliği hücreleri sayın. Tripan mavisi 13 üzerinden ölü hücrelerin belirlenmesi ile hücre canlılığını değerlendirmek. En uygun olarak, en azından% 80 bir canlılığı tek hayvan verimi yaklaşık 3 x 10 7, beyaz kan hücreleri / fare.
- - / - Veya ağırlıkça donör hücrelerin toplam kemik iliği kimeralar durumunda, TLR 3 hazırlar. 100 ul PBS içinde 2 x 10 6 hücre transplantasyonu için kullanılacağından uygun hücre konsantrasyonu 2 x 10 7 hücre / ml 'dir. Derhal kullanılmadığı takdirde,% 10 DMSO ile yavaş dondurma teknikleri ve FBS kullanılarak -80 ° C'de donör hücreleri korur. Karışık kimerik model için, Langerin- DTR-donör hücreleri ve mix TLR3 - / -
- Fare ışınlama ve nakli
- Bir Sezyum-137 kaynak irradiator yaş 8 hafta - 6 arası dişi farelerin ışın tedavisi. Farelere ayrı 550 rad 4 saat iki doz verin. Bölünmüş ışınlama akut karaciğer toksisitesini azaltır ve dolayısıyla ışınlama protokol gereği fare ölümcül azaltır.
- Işık verilmesinden sonra, iki hafta içinde antibiyotik ile tedavi edilen fareler tutun. Baytril / kg 5 mg - 2.5 içme suyu ile antibiyotik verin.
- 2 - İkinci ışınlama 4 saat sonra damar içine vericinin kemik iliği hücreleri ile nakil fareler. 2 x 10 6 hücre ihtiva eden 100 ul PBS maksimum hacmi kullanılarak retro-orbital sinüs enjeksiyonu 13 üzerinden ve izofluran anestezi altında donör hücrelerin enjeksiyonu gerçekleştirin.
- Dört hafta naklinden sonra, 100 numunesinde bütünleşmesini değerlendirilmesien az iki renge okuyabilecek bir makine kullanılarak akış sitometrisi ile periferal kan ul. Ticari olarak temin edilebilir floresan etiketli CD45.1 ve 1/100 ve 1/200 arasındaki seyreltileri kullanılarak CD45.2 anti-fare antikorları kullanarak, verici ve radyo dirençli alıcı hücrelere ayırt etmek. Donör hücrelerin optimal melezleme periferal kandaki toplam hematopoietik hücrelerin en az% 80'i olmalıdır.
- Aşılama ve hedeflenen tükenmesi
- Burun yoluyla rekombinant canlı zayıflatılmış grip aşısı ile aşılanmalıdır fareler. Fare aşılama için, hassas buharlaştırıcı kullanılarak oksijen içinde% 5 izofluran ile fareler uyutmak. Aşının 10 3 plak oluşturucu birim (pfu) ihtiva eden PBS 50 ul yönetmek için bir 200 ul bir pipet kullanın.
- Nihai fare modeli oluşturmak için, burun içinden PBS 50 ul seyreltilmiş DT 50 ng fare tedavi. 3.3.1 anlatıldığı gibi anestezi farelerin burun delikleri doğrudan damla damla DT yönetin. Sağlıgı migün 2 sonrası aşılama (Şekil 3B) kadar aşılama gün önce -2 tedaviye başlayan günlük dozlarda ce.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rekombinant canlı-zayıflatılmış influenza aşılarının üretilmesi iki yönlü promoterlerin 5 kontrolü altında grip virüsü sekiz segmentleri kodlayan plasmidlerin transfeksiyonu ile elde edilebilir. Soğuk adapte influenza aşısı genellikle soğuğa uyarlanmış suşu olarak hem de tercih edilen influenza suşunun HA ve NA (örneğin, H1N1) (Şekil 1A) altı segmentleri içerir. Soğuk adaptasyon prensibi 33 ° C, farelerde ve insanlarda 14 üst solunum yollarının (URT) sıcaklıkta virüs sınırlı çoğaltma dayanmaktadır. Bu nedenle, aşı RBB bir ölçüde çoğaltma ancak alt solunum yolu pnömoniye neden olabilir. Viral nöraminidaz (NA) ve kök füzyon PCR teknolojisi, korunmuş bir bölgesini kullanarak izlenebilir OVA türevli bir peptidin (SIINFEKL) (Şekil 1B) ile ikame edilmiştir.
Kinetik çalışmalarda aşı özgü yanıtları izlemek için elimizdeki Aşı formülasyonu ayrıca kimerik fare modellerinde elde edilen izlenebilir peptidlerin alınan avantaj sağlar. Gün 3 ve 6 post-aşılama arasında CD103 + DC'ler akciğer drenaj lenf tespit edilebilir SIINFEKL taşıyan 12 (Şekil 2A) düğümler. Çok parametreli akış sitometrisi, gerçek zamanlı olarak, aşı-türevi antijen sunumunun ölçümü sağlar. Buna ek olarak, SIINFEKL-spesifik T hücrelerinin infüzyon aşı spesifik CD8 T hücre yanıtları (Şekil 2B) ölçümü sağlar.
Aşılama sırasında gene özel fonksiyonlarını değerlendirmek için biz DTR teknolojisi ve rekabetçi kemik iliği kimeralar (Şekil 3A) birleştiren bir fare modeli tasarladı. Bu şekilde, gen fonksiyonunun kaybının aşı bağışıklık tepkilerinin sırasında (Şekil 3B, C) üzerindeki belirli bir hücre bölmelerine hedeflenmiştir.
52803 / 52803fig1.jpg "/>
Izlenebilir LAIVs Şekil 1. Mühendislik. (A), ambisens plasmid içine klonlanmış Grip bölümleri (Martinez-Sobrido ve ark., 5 tarafından tarif edildiği gibi PDZ omurgası), 2000. 24 saat transfeksiyon sonrası Lipofectamine kullanılarak 293T hücrelerine 293T hücrelerinden elde edilen üst fazlar transfekte edilmiştir TPCK tripsin% 1 mevcudiyetinde kat influenza permisif Madin-Darby köpek böbrek (MDCK) hücreleri kullanıldı. Tüm protokol, 33 ° C'de gerçekleştirildi. MDCK hücrelerinden viral süpernatanlar daha sonra 33 ° C'de üç gün 9 günlük bir embriyo halindeki tavuk yumurtalarının inoküle edilmiştir. Viral kurtarma PCR bazlı viral genomun amplifikasyonu ve dizilemesi ile teyit edilmiştir. (B) A / Puerto NA geni (kalıntılar 65-72) grip nöraminidaz (NA), korunmuş bir bölgeye OVA türetilmiş SIINFEKL peptiti eklemek için Riko / 8/34 (H1N1) füzyon yoluyla SIINFEKL peptiti kodlayan kısa bir cDNA ile ikame edilmiştirPCR. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Aşı izleme teknikleri. (A) Göçmen DC'ler CD11c med MHC sınıf II hi hücreler olarak mediastinal lenf nodlarının (mLNs) 'de kapı bulundu. Örnek olarak, antijen taşıyan göç CD103 + DC'ler akış sitometrisi ile CD103 + H-2 b -SIINFEKL + hücreleri olarak tanımlandı. (B), OT-I-spesifik T hücreleri aşı aynı günde farelere infüze edildi. Dört gün sonra, hücreler, aşılanmış farelerin lenf düğümleri toplandı ve bunların proliferasyon profili için değerlendirildi. FL-1 kanalında CFSE seyreltme hücre bölünmesinin bir göstergesi olarak kullanılmıştır. CAV: Soğuk adapte aşı; CAV SIINFEKL :. OVA türevi SIINFEKL peptid ifade Soğuk uyarlanmış aşı bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Gen fonksiyon çalışmaları. Kemik iliği kuruntulardan (BMC) ve aşılama stratejileri (A) şematik. Langerin- DTR ifade kimerik farelerde DT (2 ve 2 iki gün önce ve aşılama sonrası DT tatbikat bakınız). (B) ayrıca, göçmen Langerin + DH'ler akciğerde CD103 coexpressing spesifik tükenmesi izin verir. (C) Karşılaştırmalı Kimerik farelerde aşının spesifik T hücrelerin analizi. NP 366-374-spesifik CD8 T hücrelerinin saptanması, ticari dextramer boyama ile yapıldı.803fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, aşıyla indüklenen bağışıklık fizyolojik ve moleküler mekanizmaları aydınlatmak için kullanılabilir kadar karşıt genetik ve kimerik fare modelleri açıklanmaktadır. Grip ters genetik birçok laboratuvarda kurulan ve grip patogenezi, çoğaltma ve iletim 17 anlamada bir baş rol oynamıştır. Bizim protokolde önemli bir nokta, yabancı epitopları ifade soğuk uyarlanmış influenza aşılarının kurtarma olduğunu. Nöraminidaz sap içinde kısa cDNA'ları sokulması stratejisi birçok grup ile tarif edilmiş olmakla beraber, araştırmacı ek mutasyonlar yumurtalarda aşı üretimi sırasında ve aşının neden olmadan solunum yolu içinde replike edebildiğini ortaya sağlamak için ihtiyaç pnömoni 5,12. Viral nöraminidaz sap yanı sıra NS gen segmanı ve PB1 segmenti influenza genomunun diğer bölgelerde her iki yana yabancı dizilerin 1 tahsisi izin9,20, bizim protokol modifikasyonlar, örneğin, influenza virüsü, rasyonel bir aşı tasarımı için önemli bir alanına karşı T hücresi bağışıklık tepkisi hiyerarşileri anlamak için ek dış peptidleri eklemek için kullanılabilir.
Izlenebilir aşılar ve DC alt DTR-tabanlı tükenmesi birleştirerek spesifik hücre alt gen fonksiyon kaybını hedeflemek mümkün olmuştur. Patojenlere 21 bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmak için, fakat aşının korunmasından sorumlu yollar incelemek için önce bu teknoloji uygulanmıştır. Nedeniyle DTR-tabanlı modellerin kullanılabilirliği ve kimerik fareler üretmek için teknik esneklik, bu tekniğin ayrıca bağışıklık fonksiyonları ile ek lökosit popülasyonları ve genlerine genişletilmiş olabilir. Bu DT tedavisi de lenfoid dokularda bu CD8α + DCler olarak Langerin ifade ek DC alt tükenmesi neden olabilir dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle, yüksek pe önerilirDT tedavinin etkilerini değerlendirmek için bir doz-yanıt çalışma rform. Modelin potansiyel bir uyarı allojenik kemik iliği nakli, genel antiviral CD8 T hücresi bağışıklık 15 azalttığı gösterilmiştir olmasıdır. Bu nedenle, dikkatli nakledilen olmayan transplante fareler arasında veri karşılaştırırken icra edilmesi gerekir.
Aşılar acilen gerekli olduğu birkaç önemli insan patojenleri yabani tip patojenleri ya da fare suretler kullanarak fare modellerinde ele alınabilir. Bu influenza virüsü, Plasmodium ve Ebola virüsü bulunmaktadır. Bu çalışmada önerilen teknikler aşı tasarımı rasyonalize, bu yüzden bu patojenlere karşı ve deneysel aşıların temel mekanizmasını anlamak için yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1x) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| OptiMEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10x | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
References
- Bevan, M. J. Understand memory, design better vaccines. Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).
- Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
- Querec, T. D. Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans. Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. 3, (2010).
- Haniffa, M. Human Tissues Contain CD141hi Cross-Presenting Dendritic Cells with Functional Homology to Mouse CD103+ Nonlymphoid Dendritic Cells. Immunity. 37, 60-73 (2012).
- Haniffa, M., Collin, M., Ginhoux, F. Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and mouse. Adv. Immunol. 120, 1-49 (2013).
- Jung, S. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17, 211-220 (2011).
- Lahl, K., Sparwasser, T. In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model. Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).
- Duffield, J. S. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J. Clin. Invest. 115, 56-65 (2005).
- Meredith, M. M. Expression of the zinc finger transcription factor zDC. J. Exp. Med. 209, 1153-1165 (2012).
- Girón, J. V. Mucosal Polyinosinic-Polycytidylic Acid Improves Protection Elicited by Replicating Influenza Vaccines via Enhanced Dendritic Cell Function and T Cell Immunity. J. Immunol. 193, 1324-1332 (2014).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. bib.usb.ve. , (1983).
- Cox, R. J., Brokstad, K. A., Ogra, P. Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines. Scand. J. Immunol. 59, 1-15 (2004).
- Gowdy, K. M. Impaired CD8(+) T cell immunity after allogeneic bone marrow transplantation leads to persistent and severe respiratory viral infection. Transpl. Immunol. 32, 51-60 (2015).
