Introduction
La génération de la mémoire immunologique en l'absence de la maladie est la base physiologique de vaccination efficace 1. Récemment, les approches fondées sur la biologie des systèmes ont révélé que les vaccins à succès tels que le vaccin contre la fièvre jaune, induisent une forte induction de réponses immunitaires innées et l'activation de plusieurs sous-ensembles de cellules dendritiques (CD), qui à son tour, conduit à multilignée activation de l'antigène Les cellules T spécifiques 2,3. Depuis les PED sont la seule population de cellules immunitaires avec la possibilité d'activer les cellules T naïves spécifiques de l'antigène 4, l'étude de leur fonction lors de la vaccination est essentielle pour comprendre les réponses immunitaires aux vaccins et de concevoir des stratégies futures contre les agents pathogènes difficiles.
Un système permettant le traçage des différents sous-ensembles PED au cours des réponses immunitaires aux vaccins serait souhaitable afin d'établir une cinétique précis de la migration vers les tissus lymphoïdes DC, et donc de fournircomprendre les mécanismes physiologiques responsables du déclenchement de l'immunité adaptative spécifique vaccin. La génétique inverse à base approches offrent la possibilité de générer modifié, les vaccins vivants atténués qui peuvent être utilisés expérimentalement avec ce but. Depuis sa mise en œuvre sur la recherche sur la grippe, la génétique inverse à base de plasmides a été largement employé pour générer des souches grippales recombinantes dont LAIVs. Les protocoles standard pour sauver virus grippaux recombinants exigent multi-transfection de lignées très transfectables de cellules avec des plasmides de ambisens (produisant à la fois de l'ARN sens positif et négatif) contenant les huit grippe segments viraux ainsi que l'amplification dans un système permissif comme Madin-Darby de rein de chien ( MDCK) et / ou des oeufs embryonnés de poulet 5. Cependant, l'application de la génétique inverse pour générer des outils moléculaires pour étudier les mécanismes immunitaires de la vaccination demeure inexploré.
La générationde nouveaux modèles de souris permettant raréfaction spécifique de sous-ensembles de cellules immunitaires, y compris les pays en développement, a ouvert de nouvelles possibilités de comprendre les mécanismes immunitaires de base qui sous-tendent la protection vaccinale-induite. La comparaison entre les fonctions de sous-ensembles DC chez les souris et les humains a révélé que, dans une grande mesure, la souris et CD humaines sont fonctionnellement homologue 6,7, ces résultats suggèrent fortement que le développement de modèles de souris permettant raréfaction spécifique des PED à l'état stationnaire et dans des conditions inflammatoires, peuvent servir à comprendre la physiologie des réponses DC chez les humains. Ces dernières années, un certain nombre de modèles de souris a été générée portant des transgènes exprimant le récepteur de la toxine diphtérique simien (DT) (DTR) sous le contrôle de la région promotrice d'un gène d'intérêt 8,9. Depuis tissus de souris ne expriment naturellement DTR, ces modèles permettent appauvrissement conditionnelle de sous-ensembles de cellules portant le gène ciblé d'intérêt lors de l'inoculation de la souris avec DT. Ainsi, notre ability à épuiser les DC spécifiques et d'autres leucocytes in vivo au cours de processus physiologiques, a été grandement améliorée par la mise au point sur la base de ro-DTR. Cependant, bien que ces modèles de souris transgéniques ont été largement utilisés pour comprendre l'ontogenèse du système immunitaire, leur application au développement d'un vaccin a été testé à peine. Ici, en combinant grippe génétique inverse et de chimères de moelle osseuse compétitifs basés DTR, nous proposons une méthode pour étudier la cinétique de l'immunité du vaccin ainsi que la fonction individuelle de gènes au cours des réponses immunitaires aux vaccins in vivo. L'application de cette technologie pour l'évaluation préclinique de nouveaux vaccins contre les maladies infectieuses difficiles pourrait aider à rationaliser la conception de vaccins et de tester des vaccins candidats in vivo.
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Protocol
Les expérimentations animales ont été menées selon des protocoles approuvés et en suivant les directives de la loi de protection des animaux allemand. Tout le personnel effectuant des expériences animales programmes de formation passés selon la catégorie B ou C de la Fédération des associations européennes des animaux de laboratoire de sciences.
1. Génération du recombinant vivant atténué vaccins contre la grippe par génétique inverse
REMARQUE: Le protocole détaillé pour la génération de virus grippaux recombinants par génétique inverse a été décrite par des études antérieures 5 et est hors de la portée de ce rapport. En bref, le sauvetage des vaccins antigrippaux adaptés au froid (CAV) se fait dans une enceinte de biosécurité de classe II sous le niveau de biosécurité 2 (BSL2) confinement, et implique des étapes détaillées ci-dessous. Le protocole de transfection et d'infection qui résulte de Martinez-Sobrido et al. 5.
- Générer une grippe adapté au froid réassortivaccin en utilisant comme fond adapté au froid de la souche A / Ann Arbor / 6/60 (H2N2), ainsi que l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase une modification (NA) de A / PR / 8/34 (H1N1) souche ( Figure 1A). La modification dans le gène NA est constitué d'un remplacement à base de PCR d'une séquence conservée dans la tige de la protéine (résidus 65 à 72) par une séquence d'ADNc court codant pour la ovalbumine de poulet (OVA) peptide -derived SIINFEKL (figure 1B). Le peptide est un peptide SIINFEKL immunodominant fortement dans le contexte de la H-2b de classe MHC réponse de souris C57BL / 6 12 I restreints.
- Plate 10 6 cellules par puits 293T dans des plaques à 6 puits en utilisant du milieu DMEM 10% de sérum bovin fœtal (FBS) supplémenté avec 1% de pénicilline / streptomycine (P / E).
- Préparer mélange de transfection plasmidique: Ajouter 1 ug de chacun des plasmides codant ADNc pour PB2, PB1, PA, NP, M, NS de la grippe A / Ann Arbor / 6/60 souche et 1 pg des plasmides codant pour le NA -SIINFEKL etHA de la grippe A / PR / 8/34. Ajoutez préchauffé OptiMEM (15 pi pour un volume final de 100 pl / puits).
- Incuber transfection mélange pendant 30 min à température ambiante.
- Ajouter 100 ul de mélange de transfection / puits et incuber pendant 16 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Changer de support de cellule par DMEM 0,3% de BSA 1% P / E à 33 ° C et 5% de CO 2 pendant 5 heures.
- Ajouter des cellules MDCK permissives 10 6 de la grippe dans du DMSO contenant 1 ug / ml de trypsine de pancréas de bovin traitée avec de la L-1-tosylamide-2-phényléthyl chlorométhyl cétone (TPCK-trypsine). Maintenir les co-cultures 293T-MDCK pour 2 - 3 jours à 33 ° C et 5% de CO 2.
- Recueillir surnageants de MDCK-293T cellules co-cultures et clair par centrifugation à 260 g pendant 5 min.
- Inoculer 9 - 10 jours d'âge œufs de poule embryonnés dans des conditions stériles. Pour ce faire, faire un trou sur le dessus de la coquille comme indiqué par Martinez-Sobrido et al. 5.
- Couvrir l'esprit coquilleh cire fondue en utilisant un coton-tige et incuber les œufs de poule inoculés pendant 3 jours à 33 ° C.
- Récolter le liquide allantoïque des œufs embryonnés infectés: Laver les coquilles d'œufs avec 70% d'éthanol. Ouvrez l'œuf avec une fissure très doucement dans la partie supérieure et retirez la membrane allantoïque utilisant des pinces stériles. Utilisez une pipette de 10 ml de recueillir autant de liquide que possible (6 - 10 ml). Centrifuger à 260 g pendant 10 min à 4 ° C et transférer le fluide allantoïque autorisé à de nouveaux tubes.
Immunité 2. Suivi vaccin spécifique
- Le traçage des cellules dendritiques peptidiques portant (PED)
- Pour la vaccination de la souris, anesthésier les souris avec 5% d'isoflurane dans de l'oxygène à l'aide d'un vaporisateur de précision. Utiliser une pipette de 200 pi d'administrer 50 ul de PBS contenant 10 3 unités formant des plages (pfu) de vaccin exprimant le peptide SIINFEKL par des gouttelettes directement dans les narines de souris.
- Trois jours après la vaccination, euthanizsouris via e anesthésie à l'isoflurane suivies par dislocation cervicale.
- Soulevez la peau de la souris sur la ligne médiane juste en dessous de la cage thoracique avec des pinces et couper une petite incision à travers la peau avec des ciseaux. Du point de l'incision, faire un 3 - 5 cm de long couper à travers la peau vers la tête et la queue, puis deux incisions 2 cm de la ligne médiane latéralement à partir de chaque extrémité. Peler la peau pour révéler les cavités péritonéale et thoraciques. Découpez soigneusement à travers les membranes entourant le péritoine pour exposer le thorax.
- Pour accéder à la médiastin couper le diaphragme et le fond de la nervure de la cage. Trouver et supprimer les 2 ganglions lymphatiques médiastinaux (MLN), légèrement dorsal et latéralement adjacente à la thymus, en dedans à côté de l'artère brachiocéphalique, près de la face ventrale de la trachée.
- Pour récolter les MLNS utilisent pince courbe. Placez la pince sous les ganglions lymphatiques et les tirer doucement. Placez les ganglions lymphatiques dans une plaque à 6 puits contenant 1 ml de DMEM et supprimer tous les connective ou tissu adipeux entourant le noeud.
- Taquiner chaque échantillon à fond avec deux aiguilles 26 G attachés aux seringues de 1 ml. Pour taquiner le ganglion lymphatique, maintenez-la enfoncée avec une aiguille tout en brisant ouverte le ganglion lymphatique avec l'autre aiguille. Lorsque cela est fait correctement, les cellules concentrées éclatement du ganglion sont facilement observables dans les médias. Faire passer tous les matériaux de tissu à travers un filtre en nylon de 70 pm pour obtenir des suspensions de cellules uniques.
- Suspensions de cellules individuelles de centrifugation pour 10 min à 260 xg dans une centrifugeuse réfrigérée. Reprendre le culot cellulaire dans 2 ml de Red Blood Cell Lysing (RBCL) Tampon pour lyser les globules rouges. Laisser lyse se dérouler pendant 3 minutes à température ambiante.
- Neutraliser tampon RBCL par centrifugation et remise en suspension des cellules dans 2 ml de PBS glacé.
- cellules de la plaque en forme de U dans des plaques à 96 puits à une concentration de 10 7 cellules / ml dans un volume final de 100 ul.
- Pour la cytométrie de flux, analyse cellulaires bloc des récepteurs Fc aide1 pg d'anticorps anti-souris CD16 / CD32 par 10 6 cellules pendant 15 min sur de la glace.
- Plaques Centrifugeuse et jetez surnageants par plaque pichenette. Incuber les puits individuels avec la combinaison d'anticorps de surface de choix. Typiquement, pour la détection de cellules dendritiques dans les ganglions lymphatiques, le cocktail d'anticorps doit comprendre: 0,25 ug d'anticorps anti-CD11c, 0,25 ug de CD11b, 0,5 pg de CMH de classe II, 0,25 ug de CD103 et 0,15 pg de CD8a dans un volume final de 100 ul.
- Pour déclenchement négative, ajouter 0,25 pg d'anti-CD3, CD19, NK1.1 ou une lignée cocktail (figure 2A). Stratégies de déclenchement alternatifs ainsi que les protocoles d'indemnisation appropriée de plusieurs colorants fluorescents peuvent être trouvés sur le site Web de l'Genome Project immunologique. En plus des marqueurs de surface de choix, ajouter 1 pg d'un anticorps dirigé contre H-2K b lié à SIINFEKL pour le cocktail. Cet anticorps disponible dans le commerce permet la visualisation des CD in laquelle le peptide SIINFEKL est lié à la surface du CMH de classe I.
- Incuber les cellules avec des anticorps de surface pendant 30 min sur de la glace. Protéger la plaque de la lumière. Plaques centrifuger à 260 g pendant 5 min et de lavage avec 2 ml de PBS deux fois. Transfert cellules pour la cytométrie en flux tubes pour l'analyse.
- L'évaluation d'un vaccin spécifique prolifération des lymphocytes T
- Obtenir des cellules T du donneur de souris disponible dans le commerce TCR transgénique (souris OT-I) (C57BL / 6-Tg (TCR ATCRB) 1100Mjb / J) dans laquelle toutes les cellules T CD8 générées sont spécifiques pour le peptide SIINFEKL. Euthanasier souris par anesthésie à l'isoflurane, suivie par dislocation cervicale. Récolte la rate en effectuant une incision dans la cavité abdominale. Placez la rate / s dans 2 ml de DMEM / rate et enlever le tissu conjonctif et la graisse.
- Générer des suspensions de cellules simples de la rate en suivant la procédure décrite au paragraphe 2.1.2 et 2.1.3.
- Pour enrichir encore la suspension de cellule unique sur les cellules T, appliquer des protocoles de séparation magnétique de perlesen utilisant soit des procédures de sélection 12 positive ou négative. Pour différencier donneur de cellules réceptrices, en utilisant des souris congéniques de sorte que par exemple les souris receveuses CD45.1 expriment le marqueur de leucocytes de donneur alors que les cellules T expriment 12 CD45.2.
- Pour identifier les cellules T, les incuber dans 1 ml de PBS contenant 5 uM de carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) à une densité cellulaire optimale de 5 x 10 6 cellules / ml. Incuber les cellules pendant 20 min à 37 ° C protégées de la lumière. Après incubation, les cellules de centrifugation à 260 g pendant 5 min, surnageant défausse, et remettre les cellules en 3 ml de sérum de veau fœtal (FBS) pour neutraliser CFSE.
- Centrifuger les cellules à 260 xg pendant 10 min et remettre en suspension dans le volume adéquat de PBS sorte que 100 pi d'une solution contenant 2 x 10 6 cellules. Infuser souris congéniques bénéficiaires avec 2 x 10 6 cellules / souris par injection de sinus rétro-orbital 13.
- Euthanasier les souris receveuses aux jours 3, 4 et 5 post-vaccination utilisant anesthésie à l'isoflurane, suivie par dislocation cervicale. Récolter les ganglions lymphatiques médiastinaux et préparer des suspensions de cellules simples de cytométrie en flux comme indiqué dans 2.1.2-2.1.5.
- Identifier les cellules du donneur par coloration des suspensions de cellules simples dans 100 ul d'un cocktail d'anticorps contenant: 0,25 ug d'anti-CD3 de souris, des anticorps CD4 et CD8; 0,5 ug d'anticorps anti-souris CD45.1 ou de CD45.2 anticorps (en fonction du phénotype de cellules du donneur). Laissez le canal FL-1 de la cytomètre en flux ouvert (FITC) pour déterminer le profil de dilution de CFSE 12 (figure 2B).
3. Les souris chimériques de disséquer la réponse vaccinale spécifique d'un gène
REMARQUE: La génération des chimères de moelle osseuse compétitifs en utilisant des modèles de souris à base de DTR permet la discrimination des fonctions spécifiques des cellules pendant la réponse immunitaire aux vaccins. Ici, nous montrons une stratégie supplémentaire par quelle combinaison de DTR exprimant donateurs caunes avec des cellules de souris knock-out permis de d'étudier les fonctions spécifiques de gènes au cours de l'immunité dans des compartiments cellulaires spécifiques. Dans l'exemple que nous générons souris avec suppression spécifique des récepteurs Toll-like 3 (TLR3) dans Langerine + CD103 + DC.
- Préparation de cellules de donneur de moelle osseuse
- Travailler sous une armoire de biosécurité de niveau II. Éviter la contamination en utilisant des instruments exclusivement autoclave.
- Pour générer des souris chimères de moelle osseuse, utiliser CD45.1 congéniques + C57BL / 6 souris femelles comme destinataires, et utiliser TLR3 - / -, Langerine-DTR / EGFP ou souris exprimant wt CD45.2 + en tant que donateurs. En utilisant des souris donneuses et receveuses congéniques permet la différenciation des cellules du donneur et du receveur par cytométrie de flux, ce qui permet la prise de greffe à évaluer.
- Pour obtenir des cellules de moelle osseuse de donneurs, euthanasier souris donneuses avec isoflurane suivie par dislocation cervicale. Avec des ciseaux pointus effectuer des incisions autour des chevilles de sorte que le mmusculature ouse est exposée.
- Utilisation pince émoussée tirer la peau de la souris et de la fourrure doucement de la cheville vers les hanches afin que les muscles des jambes sont visibles.
- Avec des ciseaux pointus couper les jambes de la souris à la hauteur des hanches et au-dessus de la tête du fémur.
- Placez les jambes sur une boîte de Pétri et sur la glace. Travaillez rapidement et de supprimer tous les muscles pour exposer les os.
- Fémurs et tibias séparés. Placez les os dans une solution d'éthanol à 70% pendant 5 min pour éliminer les bactéries possibles et placez-les immédiatement sur une autre boîte de Pétri contenant 5 ml de DMEM sans sérum. Couper l'os se termine avec des ciseaux pointus et rincer la moelle osseuse dans le DMEM. Pour ce faire, rincer 1 ml de DMEM dans l'os par l'insertion d'une aiguille de 26 G fixée à une seringue de 5 ml. Assurez-vous que les os semblent blanches (vide) après le rinçage.
- Recueillir toutes les cellules de la moelle osseuse de souris donneuses dans 10 ml de DMEM. Générer des suspensions monocellulaires de cellules de moelle osseuse en passant la récolte à travers un tamis cellulaire de 70 pm.
- Cloreille suspensions monocellulaires de cellules de la moelle osseuse par centrifugation à 260 xg pendant 10 min à 4 ° C dans une centrifugeuse réfrigérée. Resuspendre le culot cellulaire dans 10 ml de PBS. Épuiser les globules rouges grâce à la solution RBCL comme décrit dans 2.1.3 et 2.1.4.
- Compter les cellules de moelle osseuse en utilisant soit un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisé. Évaluer la viabilité cellulaire par la détermination des cellules mortes par coloration au bleu trypan 13. De façon optimale, une donne des animaux individuels d'environ 3 x 10 7 globules blancs / souris avec une viabilité d'au moins 80%.
- Dans le cas de l'ensemble des chimères de moelle osseuse, de préparer TLR-3 - cellules ou des donateurs de poids - /. La concentration cellulaire optimale est de 2 x 10 7 cellules / ml depuis 2 x 10 6 cellules dans 100 ul de PBS seront utilisés pour la transplantation. Si pas utilisé immédiatement, des cellules donneuses conserver à -80 ° C en utilisant des techniques de congélation lente et FBS à 10% de DMSO. Pour le modèle chimérique mixte, mélanger cellules Langerine-DTR-donateurs et TLR3 - / -
- Irradiation de la souris et de la transplantation
- Irradier les souris femelles entre 6 - 8 semaines d'âge dans une source d'irradiation au césium-137. Donnez souris deux doses de 550 rad 4 heures d'intervalle. Irradiation de Split minimise la toxicité hépatique aiguë et réduit donc la létalité de la souris en raison du protocole d'irradiation.
- Après irradiation, garder souris sous traitement avec des antibiotiques pour deux semaines. Donner des antibiotiques avec l'eau potable à 2,5 à 5 mg de Baytril / kg.
- 2 - 4 h après la seconde irradiation, les souris transplantés avec des cellules de moelle osseuse du donneur par voie intraveineuse. Effectuer l'injection de cellules du donneur par injection du sinus rétro-orbital sous 13 anesthésie à l'isoflurane et un volume maximum à l'aide de 100 ul de PBS contenant 2 x 10 6 cellules.
- Quatre semaines après la transplantation, évaluer la prise de greffe dans un échantillon de 100ul de sang périphérique par cytométrie de flux en utilisant une machine capable de lire au moins deux couleurs. Pour faire la distinction entre le donneur et les cellules receveuses de radio-résistant, disponible dans le commerce en utilisant CD45.1 marqué par fluorescence et des anticorps anti-souris CD45.2 à l'aide de dilutions entre 1/100 et 1/200. La prise de greffe optimale des cellules du donneur doit être d'au moins 80% du total des cellules hématopoïétiques dans le sang périphérique.
- Vaccination ciblée et l'épuisement
- Vacciner les souris avec le vaccin antigrippal vivant atténué recombinant par voie intranasale. Pour la vaccination de la souris, anesthésier les souris avec 5% d'isoflurane dans de l'oxygène à l'aide d'un vaporisateur de précision. Utiliser une pipette de 200 pi d'administrer 50 ul de PBS contenant 10 3 unités formant des plages (pfu) de vaccin.
- Pour générer le modèle final de la souris, le traitement des souris avec 50 ng de DT dilué dans 50 ul de PBS par voie intranasale. Administrer DT goutte à goutte directement aux narines de souris anesthésiées comme indiqué en 3.3.1. mi TraiterCE avec des doses quotidiennes à partir de traitement au jour -2 avant la vaccination jusqu'au jour 2 post-vaccination (figure 3B).
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Representative Results
La génération de vaccins contre la grippe vivant atténué recombinant peut être obtenu par transfection de plasmides codant pour les huit segments du virus de la grippe sous le contrôle de promoteurs bidirectionnels 5. Un vaccin contre la grippe adapté au froid contient généralement six segments d'une souche adaptée au froid, ainsi que le HA et NA de la souche de grippe de choix (par exemple, H1N1) (Figure 1A). Le principe de l'adaptation au froid est basée sur la replication du virus restriction à 33 ° C, la température du tractus respiratoire supérieur (TRS) chez les souris et les humains 14. Par conséquent, le vaccin peut se répliquer dans une certaine mesure dans l'URT, mais ne peut causer une pneumonie de l'appareil respiratoire inférieur. En utilisant la technologie PCR de fusion, une région conservée dans la tige de la neuraminidase virale (NA) a été remplacé par un peptide OVA-traçable dérivé (SIINFEKL) (figure 1B).
Pour suivre les réponses spécifiques à la vaccination dans les études de cinétique, nous avons profité de peptides dérivés de traçables la formulation de vaccin, ainsi que des modèles de souris chimériques. Entre 3 et 6 jours après la vaccination, SIINFEKL portant CD103 + DC peut être détectée dans la lymphe du poumon-les ganglions 12 (figure 2A). Cytométrie de flux multiparamétrique permet la quantification de vaccin dérivé présentation de l'antigène en temps réel. De plus, la perfusion de cellules T spécifiques de SIINFEKL permet la quantification des réponses de lymphocytes T CD8 spécifiques aux vaccins (Figure 2B).
Pour évaluer les fonctions spécifiques de gènes lors de la vaccination, nous avons conçu un modèle de souris combinant la technologie DTR et chimères de moelle osseuse compétitifs (figure 3A). En procédant ainsi, la perte de la fonction du gène a été ciblé vers des compartiments cellulaires spécifiques au cours de la réponse immunitaire à la vaccination (Figure 3B, C).
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Figure 1. Construction de LAIVs traçables. (A) des segments grippe clonés dans des plasmides d'ambisens (de squelette PDZ comme décrit par Martinez-Sobrido et al. 5) ont été transfectées dans des cellules 293T en utilisant la Lipofectamine 2000. 24 h après la transfection, les surnageants obtenus à partir de cellules 293T les cellules ont été utilisées pour l'influenza permissive manteau Madin-Darby canine rein (MDCK) en présence de 1% de trypsine TPCK. Tout le protocole a été effectuée à 33 ° C. Les surnageants viraux à partir de cellules MDCK ont ensuite été inoculées dans neuf jours d'âge des œufs de poule embryonnés pendant trois jours à 33 ° C. Sauvetage viral a été confirmée par amplification du génome viral par PCR et séquençage. (B) pour insérer le SIINFEKL peptide OVA-dérivé dans la grippe neuraminidase (NA), une région conservée (résidus 65 à 72) du gène NA de A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) a été remplacé par une courte ADNc codant pour le peptide SIINFEKL par fusionPCR. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Vaccin techniques de traçage. (A) PED migrateurs ont été bloqués dans les ganglions lymphatiques médiastinaux (MLN) que CD11c med CMH de classe II cellules hi. Dans l'exemple, l'antigène CD103 portant migratoire + DC ont été identifié comme étant CD103 + H-2 b + -SIINFEKL cellules par cytométrie en flux. (B) des cellules T OT-I-spécifiques ont été perfusées à des souris le jour même de la vaccination. Quatre jours après, les cellules ont été recueillies à partir des ganglions lymphatiques de souris vaccinées et évalués quant à leur profil de prolifération. CFSE dilution sur le canal FL-1 a été utilisé comme indicateur de la division cellulaire. CAV: vaccin adapté au froid; CAV SIINFEKL :. Vaccin adapté au froid exprimant OVA-peptide dérivé SIINFEKL S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. études de la fonction des gènes. (A) Schéma de chimères de moelle osseuse (BMC) et des stratégies de vaccination. (-2 Et +2 réfèrent à l'administration de DT deux jours avant ou après la vaccination). (B) Ajout de DT chez les souris chimériques exprimant la Langerine-DTR permet appauvrissement spécifique de migration Langerine + PED coexprimant CD103 dans le poumon. (C) comparée l'analyse des cellules T spécifiques de la vaccination chez les souris chimériques. Détection de cellules NP 366-374 de spécifique de T CD8 a été fait par coloration de dextramer commerciale.803fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Dans cette étude, nous décrivons comment la génétique et des modèles de souris chimériques inverse peut être utilisé pour élucider les mécanismes physiologiques et moléculaires de l'immunité induite par le vaccin. La génétique de la grippe inverse est établi dans de nombreux laboratoires et a joué un rôle principal dans la compréhension de la grippe pathogenèse, la réplication et la transmission 17. Un point clé dans notre protocole est le sauvetage des vaccins antigrippaux adaptés au froid exprimant des épitopes étrangers. Bien que la stratégie d'introduction d'ADNc courts dans la tige de la neuraminidase a été décrite par de nombreux groupes, l'investigateur doit veiller à ce qu'aucune des mutations supplémentaires sont introduites au cours de la production de vaccins dans les œufs et que le vaccin est capable de se répliquer dans les voies respiratoires sans induire pneumonie 5,12. Étant donné que la tige de la neuraminidase virale ainsi que d'autres régions du génome de la grippe, tels que le segment de gène NS et le segment PB1 permettre allocation de séquences étrangères 19,20, modifications de notre protocole peut être utilisé pour ajouter des peptides étrangers supplémentaires pour, par exemple, comprendre les hiérarchies de la réponse immunitaire des lymphocytes T contre le virus de la grippe, un point clé pour la conception rationnelle de vaccins.
En combinant les vaccins traçables et l'épuisement des sous-ensembles DC base-DTR nous avons été en mesure de cibler la perte de la fonction du gène de sous-ensembles de cellules spécifiques. Cette technologie a été appliquée avant d'élucider la réponse immunitaire à des agents pathogènes 21, mais pas à disséquer les voies responsables de la protection du vaccin. En raison de la disponibilité des modèles à base de DTR et la flexibilité de la technique pour générer des souris chimériques, cette technique pourrait être étendu à d'autres populations de leucocytes et des gènes ayant des fonctions immunitaires. Il est important de noter que le traitement DT peut aussi entraîner une diminution des sous-ensembles supplémentaires DC exprimant la Langerine + CD8a tels que les CD dans les tissus lymphoïdes. Par conséquent, il est fortement recommandé de perform une étude dose-réponse pour évaluer les effets du traitement DT. Une mise en garde potentiel de notre modèle est que la greffe de moelle osseuse allogénique a été montrée pour diminuer antivirale globale T CD8 immunité cellulaire 15. Ainsi, la prudence doit être exercée lorsque l'on compare les données entre les souris transplantées et non transplantés.
Plusieurs agents pathogènes humains clés pour lesquelles des vaccins sont nécessaires de toute urgence peuvent être étudiés dans des modèles de souris en utilisant des agents pathogènes de type sauvage ou de substituts de souris. Ceux-ci comprennent le virus de l'influenza, Plasmodium et le virus Ebola. Les techniques proposées dans cette étude peuvent aider à comprendre le mécanisme de base de vaccins expérimentaux contre ces agents pathogènes et, par conséquent, de rationaliser la conception du vaccin.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1x) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| OptiMEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10x | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
References
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